王 欣 孟玉倩 - 徐寶成,2,3 -,2,3 羅登林,2,3 -,2,3 付元哲 an- 李夢杰 - 韋玉花 - 焦玉曼 -
(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽 471000;2. 食品加工與安全國家級實驗教學(xué)示范中心,河南 洛陽 471000;3. 河南省食品原料工程技術(shù)研究中心,河南 洛陽 471000)
牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是毛茛科、芍藥屬植物,盛產(chǎn)于河南洛陽,除具有觀賞價值外,鳳丹(Paeoniaostia)和紫斑(Paeoniarockii)等油用牡丹的種籽還含有豐富的油脂,其中α-亞麻酸含量高達(dá)41%、油酸和亞油酸約占25%[1-3]。此外,牡丹籽油中還含有豐富的功能活性成分,如植物甾醇、生育酚、牡丹酚等,具有降血糖、降血脂、預(yù)防心血管疾病、抗癌等功效,備受消費(fèi)者青睞[4-6]。
目前提取牡丹籽油常用的方法有物理壓榨法、溶劑浸出法、超臨界CO2萃取法以及水酶法等[7-8]。物理壓榨法是一種傳統(tǒng)的制油方法,工藝相對簡單,所制得的油脂無溶劑殘留,但存在出油率低、餅粕中殘油量高、能耗高的缺點[9]。溶劑浸出法提油得率雖高,但流程復(fù)雜,所得油脂需要經(jīng)過脫溶及一系列復(fù)雜的精煉工序,不僅造成植物甾醇、生育酚等活性成分的大量損失,而且還存在溶劑殘留的風(fēng)險,對人體健康不利。超臨界CO2萃取法雖然無毒無害無殘留,但其使用的設(shè)備昂貴,生產(chǎn)成本高,工業(yè)化應(yīng)用受到極大限制[10-12]。而水酶法作用條件溫和,可避免高溫等極端條件對熱敏性功能物質(zhì)的破壞,所得油脂營養(yǎng)價值高、口感好[13]。目前,有關(guān)水酶法提油主要集中于酶的選擇[14]、加酶量[14-15]、基質(zhì)濃度[15-16]、反應(yīng)溫度和時間[14,16]、體系pH[16]等方面的研究,可實現(xiàn)從多種油料種子或組織結(jié)構(gòu)中提取油脂,出油率為28.8%~78.5%。在水酶法提取牡丹籽油方面,一些學(xué)者已開展了相關(guān)研究,如通過超聲波預(yù)處理[17]、高溫蒸煮[18]、微波[19]輔助等手段來提高水酶法提取牡丹籽油的得率。然而,從現(xiàn)有研究[20-21]來看,水酶法提取牡丹籽油的得率和油脂品質(zhì)仍有進(jìn)一步提高的空間。目前,影響水酶法提油得率進(jìn)一步提高的關(guān)鍵因素是如何在牡丹籽預(yù)處理時充分破壞其細(xì)胞結(jié)構(gòu),暴露更多的酶促反應(yīng)位點,從而提高酶解效率和出油率。高溫堿煮和蒸汽爆破技術(shù)目前已在食品原料預(yù)處理中得到了應(yīng)用,可以充分溶脹和破壞原料的組織結(jié)構(gòu),有利于人體消化和功能營養(yǎng)成分的吸收[22]。然而,這兩項技術(shù)在水酶法提油原料預(yù)處理上的應(yīng)用尚未見報道。
為了進(jìn)一步提高水酶法提取牡丹籽油的出油率及油脂品質(zhì),研究擬在水酶法提取牡丹籽油的基礎(chǔ)上,采用高溫堿煮聯(lián)合蒸汽爆破技術(shù)對牡丹籽原料進(jìn)行預(yù)處理,以期進(jìn)一步提高牡丹籽油的出油率及油脂品質(zhì)。
1.1.1 材料與試劑
牡丹籽:鳳丹,2019年產(chǎn)于河南洛陽;
商品牡丹籽油1:菏澤超臨界初萃油,市售;
商品牡丹籽油2:瑞璞壓榨油,市售;
α-淀粉酶:酶活力4 000 U/g,上海源葉生物科技有限公司;
