卜 素,薛 泉,袁春穎,陳 穎,曹福亮

1.南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院,江蘇 南京 210037

2.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037

肥胖癥是一種慢性疾病，且會引起高血壓、心腦血管疾病、慢性炎癥和癌癥等多種并發(fā)癥，且發(fā)病率正逐年提高[1,2]。脂肪細胞是人體脂肪組織內(nèi)的一種重要細胞，具有儲存能量、支持緩沖、提供產(chǎn)熱的作用。但脂肪細胞數(shù)量的過度增加，前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化引起胞內(nèi)脂質(zhì)的過度積累而導致的體積增大會導致肥胖癥的發(fā)生[3]。脂肪沉積被認為是肥胖發(fā)展的關(guān)鍵步驟，控制這一步驟將能夠有效地控制肥胖的進程[4]。

3T3-L1 細胞是一種分離自小鼠胚胎的前脂肪細胞，能夠特異性分化為成熟脂肪細胞，是一種國際公認的研究細胞脂質(zhì)代謝的模式細胞[5]。在3T3-L1 前脂肪細胞的分化過程中，多種轉(zhuǎn)錄因子和酶在脂質(zhì)的生成和代謝中起重要作用。當轉(zhuǎn)錄因子CAAT 增強子結(jié)合蛋白α（CAAT-enhancer-bindingprotein α，C/EBPα）[6]、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ）[7]和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP-1c）[8]被激活后，位于其下游的一些與脂肪合成相關(guān)的酶和蛋白被激活，胞內(nèi)的脂質(zhì)開始積累[9]。其中，乙酰輔酶A羧化酶1（acetyl-CoA carboxylase 1，ACC1）是脂肪酸合成第一階段的關(guān)鍵限速酶，能夠促進長鏈脂肪酸的合成，用于合成甘油三酯和磷脂[10]，脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）是一種催化脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，催化丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A生成長鏈脂肪酸[11]、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter type 4，GLUT-4）主要存在于脂肪細胞和肌肉細胞中，在受到胰島素刺激后，由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜上進行葡萄糖轉(zhuǎn)運[12]、脂滴包被蛋白（lipid droplet-associated protein A，Perilipin A）是一種細胞分化后期覆蓋于脂滴表面，防止脂質(zhì)被胞內(nèi)脂肪酶水解的重要蛋白[13]，以上都是脂質(zhì)合成過程的關(guān)鍵酶和蛋白。

銀杏（Ginkgo biloba）作為一種藥食同源的植物，在我國已有數(shù)千年的利用歷史，上世紀六七十年代，德國科學家Willmar Schwabe 首先開發(fā)了一種銀杏葉提取物（EGB761），對其主要活性成分的含量都做出了規(guī)定，其中銀杏黃酮的含量不低于24%，銀杏內(nèi)酯的含量不低于6%，銀杏酚酸的含量小于0.001‰。EGB761 被證明具有抗氧化、抗衰老和保護心腦血管等藥理作用[14-17]。黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一種化合物[18]，EGB 中三種主要黃酮類成分是槲皮素、山奈酚和異鼠李素，它們也存在于很多天然植物中，且具有多種生物活性[19-21]。研究證實，銀杏葉提取物對3T3-L1前脂肪細胞有一定的增殖抑制作用[22-24]，但是其中主要活性單體對3T3-L1 細胞脂質(zhì)積累的影響和機理還未得到充分闡述。抑制脂肪組織中脂肪細胞的數(shù)量增多（細胞增殖）和體積增大（細胞分化和脂質(zhì)積累）是肥胖防治中的重要靶點之一。本研究將系統(tǒng)評估EGB 中三種銀杏黃酮對3T3-L1 前脂肪細胞增殖以及成脂分化方面的影響，并檢測對成脂分化起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平上的變化，為后續(xù)深入闡明銀杏黃酮調(diào)控脂質(zhì)代謝的機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

