張秀堯，蔡欣欣，張曉藝，李瑞芬

（溫州市疾病預防控制中心，浙江 溫州 325001）

河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）是一種毒性很強的非蛋白神經(jīng)毒素，存在于河豚魚和多種脊椎動物及無脊椎動物體內，如河豚魚、織紋螺、蠑螈、蟾蜍和蟹類等水產品。TTX屬氨基全氫化喹唑啉化合物，為鈉通道阻斷劑，可以選擇性地阻斷神經(jīng)元細胞及肌膜上的鈉離子通道，阻斷神經(jīng)沖動的傳導，引起神經(jīng)麻痹，嚴重者抑制呼吸導致死亡[1-2]。TTX的化學性質穩(wěn)定，烹飪、日光曝曬、鹽腌等一般食物加工方法均難以完全破壞，所以含有TTX的水產品加工成制品，如烤魚片或魚干等也是有毒的。由于河豚魚和織紋螺等肉鮮味美，我國沿海均有食用的習慣，已發(fā)生多起誤食河豚魚或織紋螺等引起的TTX中毒事件[3-6]，中毒后又缺乏特效解毒藥，嚴重者常致人死亡，TTX中毒已成為引人關注的水產品安全問題。因此，水產品及其制品中TTX的檢測方法一直是研究的熱點。

水產品中TTX的檢測方法主要有小鼠生物法[7-8]、液相色譜紫外檢測法[9]、液相色譜柱后衍生熒光法[10]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[11]和液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用法[12-20]等。其中小鼠生物法測定樣品的總毒性，但不能對樣品中毒素成分進行定性，且小鼠個體差異較大，檢測結果誤差大；液相色譜紫外檢測法選擇性差、靈敏度低；液相色譜熒光檢測法選擇性不強，常有基質成分的干擾；氣相色譜-質譜聯(lián)用法需要衍生，操作比較復雜，測定在強堿性條件下能夠生成C9-堿的包括TTX在內的TTX類似物的總和，且靈敏度低；液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用法靈敏度高、定性能力強，是測定TTX的理想檢測方法。早期由于缺少TTX專一性強的樣品前處理方法，樣品處理液的基質抑制效應比較嚴重，又沒有商品化的同位素內標，多使用基質匹配標準外標法定量，方法的靈敏度不高，定量的準確度和精密度均不理想[13-15]。近年來有文獻采用免疫親和柱凈化方法，能夠去除雜質，消除基質效應（matrix effect，ME），可以采用溶劑標準法進行定量，但也存在免疫親和柱價格高、線性范圍窄等缺點[16-18]。

二維超高效液相色譜技術具有峰容量大、分離能力強、能夠顯著降低復雜樣品的ME、實現(xiàn)樣品分析的自動化等優(yōu)點，已在食品安全、中藥有效成分分析、環(huán)境科學等領域得到廣泛應用[21-23]。本研究采用中心切割二維超高效液相色譜技術同時對樣品進行凈化和分離，減少樣品ME，采用三重四極桿/復合線性離子阱質譜技術進行檢測，建立水產品及其制品中TTX的快速檢測方法，方法簡單、靈敏、準確。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（液相色譜溶劑級） 德國Merck公司；乙酸、甲酸（液相色譜溶劑級） 美國Tedia公司；TTX標準物質（純度≥99%） 大連瑞芳生化物品有限公司，用0.2%乙酸溶液配制成100 μg/mL標準貯備溶液，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 儀器與設備

二維超高效液相色譜儀（由ACQUITY UPLC QSM四元溶劑管理系統(tǒng)（第1維）、ACQUITY UPLC BSM二元溶劑管理系統(tǒng)（第2維）、ACQUITY UPLC FTN樣品管理系統(tǒng)、ACQUITY UPLC CM-A色譜柱管理系統(tǒng)和515稀釋泵組成，由Empower 3工作站控制） 美國Waters公司；QTRAP 6500三重四極桿/復合線性離子阱串聯(lián)質譜儀（由Analyst 1.6.2軟件控制） 美國AB SCIEX公司；GM200碾磨儀德國Retsch公司；ULTRA-TURRAX T-25型分散機、MS3旋渦混旋器 德國IKA-WERKE公司；3-30K高速冷凍離心機 德國Sigma公司；2510超聲波清洗機美國Branson公司；Gradient A10 Mill-Q超純水器 法國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