糖化酶:酶活力1.0×105U/g,上海源葉生物科技有限公司;
檸檬酸、碳酸氫鈉、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、石油醚、正已烷、乙醚、異丙醇、冰乙酸、三氯甲烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉、1-甲基咪唑等:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;
膽固醇:純度99%,美國Sigma-Aldrich公司;
菜油甾醇:純度98%,美國Sigma-Aldrich公司;
β-谷甾醇:純度≥97%,美國Sigma-Aldrich公司;
豆甾醇:純度95%,美國Sigma-Aldrich公司;
37種脂肪酸甲酯混標(biāo)、膽甾烷醇、N-甲基-N-三甲基硅烷七氟丁酰胺:分析純,美國Sigma-Aldrich公司。
1.1.2 主要儀器設(shè)備
蒸汽爆破機(jī):QB-200型,河南省鶴壁正道生物能源有限公司;
電熱鼓風(fēng)干燥箱:WGL-230B型,天津泰斯特儀器有限公司;
手提式壓力蒸汽滅菌器:DSX-280B型,上海申安醫(yī)療機(jī)械廠;
pH計:PHS-25型,上海儀電科學(xué)儀器有限公司;
數(shù)顯恒溫水浴鍋:HH-4型,常州天瑞儀器有限公司;
臺式高速離心機(jī):TG16-WS型,湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司;
高速多功能粉碎機(jī):CS-700型,武義海納電器有限公司;
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RE-52AA型,上海亞榮生化儀器廠;
電子天平:XBS320M-SCS型,瑞士Precisa公司;
干式氮吹儀:YY-N100型,上海允延儀器有限公司;
氣相色譜儀:7890A型,配備FID檢測器,美國安捷倫科技有限公司;
毛細(xì)管色譜柱:SP-2560(100 m×0.25 mm×0.2 μm)型,美國Sigma公司;
毛細(xì)管色譜柱:HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)型,美國安捷倫科技有限公司。
1.2.1 提取工藝路線
牡丹籽→脫殼→高溫堿煮→過濾→烘干→粉碎→兩步酶解→滅酶→乙醇輔助提取→去醇→離心→冷凍破乳→清油
1.2.2 操作要點及參數(shù)
(1) 高溫堿煮:取100 g脫殼牡丹籽加入到1 L錐形瓶中,按一定料液比,分別加入一定濃度的碳酸氫鈉溶液,于0.02 MPa、105 ℃的高壓滅菌鍋中處理40 min后取出。
(2) 過濾、烘干、粉碎:收集預(yù)堿煮后的牡丹籽,置于60 ℃恒溫干燥箱干燥5 h,然后粉碎過40目篩,所得牡丹籽粉密封后避光置于4 ℃冰箱,待處理。在粉碎過程中應(yīng)注意防止粉碎機(jī)溫度過高造成牡丹籽油氧化。
(3) 酶解、滅酶:根據(jù)文獻(xiàn)[23]修改如下,取20.00 g牡丹籽粉,以料液比1∶7 (g/mL)加入蒸餾水混合均勻,加入2.75%(基于牡丹籽粉的質(zhì)量濃度)α-淀粉酶,調(diào)整pH至5.5,于70 ℃酶解1 h;然后再加入2.50%(基于牡丹籽粉的質(zhì)量濃度)糖化酶,調(diào)整pH至4.5,于60 ℃酶解1 h。結(jié)束后,直接升溫至90 ℃,處理15 min滅酶。