3T3-L1 前脂肪細胞株購自美國菌種保存中心（ATCC）；槲皮素、山奈酚和異鼠李素購自上海同田生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、DPBS 磷酸鹽緩沖液、0.25%含EDTA 胰酶、青霉素和鏈霉素雙抗和胎牛血清購自美國Gibco 公司；噻唑藍（MTT）、胰島素（Insulin）、地塞米松（DEX）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）和油紅O 粉末購自美國Sigma 公司；RNA 提取試劑盒（MiniBEST Univrsal RNA Extraction Kit）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Master Mix）、qPCR 試劑盒（TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ）購自日本TaKaRa 公司；多功能酶標儀（FilterMax F5）購自美國Molecular Devices、實時熒光定量PCR 儀（Step One Plus）購自美國Applied Biosystems 公司，引物由南京擎科生物有限公司合成。

1.2 3T3-L1 前脂肪細胞的培養(yǎng)和誘導分化

在DMEM 培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗使其終濃度分別為100 U/mL和100 μg/mL，于37 ℃、5%CO2和一定濕度的條件下培養(yǎng)3T3-L1 細胞。在細胞長滿2 d 后，加入細胞分化液一（DMEM 高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%雙抗、10 μg/mL 胰島素、1 μmol/L DEX、0.5 mM IBMX）誘導分化3 d。3 d 后換用細胞分化液二（DMEM 高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%雙抗、10 μg/mL 胰島素）繼續(xù)誘導分化2 d，2 d 后換用分化液三（DMEM 高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%雙抗）繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d 換液至分化結(jié)束[25]。

1.3 MTT 法檢測三種黃酮對3T3-L1 細胞活性的影響

當3T3-L1 前脂肪細胞在96 孔板中的融合率達到70%時，換用含有不同濃度（0.5、1、10、25、50 和100 μmol/L）三種黃酮（槲皮素、山奈酚、異鼠李素）的DMEM 低糖培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1%雙抗）培養(yǎng)處理細胞24 h。處理結(jié)束后，在每孔中加入50 μL 濃度為1 mg/mL 的MTT 溶液，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。倒去廢液，每孔加入200 μL 的DMSO 溶液，37 ℃，800 rpm 恒溫震蕩10 min，使結(jié)晶甲瓚充分溶出后，用酶標儀于595 nm 處檢測吸光值。對于成熟脂肪細胞，當3T3-L1 細胞分化為成熟脂肪細胞后，將培養(yǎng)基換為含有不同濃度各單體的DMEM 高糖培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1%雙抗），在給藥處理24 h 后，用和前脂肪細胞相同的方法檢測吸光值[26]。細胞活力計算公式為：細胞活力=（每個樣品讀數(shù)-調(diào)零平均）/（對照組平均-調(diào)零平均）×100%

1.4 油紅O 染色及脂質(zhì)積聚半定量檢測

細胞分化過程中，在換分化液二和分化液三時，同時分別添加50 μmol/L 的槲皮素、山奈酚和異鼠李素直至細胞分化結(jié)束。用PBS 清洗細胞2 次后，用10%的甲醛水溶液固定細胞1 h，后用濃度為0.3 mg/mL 的新鮮配制的油紅O 染色液與超純水按照3：2 的比例混勻，配制成油紅O 工作液，對固定好的細胞進行染色。室溫染色2 h，用蒸餾水洗去浮色并拍照[27]。拍照結(jié)束，加入異丙醇溶解細胞中的油紅O，吸出溶解液，在酶標儀中于510 nm 處測定吸光值[28]，給藥組和對照組（未經(jīng)給藥處理）吸光值的比值（%）為細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的半定量結(jié)果。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量

按照試劑盒說明提取對照組和分化過程中給藥組3T3-L1 細胞的RNA，用微量分光光度計測定RNA 的濃度和純度。按照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄（20 μL 體系，500 ng RNA，37 ℃45 mins，85 ℃1 min），合成cDNA。qPCR 按照20 μL 的反應體系進行。反應條件如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個循環(huán)。采用相對定量法（ΔΔCT）進行數(shù)據(jù)分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參計算目的基因的表達量變化（2-ΔΔCT）[29]。熒光定量引物序列見表1。

