夏丹丹，趙瑩瑩，馬盼盼，王深壘，馬常陽,3，郜曉峰,，康文藝,3,

（1.河南大學 國家食用菌加工技術研發(fā)專業(yè)中心，河南 開封 475004；2.河南省藥食兩用資源功能研究國際聯(lián)合實驗室，河南 開封 475004；3.開封市保健食品功效成分研究重點實驗室，河南 開封 475004）

枸杞子（Lycium barbarumL.）是茄科枸杞屬植物的干燥成熟果實[1]，具有抗氧化、控制血糖、養(yǎng)肝明目、提高免疫力等多種功效[2-4]，是衛(wèi)生部批準的藥食兩用食物。枸杞子糖分含量很高，多糖是它主要的功能成分[5]，占比約為3.36%[6]。所以枸杞子易泛油，一旦貯存不當很容易腐爛、蟲蛀甚至被微生物污染，目前，對枸杞子的微生物污染情況研究不夠深入[7]。

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）是最為常見的食源性微生物之一[8]。大腸桿菌中常見的毒力基因有志賀樣毒素基因（stx1和stx2）、緊密素（eae）、溶血素基因（hly）、O抗原編碼基因（rfb）、β-葡糖醛酸糖苷酶基因（uid）和鞭毛抗原基因（fli）[9-12]。目前對于大腸桿菌的檢測從傳統(tǒng)方法到包括常規(guī)聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、多重PCR、實時PCR[13-14]的分子生物學技術、DNA微陣列技術[15]、免疫檢測技術[16]、傳感器芯片技術[17]和質(zhì)譜技術[18]。這些方法基于相應的核酸標準物質(zhì)。由于質(zhì)粒標準品具備穩(wěn)定性好、純度高等優(yōu)點[19-21]，常常用于臨床應用檢測陽性對照品。由于缺少大腸埃希氏菌毒力基因監(jiān)測相關質(zhì)粒定性標準樣品[22]，參考物質(zhì)溯源性不強、不確定度高、評價模式單一等嚴重缺陷，導致各檢測機構之間的檢測結果差異極大，無法為食品檢驗數(shù)據(jù)提供技術保障。

本研究針對目前相關領域急需，構建大腸桿菌毒力基因質(zhì)粒標準品，保證大腸桿菌關方法檢測結果的可比性，并以藥食兩用食物枸杞子為研究目標，快速檢測大腸桿菌污染情況，以期為食品中大腸桿菌的快速檢測提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

34 批枸杞子樣品購于2018年1月，存放于河南大學國家食用菌加工技術研發(fā)專業(yè)中心。

大腸桿菌（O157、CMCC 43201、CICC 10372、ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（CICC 23656）、阪崎腸桿菌（CICC 21560）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）、單核細胞性李斯特菌（ATCC 19115）均由中國食品藥品檢定研究院于2018年5月贈送，并貯存于河南大學國家食用菌加工技術研發(fā)專業(yè)中心。本研究中選擇CICC為基因組提供菌。

瓊脂糖 東格生物技術有限公司；6×DNA loading Buffer、GoldView I型核酸染色劑、氨芐青霉素 美國Solarbio公司；瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂 北京奧博星生物技術有限公司；D2000 DNA Marker、Marker III、感受態(tài)細胞（DH-5a）、2×Pfu PCR Master Mix（KP201）、細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209）、pLB零背景快速克隆試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒（DP105）、土壤基因組DNA提取試劑盒（DP336） 天根生化科技有限公司；pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液 青島賓得生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

PCR擴增儀、Nano Drop 2000超微量分光光度計、臺式高速離心機 美國Thermo Scientific公司；超凈工作臺蘇潔凈化設備有限公司；生化培養(yǎng)箱 泰宏醫(yī)療器械有限公司；JUNYI脈沖場凝膠電泳儀、BIS910凝膠成像系統(tǒng) 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大腸桿菌PCR檢測方法的建立和評價

