尤式備，徐佳慧，郭怡文，廖芳蕾，楊莉，陳文榮，郭衛(wèi)東

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321004）

藍(lán)莓（Vaccinium spp.），又稱為越橘，是杜鵑花科越橘屬植物，是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的果樹。近幾年，我國(guó)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，但由于藍(lán)莓根系不發(fā)達(dá)，根毛缺失，使得對(duì)栽培基質(zhì)的要求苛刻[1]，因而在一定程度上限制了藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。根毛在植物水分及礦質(zhì)元素吸收等生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，絕大多數(shù)植物均具根毛，但越橘屬（Vaccinium）和松屬（Pinus）等少數(shù)植物類群的根細(xì)胞沒有根毛特化[2]。即使在有根毛分化的植物根系中，并非所有根表皮細(xì)胞均能特化為根毛細(xì)胞，仍有大量細(xì)胞無(wú)根毛狀特化。由生毛細(xì)胞（trichoblast）發(fā)育形成的根毛細(xì)胞被稱為H型細(xì)胞，而由非生毛細(xì)胞（atrichoblast）發(fā)育形成的無(wú)根毛細(xì)胞被稱為N型細(xì)胞[3]。在擬南芥中，根表皮細(xì)胞向H型或N 型細(xì)胞發(fā)育的命運(yùn)主要受6 個(gè)關(guān)鍵基因調(diào)控，其中：TRANSPARENT TESTA GLABRA（TTG）、WEREWOLF（WER）、GLABRA2（GL2）的表達(dá)產(chǎn)物能形成介導(dǎo)N 型細(xì)胞發(fā)育的激活態(tài)復(fù)合物，抑制根毛產(chǎn)生，而CAPRICE（CPC）、TRIPTYCHON（TRY）、TRY 和CPC1 增 強(qiáng) 子（ENHANCER OF TRY AND CPC1,ETC1）編碼的R3 MYB類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子則通過側(cè)向抑制的方式干擾和阻止TTG、WER、GL2 等N 型細(xì)胞命運(yùn)正調(diào)控因子的聚合與活化，從而誘導(dǎo)相鄰細(xì)胞根毛的形成[4]。過去主要采用以擬南芥為主的模式植物進(jìn)行根毛發(fā)生機(jī)制的研究，而對(duì)于藍(lán)莓等自然狀態(tài)下不具根毛的植物卻未見其根毛缺失機(jī)制的報(bào)道。

由于藍(lán)莓根表面不存在根毛，其養(yǎng)分吸收主要依賴于與藍(lán)莓共生的菌根真菌[5]，故菌根的形成對(duì)藍(lán)莓生長(zhǎng)至關(guān)重要。其中，藍(lán)莓根系形成的菌根大多屬于杜鵑花類菌根（ericoid mycorrhizas, ERM），為內(nèi)生菌根的一種。目前，已先后鑒定出隸屬于子囊菌綱（Ascomycetes）、擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）和絲孢綱（Hyphomycetes）的ERM 真菌[6]，但均未進(jìn)行系統(tǒng)的調(diào)查和詳細(xì)的分類，且關(guān)于藍(lán)莓ERM真菌的報(bào)道相對(duì)較少。

藍(lán)莓ERM的存在具有普遍性，幾乎所有的野生藍(lán)莓都會(huì)在自然條件下形成菌根，但人工栽培的藍(lán)莓菌根相對(duì)較少[1]。研究表明，接種ERM真菌可以提高藍(lán)莓根系生物量及株高[7]，且對(duì)不同藍(lán)莓品種產(chǎn)生不同的影響[8]。READ等研究表明，在蔓越莓上接種ERM 真菌能顯著提高植株各生育期總氮（N）含量，其原因可能是ERM對(duì)土壤有機(jī)氮的礦化使土壤銨態(tài)氮含量提升，同時(shí)，ERM 也可能提高了植株對(duì)銨態(tài)氮的吸收效率[9]。此外，有報(bào)道顯示，ERM對(duì)宿主植株磷（P）營(yíng)養(yǎng)的吸收具有促進(jìn)作用，且其能向菌體胞內(nèi)和胞外分泌磷酸酯酶[10]。這暗示ERM對(duì)土壤P元素的活化可能是其促進(jìn)杜鵑花科植物生長(zhǎng)的重要機(jī)制。目前，雖然關(guān)于ERM真菌對(duì)宿主植物促生機(jī)制的研究已有一些報(bào)道，但關(guān)于藍(lán)莓ERM的促生機(jī)制尚不清晰，亟待進(jìn)一步明確。