從樣品中取出有代表性的可食部分經(jīng)碾磨儀攪碎、均質，-35 ℃冷凍保存。

稱取2.00 g樣品置于50 mL具塞離心管中，加入9.0 ml 0.2%乙酸溶液，分散機勻質15 s，刀頭用9 mL 0.2%乙酸溶液清洗，提取液調pH 3～5，置于沸水浴中加熱5 min，（或者102 ℃烘箱放置10 min），取下用冷水冷卻至室溫，超聲提取5 min，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，殘渣再用刀頭清洗液重復提取1 次，合并提取液，用0.2%乙酸溶液定容至20 mL，混勻，吸取100 μL提取液加入900 μL 0.2%乙酸溶液，旋渦混勻，過0.2 μm濾膜，待測。

1.3.2 色譜條件

中心切割二維超高效液相色譜流路圖見圖1。

圖1 中心切割二維超高效液相色譜流路圖Fig.1 Schematic illustration of heart-cutting two-dimensional liquid chromatography

第1維：保護柱Hypercarb PGC（4.6 mm×10 mm，5 μm，色譜柱1），色譜柱為Hypercarb PGC（2.1 mm×100 mm，3 μm，色譜柱2），柱溫40 ℃，流動相A：0.2%甲酸溶液，流動相B：乙腈；進樣體積10 μL。515稀釋泵的溶劑為乙腈。梯度洗脫程序見表1。

第2維：捕集柱為XBridge BEH Amide guard column（4.6 mm×10 mm，2.5 μm，色譜柱3），分析柱為Acquity BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，色譜柱4）柱溫40 ℃，流動相A：0.1%甲酸-乙腈溶液，流動相B：0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序見表1。

1.3.3 質譜條件

電噴霧離子源，正離子掃描方式，多離子監(jiān)測觸發(fā)的增強子離子掃描（multiple reaction monitoringinformation dependent acquisition-enhanced product ion scanning，MRM-IDA-EPI）模式。離子化電壓：5 500 V，離子源溫度：600 ℃，氣簾氣壓強：276 kPa，噴霧氣壓強：345 kPa，輔助加熱氣壓強：414 kPa，碰撞器：High。TTX的定量離子對為m/z320.0/302.2，定性離子對為m/z320.0/162.2，去簇電壓均為150 V，碰撞能量分別為32 eV和50 eV。增強子離子掃描參數(shù)：掃描速率10 000 Da/s，掃描范圍m/z100～340，動態(tài)阱集時間不大于1 ms，增強子離子掃描碰撞能量：30、40 eV和50 eV。

運行開始時，第2維色譜柱流出液經(jīng)六通切換閥切換至廢液，6.00 min后再切換至離子源，質譜開始采集數(shù)據(jù)直到7.00 min結束，同時六通切換閥又將柱流出液切換至廢液中。

2 結果與分析

2.1 質譜條件選擇

在電噴霧正離子檢測方式下對質譜測定條件進行優(yōu)化，Q1掃描時可見[M＋H]＋峰，然后對準分子離子峰進行碰撞，通過子離子掃描得到TTX碎片離子信息，然后再對去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化，使得分子離子對的信號達到最強，選擇兩對分子離子對，以響應相對較強的子離子作為定量離子，另一子離子作為定性離子。同時設定合適的峰駐留時間確保色譜峰的采樣點數(shù)在15～20點，從而得到較好的定量重復性。優(yōu)化后的測定條件見1.3.3節(jié)。

三重四極桿/復合線性離子阱質譜，既保留三重四極桿質譜較好的選擇性與靈敏度，又增加了線性離子阱增強子離子掃描功能，采用電噴霧正離子模式MRM-IDAEPI模式，一次進樣可以同時得到用于定量的MRM色譜圖和用于定性的增強子離子掃描質譜圖，利用標準物質自建增強子離子掃描譜庫，檢測時可以通過譜庫檢索技術對被檢出化合物進行確證，提高了方法的定性能力，有利于復雜基體中痕量目標化合物的定性，可以避免假陽性結果。圖2為含有0.008 mg/kg TTX的織紋螺樣品的增強子離子掃描譜圖，譜庫檢索的TTX符合率為92.2%。

圖2 織紋螺中TTX的增強子離子掃描譜圖Fig.2 Enhanced product ion scan spectra of tetrodotoxin in Nassarius