1.6 統(tǒng)計分析

采用統(tǒng)計軟件Excel 對實驗結(jié)果進行分析，結(jié)果以均值±標準差表示，每個實驗都進行了3 次重復。數(shù)據(jù)經(jīng)過t檢驗分析，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGB 中三種黃酮對3T3-L1 細胞活力的影響

圖1 銀杏葉提取物中三種黃酮對3T3-L1 前脂肪細胞的增殖抑制影響Fig.1 Inhibitory effect of three flavonoids in Ginkgo biloba extract on the proliferation of 3t3-l1 preadipocytes

圖2 銀杏葉提取物中三種黃酮對3T3-L1 成熟脂肪細胞的毒性影響Fig.2 Cytotoxicity of three flavonoids from Ginkgo biloba extract on 3T3-L1 mature adipocytes

2.2 EGB 中三種黃酮對3T3-L1 細胞分化過程中胞內(nèi)脂質(zhì)積累的影響

如圖1，前脂肪細胞的MTT 結(jié)果顯示，山奈酚(Kae)和槲皮素（Que）在100 μmol/L 的條件下，對細胞的增殖起一定的抑制作用；異鼠李素(Iso)則在0～100 μmol/L 的處理條件下對前脂肪細胞的增殖基本沒有影響；在低濃度處理條件下，三種銀杏黃酮則對前脂肪細胞的增殖幾乎沒有抑制作用。說明3T3-L1 前脂肪細胞的增殖受三種銀杏黃酮的影響不大，僅山奈酚和槲皮素在高濃度（100 μmol/L）下有一定的抑制作用。如圖2，成熟脂肪細胞的MTT 結(jié)果顯示，山奈酚對成熟脂肪的毒性呈梯度依賴，當給藥濃度越高，表現(xiàn)出的細胞毒性越大，100 μmol/L 濃度的山奈酚處理后，細胞毒性達到44%；異鼠李素僅在100 μmol/L 的濃度下表現(xiàn)出了14%的細胞毒性；槲皮素在0.5 μmol/L 和100 μmol/L 的條件下表現(xiàn)出了較高的細胞毒性，細胞毒性分別為21%和25%。異鼠李素和槲皮素在實驗中的其余濃度下細胞毒性不明顯。因此，高濃度的槲皮素、異鼠李素和山奈酚對成熟脂肪細胞有一定的細胞毒性，且山奈酚的細胞毒性較大。但槲皮素在微量濃度下也具有一定的細胞毒性，其具體作用機制暫不明確，還需要進一步的研究來證明其具體作用機制。

如圖3，經(jīng)過三種銀杏黃酮處理的3T3-L1 細胞，其與對照組相比，細胞內(nèi)脂滴的數(shù)量明顯減少，細胞的分化狀態(tài)較差，只有少部分的細胞成功分化。如圖4，油紅半定量結(jié)果顯示：在相同的濃度下（50 μmol/L），異鼠李素對細胞脂質(zhì)積累的抑制效果最明顯（43%），山奈酚次之（29%），槲皮素的作用效果較弱（17%），且都有統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果提示，三種銀杏黃酮對3T3-L1 前脂肪細胞的分化均起抑制作用，且在相同濃度下對脂質(zhì)積累的抑制程度各不相同。

圖3 三種銀杏黃酮處理后3T3-L1 細胞的油紅O 染色結(jié)果（200×）Fig.3 Oil Red O staining results of 3t3-l1 cells treated with three ginkgo flavones（200×）

圖4 銀杏葉提取物中三種黃酮對3T3-L1 前脂肪細胞成脂分化的影響Fig.4 Effects of three flavonoids in Ginkgo bilobaextract on adipogenic differentiation of 3t3-l1 preadipocytes