本研究以‘布里吉塔’藍(lán)莓根系為材料，對(duì)6 個(gè)根毛發(fā)生關(guān)鍵基因（TTG、WER、GL2、CPC、TRY、ETC1）進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)根毛形成相關(guān)關(guān)鍵基因表達(dá)量進(jìn)行半定量分析，以探究藍(lán)莓根毛缺失機(jī)制；同時(shí)，從5年生‘奧尼爾’和‘夏普藍(lán)’藍(lán)莓根系中分離并純化了12株藍(lán)莓內(nèi)生菌根真菌，并在‘海岸’藍(lán)莓苗上進(jìn)行接種，通過比較不同有益內(nèi)生菌接種處理對(duì)藍(lán)莓根系活力、基質(zhì)理化指標(biāo)及葉片大量營(yíng)養(yǎng)元素含量的影響，以期進(jìn)一步探究有益內(nèi)生菌接種對(duì)藍(lán)莓生長(zhǎng)的影響及相關(guān)促生機(jī)制，為藍(lán)莓的現(xiàn)代化生產(chǎn)栽培提供理論基礎(chǔ)及新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

在浙江師范大學(xué)特色經(jīng)濟(jì)植物生物技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的大田基地內(nèi)，采集長(zhǎng)勢(shì)一致且健康的南高叢藍(lán)莓‘夏普藍(lán)’（‘Sharpblue’）和‘奧尼爾’（‘O’Neal’）5 年生苗、北高叢藍(lán)莓‘布里吉塔’（‘Brigitta’）2 年 生 苗 及 南 高 叢 藍(lán) 莓‘海 岸’（‘Gulfcoast’）無(wú)菌組培苗。其中：‘夏普藍(lán)’和‘奧尼爾’藍(lán)莓用于分離藍(lán)莓內(nèi)生菌；‘海岸’藍(lán)莓用于已分離內(nèi)生菌的回接試驗(yàn)；‘布里吉塔’藍(lán)莓根系用于基因組擴(kuò)增的總DNA 及cDNA 反轉(zhuǎn)錄的RNA提取。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓根系總DNA 的提取及根毛發(fā)生相關(guān)基因的擴(kuò)增

參照改良的十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide,CTAB）法[11]提取‘布里吉塔’藍(lán)莓根系基因組DNA，隨后用NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)測(cè)定樣品在260 和280 nm 處的吸光度值，以檢驗(yàn)提取的DNA濃度及純度。

從藍(lán)莓轉(zhuǎn)錄組庫(kù)（https://www.vaccinium.org）中獲得根毛發(fā)生相關(guān)基因序列，并在NCBI 基因庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中驗(yàn)證后設(shè)計(jì)相關(guān)引物（表1）。以藍(lán)莓根系DNA為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）體系如下：10×緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各1 μL，Ex Taq酶0.5 μL，DNA模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)足體積至25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，在不同退火溫度（根據(jù)引物設(shè)定，表1）下退火60 s，72 ℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃充分延伸10 min，于10 ℃條件下保存。取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物各5 μL，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 藍(lán)莓根系總RNA 的提取與cDNA 的合成及根毛發(fā)生相關(guān)基因的克隆

