宋 佳,王 駿,葉 茂,*

1 貴州大學(xué)昆蟲研究所,貴陽 550025 2 貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽 550025

植物在與植食性昆蟲協(xié)同進(jìn)化的過程中逐漸形成了多種防御機(jī)制,植物一方面可以產(chǎn)生單寧,酚酸,生物堿和蛋白酶抑制劑等直接抑制昆蟲的生長發(fā)育[1],另一方面植物釋放揮發(fā)性物質(zhì)吸引捕食性天敵或寄生性天敵,從而對植食性昆蟲進(jìn)行間接防御[2]。此外,已有很多研究證實(shí)植物間存在信息交流,植物在受到植食性昆蟲的取食后所釋放揮發(fā)性化合物,如4-異丁基苯乙酮,檸檬烯,月桂烯,羅勒烯,MeJA和水楊酸甲酯等誘導(dǎo)激活鄰近植株防御反應(yīng)[3-4],這種植物與植物之間通過揮發(fā)性化合物進(jìn)行信息交流的過程稱為“植物間通訊”[5],目前已報(bào)道有16科35種植物可以進(jìn)行化學(xué)通訊[6]。在這些蟲害誘導(dǎo)的揮發(fā)物中,MeJA和水楊酸甲酯與植物間通訊密切相關(guān),這兩種化合物揮發(fā)性強(qiáng),可通過植物的氣孔進(jìn)入植物體內(nèi),在細(xì)胞質(zhì)中被酯酶水解為茉莉酸或水楊酸,從而誘導(dǎo)鄰近植物產(chǎn)生誘導(dǎo)防御反應(yīng)[7-8]。Farmer和Ran[9]發(fā)現(xiàn),被修剪的山艾樹可釋放MeJA誘導(dǎo)鄰近健康的番茄植株產(chǎn)生蛋白酶抑制劑抑制昆蟲的取食,而Karban通過田間試驗(yàn)也證明山艾樹受到損傷后會(huì)釋放出大量MeJA,誘導(dǎo)鄰近未受傷的番茄和野生的煙草植株合成大量蛋白酶抑制劑和多酚氧化酶,而未受傷植株受昆蟲的取食明顯減少[10]。植物釋放的揮發(fā)物不僅可以誘導(dǎo)鄰近植物的防御,同時(shí)會(huì)影響昆蟲的行為[11],促使昆蟲轉(zhuǎn)移到鄰近其他未受危害的植株上取食[12],即昆蟲可以利用外部信號尋覓合適的取食環(huán)境或發(fā)現(xiàn)潛在的危險(xiǎn)而逃離[6,11,13],因而認(rèn)為鄰近受害植株不一定是“好鄰居”[14],如果植物受傷后釋放的揮發(fā)物對鄰近植株防御的誘導(dǎo)作用有濃度效應(yīng)和距離的限制,那么對于固著生長的植物來說,通過釋放揮發(fā)物來激活鄰近植株的防御反應(yīng)存在一定生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[15]。

斜紋夜蛾(SpodopteralituraFabricius)是一種世界性分布的廣食性害蟲,對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的危害。番茄(Lycopersiconesculentum)是一種重要的蔬菜作物,并且番茄全基因組已經(jīng)被測序,是研究植物與昆蟲相互作用的經(jīng)典模式植物。本實(shí)驗(yàn)以番茄和斜紋夜蛾為實(shí)驗(yàn)材料,研究植物間重要通訊信號物質(zhì)MeJA誘導(dǎo)鄰近番茄植株抗蟲性的濃度和距離效應(yīng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果對利用植物間通訊物質(zhì)防治害蟲有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

(1)斜紋夜蛾：供試?yán)ハx為人工飼料在實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)10代以上的敏感品系。溫度(25±2)℃,相對濕度60% RH,光周期14 L∶10 D。

(2)番茄：供試品種為合作903大紅番茄,以營養(yǎng)缽單株培育于無蟲網(wǎng)室,移栽20 d后,挑選生長發(fā)育整齊一致的健康番茄植株供試。生長期間不施用任何農(nóng)藥。

(3)MeJA：(±)-methyl jasmonate購自美國Sigma-aldrich公司,純度為98%。

1.2 實(shí)驗(yàn)處理

MeJA用少量無水乙醇溶解后,再用蒸餾水配制成濃度分別為1 mmol/L和10 mmol/L的溶液(含2%無水乙醇),以2%的無水乙醇水溶液為對照。在不同狹長大棚(1m ×1 m × 4 m)內(nèi)按離氣味源60 cm、120 cm、180 cm、240 cm和300 cm的距離擺放番茄植株,每個(gè)距離擺放6株番茄植株,作為6個(gè)重復(fù)。在大棚空氣進(jìn)口處分別噴霧不同濃度的MeJA和對照水溶液60 mL作為氣味源,不同濃度的MeJA在不同大棚中進(jìn)行。噴霧MeJA后立即封閉大棚處理48 h后,檢測不同距離番茄植株葉片過氧化物酶(Peroxidase, POD),多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)和脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX)的酶活性,并檢測斜紋夜蛾取食各處理番茄植株葉片后的體重增長率。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1番茄植株抗蟲酶活性的測定