2.3 EGB 中三種黃酮對3T3-L1 前脂肪細胞分化中轉(zhuǎn)錄因子mRNA 水平的影響

如圖5，槲皮素、山奈酚和異鼠李素在低濃度（0.5 μmol/L）和較高濃度（50 μmol/L）給藥的條件下都能顯著降低C/EBPα的表達水平，其相對表達量都為對照組的10%左右，且均具有統(tǒng)計學意義。如圖6，槲皮素和異鼠李素在低濃度時對轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的影響不明顯，山奈酚在0.5 μmol/L 時，對PPARγ的表達有一定的促進作用，但無統(tǒng)計學意義；但在50 μmol/L 濃度給藥時，槲皮素和山奈酚能夠較明顯地抑制PPARγ的表達。如圖7，三種黃酮在低濃度時對SREBP-1c 的表達量影響不大，在50 μmol/L 的濃度下，對SREBP-1c 有一定的抑制作用，其中槲皮素和異鼠李素有相近的抑制效果，山奈酚的抑制效果較次。以上結(jié)果表明，三種銀杏黃酮在低濃度下對轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα的抑制作用明顯，而對PPARγ和SPEBP-1c 的抑制作用不明顯；在較高濃度下，三種銀杏黃酮對C/EBPα、PPARγ和SPEBP-1c 這三個轉(zhuǎn)錄因子的表達均能顯著地抑制其表達。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列Table 1 Primer sequence of real-time fluorescence quantification PCR

圖5 銀杏葉提取物三種黃酮對轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα的影響Fig.5 Effect of three flavonoids inGinkgo bilobaextract on C/EBPα

圖6 銀杏葉提取物三種黃酮對轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的影響Fig.6 Effect of three flavonoids inGinkgo bilobaextract on PPARγ

圖7 銀杏葉提取物三種黃酮對轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c的影響Fig.7 Effects of three flavonoids fromGinkgo bilobaextracton

2.4 EGB 中三種黃酮對成脂基因表達量的影響

如圖8，與對照組相比，槲皮素和異鼠李素在0.5 μmol/L 的低濃度下，對ACC1 的表達有少許促進作用，山奈酚在此濃度下對ACC1 的表達影響不大，然而在50 μmol/L 的濃度下，三種銀杏黃酮對ACC1 的表達都表現(xiàn)出了一定的抑制作用。如圖9 和10 所示，三種銀杏黃酮處理后FASN 和GLUT-4 的表達都下調(diào)，且三種黃酮對GLUT-4 基因表達的抑制作用都呈現(xiàn)劑效關(guān)系。如圖11，槲皮素對Perilipin A 的表達起抑制作用，0.5 μmol/L 濃度的山奈酚對Perilipin A 的表達起一定的促進作用，異鼠李素對其表達沒有明顯影響。以上結(jié)果提示，三種銀杏黃酮在50 μmol/L 較高濃度下，均能夠通過下調(diào)ACC1 和FASN 的表達來抑制胞內(nèi)脂肪酸的合成，同時能夠通過下調(diào)GLUT-4 的表達來減少細胞對外界葡萄糖的轉(zhuǎn)運，從而減少胞內(nèi)脂質(zhì)合成的能量來源。槲皮素能夠下調(diào)Perilipin A的表達，減少對胞內(nèi)脂滴的保護作用，此結(jié)果提示槲皮素可能對胞內(nèi)脂質(zhì)的水解有促進作用，而山奈酚和異鼠李素不能抑制Perilipin A 的表達。在0.5 μmol/L 的低濃度下，ACC1 的表達未被抑制，說明在該濃度下，三種銀杏黃酮對脂肪酸的從頭合成無顯著影響。

圖8 銀杏葉提取物中三種黃酮對ACC1 的影響Fig.8 Effects of three flavonoids in Ginkgo biloba extract on ACC1

圖9 銀杏葉提取物主要黃酮對FASN 的影響Fig.9 Effects of main flavonoids in Ginkgo biloba extract on FASN

圖10 銀杏葉提取物主要黃酮對GLUT-4 的影響Fig.10 Effect of Three Flavonoids in Ginkgo biloba extract on GLUT-4

圖11 銀杏葉提取物主要黃酮對Perilipin A 的影響Fig.11 Effect of main flavonoids in Ginkgo biloba extract on Perilipin A