采用張彥蘋等[12]改良的十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）法提取‘布里吉塔’藍(lán)莓根系總RNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA提取質(zhì)量及用NanoDrop 2000C 超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品濃度后，取5 μL，按照PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）說(shuō)明書進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA第1鏈于－20 ℃條件下保存。

以‘布里吉塔’藍(lán)莓根系cDNA 為模板，用PrimeSTAR HS DNA 聚合酶及上下游引物構(gòu)建PCR 體系并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃變性30 s，在不同退火溫度（根據(jù)引物設(shè)定，表1）下退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃充分延伸10 min，于10 ℃條件下保存。加A尾后的目的片段用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并割膠回收特異性擴(kuò)增的目的片段。將目的片段連接至pMD19-T載體上，然后轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α內(nèi)，經(jīng)過篩選后得到的含重組質(zhì)粒的大腸埃希菌DH5α 送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)的根毛發(fā)生相關(guān)基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 藍(lán)莓根系內(nèi)生菌的分離純化及鑒定

內(nèi)生菌的分離純化：截取‘夏普藍(lán)’和‘奧尼爾’藍(lán)莓的幼嫩根系，用75%乙醇溶液及10%次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒后，將其剪成0.3～0.5 cm的較小根段，并接至馬丁培養(yǎng)基中，于28 ℃條件下避光培養(yǎng)1 周左右。采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基進(jìn)行純化，直至形成純培養(yǎng)，于4 ℃條件下保存。

菌種分子生物學(xué)鑒定：參考WALKER 等的方法[13]，用CTAB 法提取真菌DNA，其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer, ITS）序列用通用引物ITS1 和ITS4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將有條帶的樣品送往英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序，將結(jié)果在NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行BLAST 比對(duì)后，選取相似程度最高的真菌序列，使用MEGA 7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining,NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定其真菌種類。

1.2.4 內(nèi)生菌回接藍(lán)莓試驗(yàn)

在接種前20 d，將‘海岸’藍(lán)莓無(wú)菌組培苗用清水清洗后，隨機(jī)分組并栽種于無(wú)菌的椰糠栽培基質(zhì)中，在25 ℃環(huán)境下適應(yīng)20 d。隨后，采用5 mm打孔器在內(nèi)生菌菌落邊緣打孔，獲取新鮮菌絲塊，將其接種于各處理組藍(lán)莓苗根系附近，每株接種2塊。對(duì)照組接種無(wú)菌的PDA培養(yǎng)基。每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種3株，共9株。處理后，將組培苗置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，晝/夜溫度為25/20 ℃，每天光照14 h，光照強(qiáng)度為1 000 lx，相對(duì)濕度控制在70%～75%之間。

1.2.5 藍(lán)莓株高的測(cè)定及促生內(nèi)生真菌的篩選

分別在接種0、30、60、90 d 后用刻度尺測(cè)量各組藍(lán)莓株高，并對(duì)90 d時(shí)各組藍(lán)莓株高增量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，然后結(jié)合不同處理組的藍(lán)莓生長(zhǎng)狀況篩選具有顯著促生作用的內(nèi)生真菌。

1.2.6 根系內(nèi)生菌的侵染觀察

采用臺(tái)盼藍(lán)染色法[14]對(duì)根系進(jìn)行染色，取染色后的根系先端末級(jí)分枝上2 cm 長(zhǎng)根段制片，每10個(gè)根段為一個(gè)裝片，每組處理通過正置熒光顯微鏡（德國(guó)卡爾蔡司公司）觀察有益內(nèi)生菌的侵染特征并拍照記錄。根系侵染率=真菌侵染的根段數(shù)/鏡檢根段總數(shù)×100%。

1.2.7 根系活力測(cè)定

用氯化三苯基四氮唑（2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）還原法測(cè)定根系活力。從根系中提取的三苯基甲臜（triphenyltetrazolium formazan,TTF）在485 nm波長(zhǎng)處用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行比色。TTC 還原強(qiáng)度/(μg/(g·h))=TTC 還原量/μg÷（根質(zhì)量/g×t/h）。