取大腸桿菌菌液1 mL，12 000 r/min，4 ℃離心2 min，棄上清液，按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作步驟提取大腸桿菌基因組DNA。對大腸桿菌中毒力基因escV、stx2和hlyA進行PCR反應體系和反應程序的優(yōu)化，并對所建立的PCR反應進行特異性和靈敏度實驗。用金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、沙門氏菌和單核細胞性李斯特菌進行引物特異性實驗。將提取的大腸桿菌全基因組DNA進行10 倍梯度倍比稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6系列濃度，進行檢測靈敏度實驗，將同一批不同稀釋度的稀釋液按建立的方法進行3 次重復實驗，分析此方法的重復性。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小Table 1Primer sequences and PCR-amplified product sizes

1.3.2 重組質(zhì)粒的構建和驗證

利用建立的PCR反應擴增大腸桿菌的毒力基因，得到目的條帶后，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行膠回收。使用pLB零背景快速克隆試劑盒將大腸桿菌毒力基因escV、stx2、bfpA純化后的PCR產(chǎn)物連接至pLB-simple Vector上，連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，培養(yǎng)重組大腸桿菌，挑取單菌落經(jīng)菌落PCR、并送往華大生物科技有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司測序進行鑒定，對測序結果采用BLAST進行比對，以驗證質(zhì)粒標準品構建的是否正確。經(jīng)篩選連接轉化成功后的重組子繼續(xù)進行傳代培養(yǎng)15 代，并進行送檢測序驗證傳代過程中質(zhì)粒是否丟失。

1.3.3 質(zhì)粒標準品凍干粉的制備

質(zhì)粒標準品雖然具有性質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)點，但其在長期貯存過程中也會出現(xiàn)染菌，貯存不方便等問題，考慮到這方面，本研究將制備的質(zhì)粒標準品進行凍干粉制備，將質(zhì)粒標準品制備成無菌粉末劑型，貯存在EP管中，質(zhì)粒標準品經(jīng)過凍干之后，使用時再將凍干粉溶解，不僅減少了染菌的幾率，其穩(wěn)定性也更高，貯存起來也更方便。本研究也對制備的凍干粉進行了檢測限研究、均勻性研究以及短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性研究。

將escV、stx2、hlyA重組質(zhì)粒進行凍干粉制備和應用，選擇經(jīng)篩選成功的escV、stx2、hlyA陽性克隆進行菌液擴大培養(yǎng)，采用堿裂解法進行質(zhì)粒大提用于質(zhì)粒標準品凍干粉的制備，使用Nano Drop 2000超微量分光光度計測定提取質(zhì)粒的濃度和純度，然后送公司進行測序。測序成功后進行凍干粉的制備，用EP管貯存，制成質(zhì)量400 ng左右的凍干粉，分別制備150 管。

1.3.4 均勻性分析

在制備的150 管凍干粉中隨機挑選15 管，用10 μL ddH2O溶解，進行各管之間的均一性研究。使用Nano Drop 2000超微量分光光度計測定其濃度，分別測定3 次，取其平均值，用F檢驗[24]對數(shù)據(jù)進行分析。

1.3.5 穩(wěn)定性分析

1.3.5.1 短期穩(wěn)定性

隨機取質(zhì)粒標準品凍干粉置于25、4、-20 ℃ 3 個溫度下2 周進行短期穩(wěn)定性實驗，第1、3、7、14天進行檢測，每次檢測各取3 管，用10 μL ddH2O溶解，用Nano Drop 2000超微量分光光度計測定其濃度，另取溶解后的escV、stx2、hlyA質(zhì)粒標準品作為模板，分別對escV、stx2、hlyA引物進行PCR擴增，進行定性分析，考察凍干粉的短期穩(wěn)定性。

1.3.5.2 長期穩(wěn)定性

隨機取質(zhì)粒標準品凍干粉置于25、4、-20 ℃ 3 個溫度下5 個月進行長期穩(wěn)定性實驗，每個月進行一次檢測。每次檢測各取3 管，用10 μL ddH2O溶解，用Nano Drop 2000超微量分光光度計測定其濃度和PCR擴增來考察凍干粉的長期穩(wěn)定性。

1.3.6 檢測限實驗

將提取的escV、stx2、hlyA質(zhì)粒標準品濃度先50 倍稀釋后，作為初始檢測樣品，進行稀釋后得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6系列濃度梯度，進行檢測限實驗，確定escV、stx2、bfpA、hlyA質(zhì)粒標準品的檢測限。將escV、stx2和hlyA標準質(zhì)粒濃度按照下式換算為拷貝數(shù)：