(4) 乙醇輔助提取及去醇:按料液比1∶5 (g/mL)加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液,調(diào)整pH至9.0,于60 ℃提取1 h。然后于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1.5 h去醇。
(5) 離心、破乳:將去醇后的試樣分至離心管中,于5 000 r/min 離心15 min,得到清油、乳相、水相和渣相。收集第一次離心所得乳相,于-20 ℃冷凍18 h,再在50 ℃ 解凍破乳2 h,而后于3 000 r/min離心20 min,取出上層清油。合并兩次離心得到的清油,計算出油率。
1.2.3 高溫堿煮條件優(yōu)化
(1) 堿液濃度:稱取100 g脫殼牡丹籽,固定料液比1∶5 (g/mL),乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%,考察碳酸氫鈉溶液濃度(0.01,0.03,0.05,0.07,0.09 mol/L)對出油率的影響。
(2) 料液比:稱取100 g脫殼牡丹籽,固定碳酸氫鈉溶液濃度0.05 mol/L,乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%,考察料液比[1∶3,1∶5,1∶7 (g/mL)]對出油率的影響。
(3) 乙醇體積分?jǐn)?shù):稱取100 g脫殼牡丹籽,固定料液比1∶5 (g/mL),碳酸氫鈉溶液濃度為0.05 mol/L,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(30%,35%,40%,45%)對出油率的影響。
以上試驗均平行3次。
試驗比較高溫堿煮、高溫水煮和高溫酸煮3種預(yù)處理方法對水酶法提取牡丹籽油出油率的影響。其中,高溫堿煮工藝參數(shù)參照研究優(yōu)化結(jié)果,高溫水煮和高溫酸煮分別參照文獻(xiàn)[18]和[23]的具體工藝流程,即分別選取去離子水、0.05 mol/L檸檬酸溶液作為牡丹籽預(yù)處理時的高溫蒸煮溶劑,其中高溫水煮溫度為115 ℃、時間60 min[18],高溫酸煮溫度為110 ℃、時間30 min[23],其余參數(shù)同1.2.2。
1.4.1 提取工藝路線
牡丹籽→脫殼→高溫堿煮→過濾→蒸汽爆破→烘干→粉碎→兩步酶解→滅酶→乙醇輔助提取→去醇→離心→冷凍破乳→清油
1.4.2 操作要點及參數(shù)
(1) 高溫堿煮:取100 g脫殼牡丹籽加入到1 L錐形瓶中,按料液比1∶5 (g/mL)加入0.05 mol/L的碳酸氫鈉溶液,于0.02 MPa、105 ℃的高壓滅菌鍋中處理40 min后取出。
(2) 過濾、蒸汽爆破:過濾并收集預(yù)堿煮后的牡丹籽,然后置于蒸汽爆破機(jī)中,通入飽和水蒸汽,在一定的爆破壓力下維壓一定時間,保壓完成后在極短時間內(nèi)(0.093 5 s)完成釋壓,實現(xiàn)蒸汽爆破。
(2) 烘干、粉碎、兩步酶解、滅酶、乙醇輔助提取、去醇、離心、冷凍破乳等步驟的操作要點及參數(shù)同1.2.2。
1.4.3 蒸汽爆破參數(shù)優(yōu)化 為進(jìn)一步破壞牡丹籽的細(xì)胞結(jié)構(gòu),暴露更多的酶促反應(yīng)位點,提高后續(xù)酶解效果,將牡丹籽在最優(yōu)條件下先進(jìn)行高溫堿煮,經(jīng)冷卻過濾后,再進(jìn)行蒸汽爆破處理。試驗參數(shù)設(shè)置:
(1) 蒸汽爆破壓力:將經(jīng)過堿煮的牡丹籽置于蒸汽爆破機(jī)中,通入飽和水蒸汽,分別選取0.3,0.5,0.7 MPa的壓力,維壓30 s,保壓完成后完成釋壓,實現(xiàn)蒸汽爆破。將經(jīng)過蒸汽爆破的牡丹籽烘干、粉碎后,完成后續(xù)水酶法提油,考察不同爆破壓力對出油率的影響。