2.2 中心切割二維色譜條件的選擇與優(yōu)化

TTX屬強極性化合物，在常規(guī)反相色譜柱上不保留或保留很弱，目前多采用酰胺型親水色譜柱進行分離[14,16-18,24-27]，實驗選用Acquity UPLC BEH Amide色譜柱作為第2維色譜柱進行分離。采用親水色譜法進行分離時，TTX易受基質成分影響，表現(xiàn)為保留時間不穩(wěn)定，基質抑制效應較嚴重[14]。為了去除基質成分增加了一維分離，采用Acquity UPLC HSS T3、Agilent Zorbax SB-Aq和Thermo Fisher Hypercarb色譜柱作為第1維分離柱，結果顯示只有Hypercarb色譜柱能夠較好保留TTX，以0.2%甲酸溶液作為流動相時TTX的保留時間為2.68 min（保留因子約為0.5）（圖3），因此選擇Hypercarb色譜柱作為第1維分離柱，采用中心切割的方式去除基質雜質，既可減少ME，又可確保第2維分離TTX時保留時間穩(wěn)定。為了確保TTX切割完全，增加方法的耐受性，適當加大切割時間的區(qū)間，經(jīng)過實驗中心切割時間最終確定為2.20～3.20 min。若單純采用Hypercarb色譜柱進行TTX的分離，由于保留不強，易受基質成分影響，質譜信號抑制明顯，將第1維色譜柱流出的含有TTX的流分通過六通閥切換至捕集柱（XBridge BEH Amide guard column），Amide柱保留TTX的機理為親水色譜分離機理，由于此時第1維流動相0.2%甲酸溶液為Amide柱的強洗脫流動相，TTX不能被Amide柱保留，必須泵入高比例的乙腈（弱洗脫流動相），TTX才能被Amide柱保留，因此選擇515泵泵入高比例的乙腈通過三通先與第1維色譜柱切割的流分混合后，再流入Amide捕集柱，TTX就可被捕集在捕集柱的柱上，實驗分別以0.50、1.00、2.00、3.00 mL/min泵入乙腈，結果顯示當乙腈流速不低于2.00 mL/min時，TTX可被Amide完全捕集在柱頭，洗脫出來的色譜峰窄而高，故后續(xù)實驗乙腈流速選用2.00 mL/min。當TTX捕集完成后，六通閥將捕集柱反向切入第2維色譜系統(tǒng)，流動相將捕集在柱頭的TTX洗脫入Amide分析柱中進行分離，此時TTX得到聚焦，洗脫色譜峰比較窄，檢測靈敏度高，保留時間穩(wěn)定，見圖4。優(yōu)化二維色譜條件見1.3.2節(jié)。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫條件及閥切換時間Table 1 UPLC gradient elution conditions and valve switching program

圖3 第1維液相分離MRM色譜圖Fig.3 First-dimensional MRM chromatograms

圖4 TTX二維超高效色譜MRM圖Fig.4 MRM chromatograms of TTX (1.0 μg/L) by two-dimensional UPLC

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

TTX不溶于水和一般有機溶劑，但在酸性條件下，可溶于水和甲醇。目前文獻報道的提取方法主要有酸性水溶液和酸性甲醇溶液，考慮到提取效率以及提取液與第1維色譜柱分離條件的匹配性，選擇0.2%乙酸溶液作為提取劑進行2 次提取，TTX提取效率可達98%以上[14,28]。

水產品中TTX凈化方法主要有：反相固相萃取結合超濾法[10]、石墨化碳黑固相萃取法[14]和免疫親和柱凈化法[16-18]等。反相固相萃取結合超濾法凈化效果不好，ME非常嚴重；石墨化碳黑固相萃取法凈化后，水產品中TTX的基質抑制效應在40%～50%左右，定量時要采用基質標準進行匹配，在實際樣品測定時，當一批樣品由多個不同類型樣本組成時，采用基質標準匹配時工作量大；免疫親和柱凈化效果好，水產品中TTX基本不呈基質抑制效應，可以采用溶劑標準定量，但免疫親和柱價格高，易受柱容量等因素限制，線性范圍比較窄[16-18]。