1.2.8 根際栽培基質(zhì)的氮磷含量測(cè)定

通過抖土法收集各組藍(lán)莓根際椰糠栽培基質(zhì)，在室內(nèi)自然風(fēng)干并研磨成粉，用于理化指標(biāo)測(cè)定。椰糠栽培基質(zhì)的pH用電位法[15]測(cè)定，銨態(tài)氮含量用納氏比色法[16]測(cè)定，速效磷含量用鉬銻抗比色法[15]測(cè)定。

1.2.9 葉片總氮磷含量測(cè)定

分別收集各組藍(lán)莓葉片，經(jīng)洗滌、烘干、研磨后用H2SO4-H2O2消煮法進(jìn)行消煮，隨后稀釋定容至50 mL。采用納氏比色法[17]測(cè)定藍(lán)莓葉片總N含量，采用鉬銻抗比色法[16]測(cè)定葉片總P含量。

1.2.10 真菌分泌物維生素B2的定性測(cè)定

按照吳靜萍等[18]測(cè)定維生素B2的方法，將有益內(nèi)生菌分別接種至不含B 族維生素的無(wú)菌Murashige & Skoog（MS）培養(yǎng)基中，于100 r/min、28 ℃條件下避光振蕩培養(yǎng)5 d。將菌根真菌液體純培養(yǎng)物用4層紗布過濾，收集濾液，并刮取紗布上層的菌絲體，經(jīng)超聲波破碎3 min 后，加入適量稀硫酸，于沸水浴中抽提30 min，冷卻后過濾制成菌絲體抽提液。分別將真菌培養(yǎng)液和菌絲體抽提液的pH調(diào)至7.0，并以10 nm為狹縫寬度，在435 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描，并繪制熒光發(fā)射光譜。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并用SPSS 24.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way analysis of variance, one-way ANOVA）及最小顯著差數(shù)法（least significant difference,LSD）檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組擴(kuò)增結(jié)果

如圖1A 所示：在電泳圖上能清晰地觀察到從藍(lán)莓根系基因組中擴(kuò)增的根毛發(fā)育相關(guān)基因CPC、ETC1、TRY、WER、TTG和GL2的亮帶，說(shuō)明上述6個(gè)基因在藍(lán)莓基因組中都存在，其引物設(shè)計(jì)正確。

2.2 藍(lán)莓根系cDNA 的克隆結(jié)果

以藍(lán)莓根系cDNA 為模板，通過PCR 擴(kuò)增得到WER、TTG 和GL2 的cDNA 序列，測(cè)序結(jié)果表明，其長(zhǎng)度分別為648、1 017 和1 625 bp；但未能檢測(cè)到CPC、ETC1和TRY的表達(dá)（圖1B）。

2.3 菌種鑒定結(jié)果

圖1 藍(lán)莓根毛發(fā)生相關(guān)基因擴(kuò)增（A）及cDNA 克隆（B）電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of blueberry root hair development related genes (A) and their cDNA clones(B)

分離得到的12株菌根真菌的形態(tài)學(xué)特征如圖2所示：菌落顏色以白色和灰白色為主；表面形態(tài)大多為氈狀或絮狀；菌落邊緣除個(gè)別呈放射狀外，大多規(guī)則平整；個(gè)別菌株能分泌綠色、黃色等色素。

經(jīng)分子生物學(xué)分析，從‘奧尼爾’藍(lán)莓中分離并鑒定出3株真菌，從‘夏普藍(lán)’藍(lán)莓中分離并鑒定出9株真菌。其中：11株真菌為子囊菌，1株真菌為未知菌。