DNA長度=載體長度＋目的基因長度

1.3.7 質(zhì)粒凍干粉在枸杞子檢測中的應用

樣品制備：稱取25 g枸杞樣本加入pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液225 mL，振蕩30 min，超聲處理10 min。收集液體6 000 r/min離心10 min，取沉淀，用于DNA提取。使用土壤基因組DNA提取試劑盒提取枸杞樣品的微生物基因組DNA，將提取的枸杞樣品DNA作為PCR擴增的模板，進行毒力基因escV、stx2、hlyA的檢測。對于PCR檢測結果呈現(xiàn)陽性的枸杞樣品進行傳統(tǒng)微生物分離純化檢測。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測方法的建立和評價結果

表2 基因組DNA質(zhì)量濃度和純度Table 2 Concentration and purity of genomic DNA

通過使用Nano Drop 2000超微量分光光度計，測定提取的大腸桿菌全基因質(zhì)量DNA質(zhì)量濃度和純度，結果如表2所示。提取的大腸桿菌DNA質(zhì)量濃度在50～100 ng/μL之間，A260nm/A280nm也可以滿足后續(xù)實驗要求。如圖1所示，可以觀察到單一清晰的特異性條帶，無雜帶，條帶較亮，說明提取的DNA純度和濃度較好，滿足后續(xù)實驗要求。

圖1 大腸桿菌全基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoretic diagram of E.coli whole genomic DNA

優(yōu)化后的25 μL PCR反應體系為2×Pfu PCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL（＜1 μg/μL），上、下游引物0.25 μL（10 μmol/L），加雙蒸水至25 μL。escV和stx2擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。hlyA擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

大腸桿菌escV、stx2和hlyA引物特異性實驗結果表明這些引物具有特異性，結果如圖2所示。建立的PCR檢測方法可使大腸桿菌的檢出限達到pg水平，檢測結果如圖3所示。重復性實驗結果并無差異，該PCR檢測方法重復性滿足實驗要求。

圖2 大腸桿菌escV（A）、stx2（B）、hlyA（C）引物特異性結果Fig.2 Primer specificity of escV (A), stx2 (B), and hlyA (C) in E.coli

圖3 大腸桿菌escV（A）、stx2（B）、hlyA（C）基因PCR檢測靈敏度結果Fig.3 PCR sensitivity of escV (A), stx2 (B), and hlyA (C) in E.coli

2.2 重組質(zhì)粒構建結果

重組質(zhì)粒PCR結果顯示各個毒力基因的片段大小相一致，表明轉入的重組質(zhì)粒中含有目的基因。將escV、stx2、hlyA重組質(zhì)粒測序結果與GeneBank上已經(jīng)公布的序列進行比對，用DNAMAN軟件進行序列比對，比對率都為100%、100%、100%，檢測結果如圖4所示。將經(jīng)篩選連接轉化成功后的重組子繼續(xù)進行傳代培養(yǎng)15 代，并進行質(zhì)粒提取，每隔代送檢測序，測序結果與上述測序結果相同，說明在傳代過程中沒有發(fā)生堿基丟失、錯配、突變的現(xiàn)象。

圖4 大腸桿菌escV（A）、stx2（B）、hlyA（C）測序比對結果Fig.4 Sequence alignment results of escV (A), stx2 (B), and hlyA (C) in E.coli

2.3 質(zhì)粒標準品制備及分析結果

用堿裂解法進行質(zhì)粒提取，所提質(zhì)粒用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定質(zhì)量濃度和純度如表3所示，A260nm/A280nm均在1.8～2.0之間，純度良好，滿足實驗要求。將提取的質(zhì)粒進行測序，GeneBank上已經(jīng)公布的序列進行比對，比對率均為100%。

表3 重組質(zhì)粒質(zhì)量濃度和純度Table 3 Concentration and purity of recombinant plasmids

2.3.1 均勻性結果

隨機挑選escV、stx2和hlyA質(zhì)粒標準品15 管進行質(zhì)量濃度測定結果如表4所示，并對測定結果進行方差分析，結果escV、stx2和hlyA質(zhì)粒標準品質(zhì)量濃度F值均小于F0.05（14，30）=2.04，15 管之間不存在顯著性差異，樣品均勻性較好。