本法采用中心切割二維色譜法進行凈化和分離，在第1維Hypercarb色譜柱分離時可將TTX與大部分基質成分分離，中心切割時只將含有TTX的流分切入第2維的色譜柱進行分離，由于本法兩維的分離機理分別為反相色譜和親水色譜，具有一定的正交性，第1維切割的TTX流分中含有的基質成分在第2維色譜柱上與TTX得到較好地分離，經(jīng)過實驗將樣品提取液再稀釋10 倍后進行測定，基質抑制效應很小。選取貽貝、花蛤、香螺、織紋螺和河豚魚肉進行ME評估，在樣品提取液中加入適量的標準溶液制成基質匹配標準溶液系列（0.02～20 μg/L）進行測定，將基質匹配標準曲線的斜率除以溶劑標準曲線（0.02～20 μg/L）的斜率再乘以100%作為樣品的ME[29]，當ME＜100%，表現(xiàn)為基質抑制效應，當ME＞100%，表現(xiàn)為基質增強效應，當ME=100%，表現(xiàn)為無ME，結果見表2，樣品的ME在88%～95%之間，表明不存在明顯的ME，可以采用溶劑標準外標法定量[30]，因此無需進行基質匹配，方便操作，又能得到準確結果。

表2 水產品中TTX的METable 2 Matrix effects of TTX in aquatic products

2.4 方法的分析性能

2.4.1 標準曲線、檢出限和定量限

將TTX標準品溶液用0.2%乙酸溶液稀釋成分別含0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、10 μg/L和20 μg/L的TTX系列標準溶液進行測定，采用MultiQuant（Ver.3.0）定量軟件進行數(shù)據(jù)處理，以定量離子對的峰面積（y）對標準系列質量濃度（x，μg/L）進行回歸（權重取1/x），TTX在0.02～20 μg/L質量濃度范圍內回歸方程為y=1.18×106x＋8 582，相關系數(shù)優(yōu)于0.999，符合線性關系的要求。

在空白樣本中加入系列低質量濃度的TTX按本法測定，以兩對分子離子對的RSN≥3時對應的樣品質量濃度作為檢出限，RSN≥10時對應的樣品質量濃度作為定量限，實驗測得樣品的檢出限為0.000 7 mg/kg，定量限為0.002 mg/kg，定量上限為2.0 mg/kg，高質量濃度樣品需稀釋后再行測定。

2.4.2 方法的精密度和加標回收實驗

表3 水產品中TTX加標回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of tetrodotoxin in aquatic products (n= 6)

選取不含TTX或含低含量TTX的貽貝、花蛤、香螺、織紋螺、河豚魚肉和烤魚片進行加標回收和精密度實驗，樣品中添加了不同質量濃度的標準溶液后，放置過夜，使待測成分與樣品基體成分相互作用達到平衡，再按樣品前處理方法進行操作，其回收率和精密度結果見表3。樣品的加標回收率分別為82.3%～95.4%，相對標準偏差在2.1%～14%之間，符合痕量分析的要求。

2.5 實際樣品的分析

采用本法在4 a時間內共測定291 份水產品及其制品。貽貝、花蚶、牡蠣、扇貝、花蛤、文蛤等80 份貝類樣品中有1 份白蛤和2 份文蛤檢出TTX，含量分別為0.022、0.008 mg/kg和0.007 mg/kg；40 份香螺均檢出TTX，含量為0.002～0.296 mg/kg；118 份烤魚片中有26 份檢出TTX，含量為0.002～2.55 mg/kg；53 份織紋螺均檢出TTX，含量為0.003～64.1 mg/kg，其中有10 份織紋螺中TTX的含量在7.9～64.1 mg/kg之間，存在中毒隱患。

3 結 論

本研究建立了中心切割二維超高效液相色譜-三重四極桿/復合線性離子阱質譜法快速測定水產品及其制品中TTX的方法。通過二維色譜分離系統(tǒng)的優(yōu)化，達到較好的樣品凈化和分離效果，基本消除了樣品ME，簡化了樣品前處理操作，簡便快速；通過對質譜檢測條件的優(yōu)化，得到了較高的檢測靈敏度；采用MRM-IDA-EPI模式，一次進樣可以同時得到用于定量的MRM色譜圖和用于定性的二級掃描質譜圖，提高了定性能力，有利于復雜基體中痕量目標化合物的定性；采用溶劑標準外標定量，結果準確、重復性好，已應用于實際樣品的測定取得滿意結果。