從系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）上可以看到，分離得到的12個(gè)菌株在NJ樹上聚為4大類，其中：X5單獨(dú)聚為一大類，與其他菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分類地位尚不明確；X10 單獨(dú)聚為一大類，與未分類真菌（GenBank登錄號(hào)：KC202937.1）親緣關(guān)系最近；X6、A2、X11、X2聚為一大類；A1、A4、X17、X24、X22、X28聚為另一大類。從圖3 還可以看出：A4、X17、X22、X28 與鐮刀菌屬（Fusarium）各個(gè)真菌種的親緣關(guān)系最近；A1與踝節(jié)菌屬（Talaromyces）真菌的親緣關(guān)系最近；X24 與赤霉屬（Gibberella）真菌的親緣關(guān)系最為接近；X2、A2、X6 在親緣關(guān)系上分別最接近于青霉屬（Penicillium）各個(gè)種；而X11 與曲霉屬（Aspergillus）真菌的親緣關(guān)系最近。

2.4 菌根真菌對(duì)藍(lán)莓株高增長(zhǎng)的影響及有益菌的篩選結(jié)果

在1年生‘海岸’藍(lán)莓上接種從不同藍(lán)莓（‘奧尼爾’和‘夏普藍(lán)’）中分離的菌根真菌90 d后，處理組藍(lán)莓的平均株高增長(zhǎng)量與對(duì)照相比總體呈上升趨勢(shì)（圖4）。其中，A1、A4、X2、X22 接種組的藍(lán)莓平均株高增長(zhǎng)量較對(duì)照組顯著增加，分別提高了105.01%、80.58%、55.24%和46.43%。

2.5 不同有益內(nèi)生菌接種的根系侵染特征及其對(duì)根系活力和根際基質(zhì)pH 的影響

鏡檢分析顯示，被真菌侵染的藍(lán)莓根細(xì)胞內(nèi)存在菌根結(jié)構(gòu)，一種是形成胞內(nèi)菌絲團(tuán)或菌絲圈（圖5A～B），另一種是貫穿于細(xì)胞間隙的菌絲（圖5C），均屬于典型的內(nèi)生菌根結(jié)構(gòu)。在表皮細(xì)胞與皮層細(xì)胞間隙間的菌絲有的縱向貫穿于根細(xì)胞間，有的橫向侵入細(xì)胞或沿細(xì)胞間隙延伸，整體構(gòu)成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀（圖5D）。對(duì)藍(lán)莓的根系活力測(cè)定結(jié)果顯示，內(nèi)生真菌A1、A4、X2、X22 不同程度地提高了‘海岸’藍(lán)莓的根系活力，相比對(duì)照分別提升了92.52%、43.92%、4.17%、100.33%；對(duì)根際pH測(cè)量結(jié)果表明，除A1以外，接種真菌A4、X2、X22均顯著降低了根際基質(zhì)pH，表明A4、X2、X22能夠酸化根際；此外，4 種真菌對(duì)‘海岸’藍(lán)莓的侵染率介于45%～61%之間，極顯著高于對(duì)照組（表2）。

2.6 有益內(nèi)生菌對(duì)藍(lán)莓根際速效養(yǎng)分及葉片總氮磷含量的影響

有益內(nèi)生菌接種對(duì)根際栽培基質(zhì)銨態(tài)氮及速效磷含量的影響如圖6所示：接種A1和X22極顯著提高了藍(lán)莓根際栽培基質(zhì)中銨態(tài)氮含量，與對(duì)照相比銨態(tài)氮含量分別升高51.50%和31.41%；接種A1和X2 顯著降低了藍(lán)莓根際栽培基質(zhì)中速效磷含量，而接種A4和X22后藍(lán)莓根際栽培基質(zhì)中速效磷含量與對(duì)照無(wú)明顯差異。由圖6 還可以看出：與對(duì)照相比，接種A1、A4、X2 和X22 不同程度地提高了藍(lán)莓葉片總氮含量，增幅分別為6.68%、22.90%、11.78%和1.18%，其中，A4 處理組藍(lán)莓葉片總氮含量顯著增加；葉片總磷含量在接種A1 和X2 后均無(wú)顯著差異，而接種A4和X22后顯著和極顯著地提高了藍(lán)莓葉片的總磷含量。