表4 escV、stx2和hlyA質(zhì)粒標準品質(zhì)量濃度Table 4 Homogeneity evaluation: concentrations of escV, stx2 and hlyA plasmid standards ng/μL

2.3.2 短期穩(wěn)定性結果

在25、4、-20 ℃ 3 個溫度下貯存14 d，各個質(zhì)粒標準品質(zhì)量濃度相近，沒有顯著性變化（表5），數(shù)據(jù)之間離散程度較小，PCR擴增均可擴增出單一明亮的特異性條帶（圖5），說明質(zhì)粒標準品短期穩(wěn)定性好。

表5 escV、stx2和hlyA質(zhì)粒標準品短期質(zhì)量濃度Table 5Short-term stability evaluation: concentrations of escV, stx2 and hlyA plasmid standards ng/μL

圖5 escV（A）、stx2（B）和hlyA（C）質(zhì)粒標準品定性檢測結果Fig.5 Qualitative test results with escV (A), stx2 (B) and hlyA (C)plasmid standards

2.3.3 長期穩(wěn)定性結果

在25、4、-20 ℃ 3 個溫度下貯存5 個月，各個質(zhì)粒標準品質(zhì)量濃度沒有顯著性變化（表6），數(shù)據(jù)之間離散程度較小，PCR擴增均可擴增出單一明亮的特異性條帶，說明質(zhì)粒標準品長期穩(wěn)定性好。

表6 escV、stx2和hlyA質(zhì)粒標準品長期質(zhì)量濃度測定Table 6Long-term stability evaluation: concentrations of escV, stx2 and hlyA plasmid standardsng/μL

2.3.4 檢測限實驗結果

如圖6所示，通過計算得到escV、stx2和hlyA質(zhì)粒標準品的檢測限分別為3.93×106、2.41×105拷貝/μL和2.14×105拷貝/μL。

圖6 梯度稀釋質(zhì)粒標準品escV（A）、stx2（B）、hlyA（C）的1.5%電泳結果Fig.6 Electrophoresis of gradient dilutions of plasmid standards escV (A), stx2 (B), and hlyA (C)

2.3.5 質(zhì)粒標準品在枸杞子中的應用

將34 批枸杞子樣品進行escV、stx2、hlyA檢測，在34 批枸杞子樣品中，沒有檢測出escV、stx2，16號、33號和34號枸杞子樣品中檢測出hlyA（圖7）。

圖7 枸杞子樣品中hlyA的PCR檢測結果Fig.7 PCR results of hlyA in L.barbarum samples

選擇PCR檢測結果為陽性的3 批枸杞樣品按照GB 4789.6—2016《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》的方法進行檢測，結果沒有檢測出大腸桿菌。

3 討 論

食品原料在加工、包裝、運輸和貯存過程中，由于溫度、濕度、空氣和光線等條件沒有嚴格控制會使質(zhì)量下降，產(chǎn)生安全隱患[25-26]，霉變、蟲蛀是最常見的變異現(xiàn)象，對于糖分、脂肪含量高的食品原料更容易發(fā)生腐爛變質(zhì)、產(chǎn)生菌絲、微生物污染等現(xiàn)象[27-28]。本研究所用的枸杞子是2018年1月在不同產(chǎn)地收集，自然條件下貯存，并用構建的escV、stx2、hlyA質(zhì)粒DNA標準品進行了大腸桿菌致病菌檢測，結果在34 批樣品中escV、stx2沒有被檢測出，有3 批枸杞樣品中檢測出hlyA，檢出率為8.82%，選擇被檢出的3 批枸杞子樣品，進行傳統(tǒng)的微生物分離方法進行檢測，并進行16S rRNA測序，結果沒有檢測出大腸桿菌。沒有檢出并不能代表枸杞子中不含有大腸桿菌，傳統(tǒng)微生物檢測方法中使用的增菌液沒有針對性的對目的菌增菌，在大的微生物污染環(huán)境下，目標致病菌就很可能被抑制生長，大大降低了檢出率[29]。PCR檢測方法和傳統(tǒng)的微生物分離檢測技術相比不僅縮短了檢測時間，而且檢測結果的準確性也更高[30-31]，本研究采用常規(guī)的PCR檢測技術結合質(zhì)粒構建成功構建了用于快速檢測大腸桿菌的重組質(zhì)粒DNA標準品，相對于傳統(tǒng)微生物分離鑒定檢出率有了很大的提高。姜睿嬌等[32]通過雙重熒光定量PCR方法和質(zhì)粒構建技術結合成功構建了用于快速檢測副豬嗜血桿菌和巴氏桿菌的重組質(zhì)粒標準品，并對臨床28 份樣品進行了檢測，結果陽性檢出率為53.57%，同時也采用了常規(guī)PCR技術和細菌分離鑒定同步進行檢測，結果檢出率分別為46.42%和28.57%。隨著對微生物快速檢測的要求越來越高，傳統(tǒng)的細菌分離檢測技術已經(jīng)不能滿足需求，細菌分離也較為困難，能分離出的細菌種類較少[33]，并且耗時較長，大大降低了樣品檢測的準確性和效率。將PCR技術與多種技術相結合應用到食品中微生物的快速檢測，不僅克服了傳統(tǒng)檢測方法的弊端，得到的檢測結果準確度和靈敏度更高，檢測效率也有了很大的提高。