3 討論

肥胖是一種全球范圍內(nèi)發(fā)病率不斷增高的慢性疾病[30-32]，前脂肪細胞的增殖和脂肪細胞中脂質(zhì)的增加是導致肥胖癥發(fā)病的主要原因，因此，抑制前脂肪細胞的增殖和改善脂肪細胞中的脂質(zhì)代謝是治療肥胖的兩個主要的方向。有研究表明，銀杏葉提取物對3T3-L1 前脂肪細胞的增殖有抑制作用，但是其主要活性單體的作用和機理還未得到詳盡的闡述。

C/EBPα和PPARγ是調(diào)控3T3-L1 前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在細胞分化的終末期大量表達。C/EBPα和PPARγ兩者存在相互作用的關(guān)系，PPARγ的表達會誘導C/EBPα的表達[33]。轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c 對FASN 的激活起著重要作用，SREBP-1c 表達量的上調(diào)會促進FASN 的合成，以促進細胞內(nèi)脂質(zhì)的積累[34]。GLUT-4 是位于細胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，C/EBPα、PPARγ和SREBP-1c 均可與其啟動子結(jié)合以激活其表達[35]。

ACC1 在脂肪細胞中大量表達，催化生成的丙二酰輔酶A 是長鏈脂肪酸合成和延伸的重要C2底物，是影響3T3-L1 細胞脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵蛋白[36,37]。Perilipin A 則是細胞分化終末期的脂滴包被蛋白，對分化終末期脂質(zhì)的積累起重要作用，能夠?qū)麅?nèi)的脂滴包裹起來，避免胞內(nèi)的脂肪水解酶的水解以維持胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的平衡偏向脂質(zhì)積累[38]。

本研究的實驗結(jié)果表明，山奈酚和槲皮素都對前脂肪細胞的增殖有一定的抑制作用，山奈酚對成熟脂肪細胞表現(xiàn)出濃度依賴的細胞毒性，槲皮素對成熟脂肪細胞具有沒有劑量關(guān)系的細胞毒性，而異鼠李素在僅在高濃度時對成熟脂肪細胞有細胞毒性。在mRNA 水平，三種黃酮在較高濃度處理后，均會下調(diào)3T3-L1 細胞分化過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達水平，尤其是C/EBPα，其相對表達量僅為對照組的10%左右，并由此導致這些轉(zhuǎn)錄因子下游與脂質(zhì)積聚相關(guān)蛋白和酶的基因表達也受到一定的抑制。三種黃酮在較低濃度時，對其下游的抑制作用表現(xiàn)不明顯。異鼠李素在50 μmol/L 的較高濃度下，通過抑制C/EBPα、SREBP-1c、ACC1、FASN 和GLUT-4 的表達來抑制胞內(nèi)的脂質(zhì)合成和細胞分化進程。槲皮素與山奈酚在mRNA 層面與異鼠李素有類似的作用效果，且在高濃度時二者能夠下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的表達，同時槲皮素還對Perilipin A 的表達也有較好的抑制效果。在細胞水平，三種黃酮對3T3-L1 前脂肪細胞分化過程中脂質(zhì)的積累都起到了一定程度的抑制作用。綜上所述，槲皮素、異鼠李素和山奈酚這三種銀杏黃酮能夠抑制3T3-L1 細胞的成脂分化，但其抑制效果和抑制方式各不相同。本結(jié)果初步評估了銀杏葉提取物中三種黃酮對3T3-L1 脂肪細胞脂質(zhì)代謝的影響，深入的作用機制和對肥胖癥的影響還需要進一步的實驗來證明。

4 結(jié)論

本研究系統(tǒng)評估了銀杏葉提取物中三種黃酮——山奈酚、異鼠李素和槲皮素對3T3-L1脂肪細胞成脂代謝的影響。結(jié)果表明三種銀杏黃酮對3T3-L1細胞的主要影響方式是對成熟脂肪的細胞毒性、較高濃度時對前脂肪細胞的增殖抑制、以及下調(diào)主導脂肪細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子及脂質(zhì)生成相關(guān)基因的表達。三種黃酮對3T3-L1細胞的成脂分化作用各有不同，我們推測在銀杏葉提取物中，黃酮類組分通過協(xié)同效應達到改善脂質(zhì)代謝和脂質(zhì)過度積累的效果，同時提示杏葉提取物在肥胖的預防治療中具有潛在的價值。