圖2 藍(lán)莓內(nèi)生菌根真菌的形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Morphological characteristics of endophytic mycorrhizal fungi in blueberry

圖3 基于NJ法的藍(lán)莓內(nèi)生菌根真菌的系統(tǒng)聚類分析Fig.3 Systematic cluster analysis of endophytic mycorrhizal fungi in blueberry based on NJ method

圖4 藍(lán)莓內(nèi)生菌根真菌回接對(duì)藍(lán)莓株高增長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of inoculation of endophytic mycorrhizal fungi isolated from blueberry on increment of blueberry plant height

2.7 有益內(nèi)生菌分泌物維生素B2的定性分析

熒光定性分析顯示：促生內(nèi)生菌X22 培養(yǎng)液（圖7A）及菌絲體抽提液（圖7B）在波長(zhǎng)為435 nm激發(fā)光激發(fā)下，均在525 nm 處形成熒光發(fā)射峰，該峰與維生素B2在相同激發(fā)光激發(fā)下形成的發(fā)射峰處于相同位置，表明X22培養(yǎng)液及菌絲體抽提液中有維生素B2的存在，即X22能向外分泌維生素B2且自身含有該物質(zhì)。而在A1、A4、X2培養(yǎng)液和菌絲體抽提液中均未檢測(cè)到維生素B2，表明這3 株菌無(wú)維生素B2分泌能力。

3 討論

對(duì)擬南芥的研究顯示，關(guān)鍵基因WER、TTG、GL2 對(duì)根毛發(fā)生起負(fù)調(diào)控作用，相關(guān)表達(dá)產(chǎn)物抑制根毛形成[19]。對(duì)于其調(diào)控根毛發(fā)生的機(jī)制，有報(bào)道指出，WER 和TTG 等調(diào)控因子形成的復(fù)合體能激活GL2[20]，而GL2 直接決定了植物根表皮細(xì)胞分化命運(yùn)，并誘導(dǎo)根表皮細(xì)胞向N型細(xì)胞發(fā)展[21]。CPC、TRY、ETC1 為根毛發(fā)生正向調(diào)控基因，其表達(dá)產(chǎn)生的R3 MYB類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子具有誘導(dǎo)根毛發(fā)生的作用，但這種誘導(dǎo)僅作用于相鄰細(xì)胞[22]，其誘導(dǎo)機(jī)制被認(rèn)為是CPC、TRY、ETC1 通過側(cè)向運(yùn)輸干擾相鄰表皮細(xì)胞中TTG、WER 等形成激活態(tài)復(fù)合物，進(jìn)而抑制GL2 表達(dá)，使表皮細(xì)胞特化形成根毛[23]。本研究結(jié)果顯示，6 個(gè)根毛發(fā)生關(guān)鍵基因WER、TTG、GL2、CPC、TRY、ETC1均存在于藍(lán)莓根細(xì)胞基因組中，其中負(fù)調(diào)控基因WER、TTG、GL2 有明顯轉(zhuǎn)錄，但未見根毛發(fā)生的正調(diào)控基因CPC、TRY、ETC1的表達(dá)，表明藍(lán)莓根毛缺失與上述6個(gè)根毛發(fā)生的關(guān)鍵基因相關(guān)。本研究首次利用自然狀態(tài)下無(wú)根毛分化物種的正?；颦h(huán)境進(jìn)行根毛發(fā)生機(jī)制研究，避免了以單向敲除基因的突變體為材料所存在的觸發(fā)未知旁路調(diào)控機(jī)制的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了關(guān)鍵基因在根毛發(fā)生中的作用。

圖5 根系內(nèi)生菌根真菌侵染形態(tài)Fig.5 Infection morphology of root endophytic mycorrhizal fungi

表2 接種不同有益內(nèi)生菌對(duì)根系活力及根際pH的影響Table 2 Effects of inoculation of different beneficial endophytic mycorrhizal fungi on root activity and rhizosphere pH