(1)POD,PPO酶活性檢測方法

稱取番茄葉片0.1 g,液氮研磨成粉末,在液氮未揮發(fā)完前轉(zhuǎn)入離心管,加入1 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.2)(內(nèi)含5%聚乙烯吡咯烷酮PVPP),在渦旋振蕩儀上渦旋振蕩10 s,低溫冷凍離心機(jī)中12000 r/min離心15 min,上清液為酶液,POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行[16],PPO活性測定采用鄰苯二酚法[17],酶活性最終以每毫克蛋白所含有的酶活單位(U min-1mg-1蛋白質(zhì))表示。

(2)LOX檢測方法

稱取0.1 g葉片,液氮研磨成粉末,在液氮未揮發(fā)完前轉(zhuǎn)入離心管,立即加入1 mL 0.05 mol/L Tris-HCL提取液,在渦旋振蕩儀上渦旋振蕩10 s,低溫冷凍離心機(jī)中12000 r/min離心15 min,上清液為待測酶液,以亞油酸為底物測定LOX活性[18],酶活性最終以每毫克蛋白所含有的酶活單位(U min-1mg-1蛋白質(zhì))表示。

1.3.2蛋白含量測定

蛋白含量測定采用Bradford方法[19],使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.3檢測斜紋夜蛾體重增長率

噴霧不同濃度MeJA后立即封閉大棚,誘導(dǎo)處理48 h后,挑選生長發(fā)育一致的4齡斜紋夜蛾幼蟲,分別接到60 cm 和300 cm處的番茄植株葉片上取食,每株番茄苗接3頭幼蟲,每個(gè)處理10株番茄,即每個(gè)處理共30個(gè)重復(fù)。取食2 d、4 d和6 d 后用萬分之一天平稱量斜紋夜蛾的體重,計(jì)算體重增長率。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)分析在Statistica中進(jìn)行,用Duncan多重比較法分析(P<0.05)處理間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA對鄰近番茄植株葉片PPO酶活性的影響

離氣味源不同距離的對照組番茄植株其葉片PPO活性沒有顯著差異,而1 mmol/L 和 10 mmol/L MeJA處理48 h后,離氣味源不同距離的番茄植株葉片PPO活性呈現(xiàn)不同程度的變化(圖1)。1 mmol/L MeJA 處理下,以離氣味源60 cm處番茄植株葉片的酶活性最高,并隨著距離的增加有逐漸減弱的趨勢,其中60 cm和120 cm處的番茄植株其葉片PPO活性分別比相同距離的對照組高84.60%和48.65%,10 mmol/L MeJA處理下,以離氣味源240 cm和300 cm處番茄植株葉片的酶活性最高,其中180 cm、240 cm和300 cm處的番茄植株其葉片PPO活性分別比相同距離的對照組高69.06%,122.50%和110.61%。雙因素方差分析結(jié)果表明,MeJA處理濃度和距離間交互效應(yīng)顯著(P=0.000363),以10 mmol/L MeJA處理下離氣味源300 cm處番茄植株葉片的PPO活性的的誘導(dǎo)效應(yīng)最強(qiáng)。

圖1 MeJA對鄰近番茄植株葉片多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)活性的影響

2.2 MeJA對鄰近番茄植株葉片POD活性的影響

對照組中不同距離番茄植株其葉片POD活性沒有顯著差異(圖2)。1 mmol/L MeJA 處理下,60 cm、180 cm和240 cm處的番茄植株其葉片POD活性分別比相同距離的對照組高260.60%,120.16% 和142.67%,而120 cm和300 cm番茄植株其葉片POD活性與對照組相比沒有顯著差異；10 mmol/L MeJA處理下,60 cm、120 cm、180 cm和240 cm處的番茄植株其葉片POD活性顯著比對照組的高309.76%,331.20%,146.72% 和134.11%,而300 cm處番茄植株葉片POD活性與對照組相比沒有顯著差異。雙因素方差分析結(jié)果表明,MeJA處理濃度和距離的交互效應(yīng)顯著(P=0.000266),以10 mmol/L MeJA處理下離氣味源60 cm處番茄植株葉片的POD活性最強(qiáng),隨著距離的增加而呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢。