本研究中構建的大腸桿菌中質(zhì)粒標準品，經(jīng)過菌落PCR、測序以及傳代進行了驗證，結果呈現(xiàn)100%，測序與GeneBank上已經(jīng)公布的序列進行比對，比對率也均為100%，傳代結果也顯示出質(zhì)粒標準品具有良好的穩(wěn)定性。本研究使用的是一種即用型的陽性選擇克隆載體pLB-simple Vector，pLB是在pLL3.7載體基礎上的修改，添加了已知的防止表觀遺傳沉默的遺傳元件，由于該載體含有一種致死基因，因此當克隆位點處插入外源片段時就會引起基因的失活[34]，只有轉化了重組質(zhì)粒的細菌才能存活形成克隆菌落，可以保證在連接的過程中重組質(zhì)粒的成功構建，基于pLB載體的這個優(yōu)勢，它在載體構建中得到了廣泛的應用，本研究中制備的質(zhì)粒標準品的A260nm/A280nm在1.8～2.0之間，純度也較好。本研究將制備成功的質(zhì)粒標準品進行了無菌凍干處理，制備成質(zhì)量濃度在400 ng/μL左右的凍干粉，并進行了均勻性、穩(wěn)定性研究，結果表明質(zhì)粒標準品凍干粉均勻性、穩(wěn)定性都較好，由于將質(zhì)粒標準品進行了無菌凍干，也減少了凍干粉貯存過程中的污染機率，有研究將大腸桿菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液進行了無菌凍干處理，并對其進行了均勻性和穩(wěn)定性實驗，結果表明其均勻性結果無顯著性差異，保存過程中穩(wěn)定性也較好[35-36]。

大腸桿菌作為食品安全微生物限量指標中的指示菌[37]，不同的食品中對大腸桿菌的檢出限量有不同的規(guī)定，當環(huán)境中檢出含有大腸桿菌時，說明可能存在大腸桿菌污染，大腸桿菌本身作為一種正常腸道菌群，在一定的環(huán)境下可以使人致病[38]。當人們的日常飲食被大腸桿菌污染時，及時、準確地檢測出來，不僅可以起到預防作用，減少疾病的爆發(fā)，也能做到溯源，有效地控制污染源的散播。

4 結 論

目前，我國對于食品安全未知風險發(fā)現(xiàn)能力較弱、風險識別與評估技術周期長、效率低、食品安全檢測技術及相關標準缺乏[39-40]。無論與食品安全形勢的實際需求，還是與國際食品安全基本標準相比，都存在較大差距。尤其是食品微生物定性和定量檢驗DNA參考物質(zhì)體系不完整，極大限制了檢驗檢測的水平。本研究以食源性微生物大腸桿菌為研究對象，構建大腸桿菌中常見毒力基因的質(zhì)粒DNA標準品，并對常用藥食兩用資源枸杞子進行檢測，建立了一種可以應用的技術和質(zhì)粒標準品。該質(zhì)粒標準品能夠為PCR快速檢測食品和中藥中大腸桿菌提供陽性對照，減小了方法的不確定性，保證檢測結果的準確性，實現(xiàn)檢測結果的可溯源性，為食品中大腸桿菌的快速檢測提供技術參考。