圖6 接種促生內(nèi)生菌根真菌對(duì)根際速效養(yǎng)分及葉片總氮磷含量的影響Fig.6 Effects of beneficial endophytic mycorrhizal fungi inoculation on available nutrients in rhizosphere and total nitrogen and total phosphorus contents of leaves

圖7 促生內(nèi)生菌根真菌培養(yǎng)液（A）及菌絲體抽提液（B）中核黃素的熒光定性分析Fig.7 Qualitative fluorescence analysis of vitamin B2 (VB2) in culture medium (A) and mycelium extract (B) of beneficial endophytic mycorrhizal fungi

越橘屬、松屬植物根表皮細(xì)胞的發(fā)育均遵循N型細(xì)胞命運(yùn)而不受分布位置影響，鑒于越橘屬、松屬植物為木本植物，故其根毛缺失可能存在外皮層相關(guān)機(jī)制：根外皮層木質(zhì)化過程早于根表皮細(xì)胞分化，從而使外皮層的部分木質(zhì)化弱化了根表皮細(xì)胞與其覆蓋的外皮層細(xì)胞的接觸與細(xì)胞通訊，使得CPC、TRY、ETC1無(wú)法表達(dá)，最終致其根毛不發(fā)生。

藍(lán)莓根毛的缺失使其對(duì)菌根具有較高的依賴性，自然狀態(tài)下通常與特定真菌形成ERM真菌。本研究從‘奧尼爾’和‘夏普藍(lán)’根系中共分離并鑒定了12 個(gè)菌株，其中除X5 和X10 的分類地位尚不清楚外，4株為鐮刀菌屬真菌，3株為青霉屬真菌，1株為踝節(jié)菌屬真菌，1 株為赤霉屬真菌，1 株為曲霉屬真菌。類似的研究也從不同藍(lán)莓品種中分離得到曲霉屬、鐮刀菌屬[24]和青霉屬[6]ERM 真菌。在本研究中，鐮刀菌屬真菌A4和X22、踝節(jié)菌屬真菌A1及青霉屬真菌X2 接種的藍(lán)莓株高增長(zhǎng)量顯著提高，且上述4 種真菌對(duì)‘海岸’藍(lán)莓根系的侵染率均在45%以上，可以初步判斷A1、A4、X2 及X22 能促進(jìn)植株生長(zhǎng)。對(duì)菌根形態(tài)的顯微觀察表明，這4 種內(nèi)生真菌與藍(lán)莓根系形成緊密的菌絲圈，為ERM的典型結(jié)構(gòu)[25]。同樣，促生內(nèi)生菌根真菌對(duì)藍(lán)莓的促進(jìn)作用與類似研究的結(jié)果[26]相似。

根系活力綜合反映了根系養(yǎng)分吸收和物質(zhì)合成能力，同時(shí)，藍(lán)莓根系發(fā)育狀況及藍(lán)莓對(duì)菌根的依賴性與根系活力密切相關(guān)[27]。本研究中，4 種藍(lán)莓內(nèi)生菌根真菌接種不同程度地提高了‘海岸’藍(lán)莓根系活力，其中A1、A4 及X22 接種效果顯著，表明有益菌定殖后形成的ERM 真菌改善了藍(lán)莓根系的生長(zhǎng)狀況。

根際pH 環(huán)境與植物生長(zhǎng)關(guān)系密切，根際pH 的改變將引起土壤礦物元素有效性、植物的養(yǎng)分吸收效率及土壤結(jié)構(gòu)的改變[28]。研究表明，土壤pH的降低能促進(jìn)藍(lán)莓的養(yǎng)分吸收，同時(shí)能提高藍(lán)莓根系代謝活力，甚至上調(diào)養(yǎng)分吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因表達(dá)[29]。除A1接種的‘海岸’藍(lán)莓根際pH與對(duì)照差異不大以外，A4、X2和X22接種均降低了藍(lán)莓根際pH（P＜0.05），說(shuō)明A4、X2 和X22 與‘海岸’藍(lán)莓根系形成的ERM 真菌可能具有酸化根際環(huán)境的作用。ERM真菌對(duì)根際pH的降低或?yàn)楦纳扑{(lán)莓生長(zhǎng)狀況的重要原因之一。