圖2 MeJA揮發(fā)物對鄰近番茄植株葉片過氧化物酶(Peroxidase, POD)活性的影響

2.3 MeJA對鄰近番茄植株葉片LOX酶活性的影響

對照組不同距離番茄植株間葉片LOX酶活性沒有顯著差異(圖3)。1 mmol/L MeJA 處理下,60 cm和180 cm處的番茄植株其葉片LOX活性顯著比相同距離的對照組的高182.23%,107.81%,而120 cm、240 cm和300 cm番茄植株其葉片LOX活性與對照組相比沒有顯著差異；10 mmol/L MeJA處理下,60 cm、120 cm和180 cm的番茄植株其葉片LOX活性顯著比對照組的高431.73%,133.41%,115.18%,而240 cm和300 cm處的番茄植株葉片LOX活性與對照組相比沒有顯著差異。雙因素方差分析結(jié)果表明,MeJA處理濃度和距離的交互效應(yīng)顯著(P=0.0000),以10 mmol/L MeJA處理下離氣味源60 cm處番茄植株葉片的LOX活性最強(qiáng),隨著距離的增加而呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢。

圖3 MeJA對鄰近番茄植株葉片脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX)活性的影響

2.4 MeJA對鄰近番茄植株抗斜紋夜蛾的影響

研究結(jié)果表明1 mmol/L和10 mmol/L MeJA揮發(fā)物都顯著誘導(dǎo)提高了鄰近番茄植株對斜紋夜蛾幼蟲的抗性,其中取食1 mmol/L MeJA 處理組60 cm處的番茄植株葉片的斜紋夜蛾幼蟲,其取食4 d和6 d后的體重增長率顯著比取食相同距離下對照組番茄植株葉片的低58.62%和37.78%,比取食300 cm處的番茄植株葉片的斜紋夜蛾幼蟲低47.35%和23.67%(圖4)；此外,取食10 mmol/L MeJA 處理組60 cm處的番茄植株葉片的斜紋夜蛾幼蟲,其取食4 d和6 d后的體重增長率顯著比取食相同距離下對照組番茄植株的低74.57%和54.91%,比取食300 cm處的番茄植株葉片的斜紋夜蛾幼蟲低16.46%和25.03%。雙因素方差分析結(jié)果表明,相同取食時(shí)間下,MeJA處理濃度和距離的交互效應(yīng)顯著(P=0.0000),以10 mmol/L MeJA揮發(fā)物的誘導(dǎo)作用最強(qiáng),且隨著距離的增加,番茄植株的抗蟲性明顯降低。

圖4 斜紋夜蛾幼蟲體重增長率變化

3 討論

生物間的化學(xué)通訊是一個(gè)普遍的自然現(xiàn)象,并一直受科學(xué)家們的關(guān)注[5,10,20]。植物與授粉昆蟲,植物與真菌,植物與害蟲,植物與害蟲的天敵之間都存在化學(xué)通訊[21]。近年來,大量研究發(fā)現(xiàn),植物在受到植食性昆蟲的攻擊后釋放出的大量揮發(fā)性化合物,誘導(dǎo)增強(qiáng)鄰近植株的抗蟲性,在這些揮發(fā)性化合物中,MeJA參與了植物間的信息交流,與植物間的防御通訊密切相關(guān)[10,21-23]。本實(shí)驗(yàn)以噴霧 MeJA 模擬番茄植株間的通訊信號,研究其作為植物間通訊信號誘導(dǎo)鄰近植株抗蟲性的距離和濃度效應(yīng)。

POD是植物防御的關(guān)鍵酶之一,對維持植物體內(nèi)自由基平衡具有重要作用,能利用過氧化氫氧化供氫體,并參與合成木質(zhì)素,影響植物的感病或抗病[24]。方海濤用0.01 mmol/L、0.1 mmol/L和1.0 mmol/L 3種濃度的MeJA處理均使蒙古扁桃葉片POD 活性較對照增加,再用天幕毛蟲(MalacosomaneustriatestaceaMotsch)取食誘導(dǎo)后的蒙古扁桃木葉片,均降低了對葉片的消化率、轉(zhuǎn)化率和利用率[25]。LOX是一種非血紅素鐵蛋白,是植物抗脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵酶[26]。LOX基因的表達(dá)或LOX酶活性的高低都與植物的防御狀態(tài)密切相關(guān),LOX2基因的高表達(dá)在油菜對菌核病抗性中起重要作用,參與了茉莉酸介導(dǎo)的菌核病抗性防御反應(yīng)[27]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明噴霧1 mmol/L 和10 mmol/L MeJA產(chǎn)生的揮發(fā)物可以顯著誘導(dǎo)增強(qiáng)鄰近番茄植株葉片PPO,LOX和POD的活性,以10 mmol/L MeJA處理組植株葉片防御酶LOX和POD酶的活性最高,1 mmol/L MeJA處理組植株葉片酶活性次之,并且隨著距離的增加而呈現(xiàn)減弱的趨勢,表明MeJA揮發(fā)物對鄰近番茄植株的誘導(dǎo)抗性有明顯的濃度效應(yīng)和距離效應(yīng)。PPO是植物體內(nèi)的一種抗?fàn)I養(yǎng)酶類,能催化酚類化合物轉(zhuǎn)化為醌,減少食草昆蟲對植物營養(yǎng)的獲取[28],高濃度MeJA對PPO的活性有抑制作用[29],本研究發(fā)現(xiàn)1 mmol/L和10 mmol/L MeJA均能誘導(dǎo)番茄葉片PPO活性,1 mmol/L MeJA處理組植株葉片PPO酶的活性隨著距離的增加而呈現(xiàn)減弱的趨勢,而10 mmol/L MeJA處理下,PPO酶的活性隨著距離的增加而增強(qiáng),也表明高濃度MeJA對PPO酶活性有抑制作用；斜紋夜蛾幼蟲體重增長率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明斜紋夜蛾幼蟲取食不同距離番茄葉片后,其體重增長率都顯著低于對照組斜紋夜蛾,相同時(shí)間段下均以取食10 mmol/L MeJA 處理的60 cm處番茄植株葉片的幼蟲體重增長率最低,而取食對照組不同距離間番茄植株葉片的斜紋夜蛾幼蟲,相同時(shí)間段下其體重增長率沒有明顯差異,這些結(jié)果說明MeJA揮發(fā)物對鄰近植株抗蟲性的誘導(dǎo)有距離效應(yīng),這種距離上的限制應(yīng)該是由MeJA的濃度逐漸降低引起的。

植食性昆蟲取食誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物,如一些綠葉揮發(fā)物、萜類化合物等,除了可以吸引害蟲的天敵外,還可以作為植物與植物間“交流”的信號物質(zhì),誘導(dǎo)相鄰植物產(chǎn)生防御反應(yīng)[30]。例如,預(yù)先用順式-3-己烯基乙酸酯cis-3-hexenyl acetate(z3HAC)熏蒸過的雜交楊樹苗葉片再被舞毒蛾(Lymantriadispar)幼蟲取食時(shí),葉片中茉莉酸和亞麻酸含量更高。此外,z3HAC 使得一些調(diào)控茉莉酸防御信號的基因處于防御警備狀態(tài),一旦昆蟲取食后這些基因迅速進(jìn)行高表達(dá)[31],這種通過某些生物或者非生物因子刺激警備后誘導(dǎo)植物產(chǎn)生更加快速和強(qiáng)烈的防御反應(yīng),即稱為防御誘發(fā)或防御警備(defense priming),是一種特殊的植物誘導(dǎo)防御策略[32]。胡永建等研究發(fā)現(xiàn)蟲害誘導(dǎo)馬尾松鄰枝的MeJA和萜烯類化合物含量升高[33]。茉莉酸類物質(zhì)浸種處理或直接噴施處理可以誘發(fā)植物防御,如研究發(fā)現(xiàn)預(yù)先用MeJA噴施處理的水稻植株,機(jī)械損傷時(shí),水稻胰蛋白酶抑制劑合成基因OsBBPI和過氧化物酶基因OsPOX迅速表達(dá),并發(fā)現(xiàn) MeJA 通過調(diào)控OsBBPI啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾來誘發(fā)水稻防御[34]。此外,植物被激發(fā)誘導(dǎo)獲得的抗性可能具有遺傳特性[35]。在擬南芥中,與未受激發(fā)誘導(dǎo)的植物相比,受到病原物侵染誘導(dǎo)的植物的后代其防御相關(guān)基因顯著表達(dá),植株抗性增強(qiáng)[36]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MeJA作為植株間的重要防御通訊信號,可以誘發(fā)增強(qiáng)鄰近番茄植株抗蟲酶活性,抑制斜紋夜蛾的取食,并且這種誘導(dǎo)作用有顯著的距離和濃度效應(yīng),隨著距離的增加和MeJA濃度的降低而呈現(xiàn)減弱的趨勢,然而,MeJA誘發(fā)鄰近不同距離間植株防御反應(yīng)的時(shí)間效應(yīng)及誘發(fā)的分子機(jī)制還有待深入研究。