氮、磷作為必需大量營(yíng)養(yǎng)元素，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。藍(lán)莓對(duì)于銨態(tài)氮具有偏好性，在3.5～7.5 的pH 區(qū)間，銨態(tài)氮源相比硝態(tài)氮源更利于藍(lán)莓生長(zhǎng)及其養(yǎng)分吸收[30]。對(duì)蔓越莓的研究表明，ERM真菌接種提高了各生育期營(yíng)養(yǎng)器官中的氮含量[8]。本研究中，促生ERM真菌接種不同程度地提高了‘海岸’藍(lán)莓葉片氮含量，且A4 接種處理效果顯著。這與已有的關(guān)于ERM 真菌提高藍(lán)莓植株N 水平的報(bào)道[6]相一致。同時(shí)，A1 和X22 接種處理使‘海岸’藍(lán)莓根際栽培基質(zhì)中銨態(tài)氮含量明顯上升（P＜0.01），可能的原因是ERM 真菌將椰糠栽培基質(zhì)中的有機(jī)氮礦化為銨態(tài)氮[31]。雖然A4和X2接種對(duì)根際栽培基質(zhì)中銨態(tài)氮含量的影響不明顯，與對(duì)照組處于相同水平，但鑒于4個(gè)促生內(nèi)生真菌處理組藍(lán)莓株高顯著提升，且在試驗(yàn)過程中未對(duì)各組施用外源肥料的情況下‘海岸’藍(lán)莓葉片總氮含量卻總體呈上升趨勢(shì)，故可以推斷A4 和X2 形成的ERM 真菌也可能對(duì)栽培基質(zhì)有機(jī)氮具有一定的礦化作用。磷是植物體物質(zhì)合成及代謝途徑中的重要物質(zhì)，直接參與光合作用、植物生長(zhǎng)等生理過程[32]。而菌根的形成對(duì)植物磷元素利用具有正面影響[33]。本研究顯示：A4 和X22 接種顯著提高了‘海岸’藍(lán)莓葉片總磷含量，而對(duì)藍(lán)莓根際栽培基質(zhì)中速效磷含量的影響不明顯；相比之下，A1和X2接種處理組藍(lán)莓葉片總磷含量與對(duì)照無(wú)明顯差別，但其根際栽培基質(zhì)中速效磷含量顯著降低。由于試驗(yàn)過程中未對(duì)各組施加外源磷肥而4種真菌接種組藍(lán)莓葉片總磷含量卻顯著提升，說(shuō)明A4 和X22 與‘海岸’藍(lán)莓形成的ERM 真菌可能具有促進(jìn)根際栽培基質(zhì)磷元素有效化的作用，可能的機(jī)制是A4 和X22 與‘海岸’藍(lán)莓根系形成的ERM 能向外分泌磷酸酯酶，進(jìn)而降解根際有機(jī)磷[10]。

此外，本研究還在X22 真菌培養(yǎng)液和菌絲體抽提液中檢測(cè)到維生素B2的存在。類似的研究顯示，與密花石斛共生的蘭科菌根真菌也具有分泌維生素B2等B 族維生素的能力[18]。維生素B2具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)及提高植物體抗逆性的作用[34-36]，如維生素B2可作為植物的一種抗病誘導(dǎo)劑，啟動(dòng)由絲裂原活化蛋白激酶MPK3/MPK6 介導(dǎo)的抗病基因表達(dá)[35]。這暗示維生素B2的分泌或是ERM 真菌具有益生作用的另一機(jī)制。