(2) 蒸汽爆破維壓時間:固定蒸汽爆破壓力為0.3 MPa,考察維壓時間(0.5,1.0,3.0,5.0 min)對出油率的影響;其余流程同1.4.3(1)。
以上試驗均平行3次。
1.5.1 出油率計算
(1)
式中:
c——出油率,%;
m1——所得清油的質(zhì)量,g;
m2——牡丹籽中粗脂肪的質(zhì)量,g。
1.5.2 牡丹籽脂肪含量 參照GB/T 5512—2008。
1.5.3 折光系數(shù) 參照GB/T 5527—2010。
1.5.4 相對密度 參照GB/T 5526—1985。
1.5.5 碘值 參照GB/T 5532—2008。
1.5.6 皂化值 參照GB/T 5534—2008。
1.5.7 透明度和色澤 參照GB/T 5525—2008。
1.5.8 酸價 參照GB 5009.229—2016。
1.5.9 過氧化值 參照GB 5009.227—2016。
1.5.10 脂肪酸 參照GB 5009.168—2016。
1.5.11 植物甾醇 參照GB/T 25223—2010。
所有試驗均進(jìn)行3次獨立平行測定,其結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin 8.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理和作圖。
2.1.1 堿液濃度 由圖1可知,牡丹籽油的出油率隨堿液濃度的升高呈先增后降的趨勢。其中,當(dāng)碳酸氫鈉濃度從0.01 mol/L提高至0.05 mol/L時,出油率從31.92% 增加到74.55%,可能是由于隨著堿液濃度的增加,牡丹籽細(xì)胞晶體結(jié)構(gòu)被破壞的程度越來越大,利于后續(xù)酶促反應(yīng)時酶與底物的接觸,從而加速油脂的釋放量。然而,隨著堿液濃度的進(jìn)一步提高,出油率則出現(xiàn)下降的趨勢,如堿液濃度為0.09 mol/L時,出油率下降為52.14%,可能是由于過高的堿液濃度增加了淀粉的糊化,并在后續(xù)干燥過程中脫水老化,與酯類和蛋白質(zhì)等形成老化復(fù)合物,包裹了酶促反應(yīng)位點,使后續(xù)酶解反應(yīng)效率下降,阻礙油脂的釋放。因此,高溫堿煮預(yù)處理時碳酸氫鈉最佳濃度為0.05 mol/L。
圖1 碳酸氫鈉濃度對出油率的影響
2.1.2 料液比 當(dāng)牡丹籽與碳酸氫鈉溶液的料液比為1∶3 (g/mL) 時,牡丹籽細(xì)胞結(jié)構(gòu)不能被充分溶脹破壞,糖酯、糖蛋白和淀粉顆粒的酶反應(yīng)位點不能完全暴露,導(dǎo)致后續(xù)酶促反應(yīng)效率下降,油脂釋放量也隨之減少,出油率為58.12%。當(dāng)料液比上升至1∶5 (g/mL)時,牡丹籽能夠充分溶脹,細(xì)胞晶體結(jié)構(gòu)被破壞,利于后續(xù)酶解反應(yīng)和油脂的釋放,出油率提高至74.55%(圖2)。當(dāng)液料比進(jìn)一步提高到1∶7 (g/mL)時,出油率則下降至65.37%,可能是由于碳酸氫鈉溶液的進(jìn)一步增加,導(dǎo)致加熱過程中釋放過多的二氧化碳?xì)怏w,使得實際蒸煮溫度低于105 ℃,降低了牡丹籽細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞程度,導(dǎo)致后續(xù)酶解反應(yīng)效率下降,出油率降低。另外,過高的料液比也需要相應(yīng)增加高溫?zé)崽幚碓O(shè)備的容量,熱能消耗也隨之增加。因此,較優(yōu)的料液比為1∶5 (g/mL)。
圖2 料液比對出油率的影響
2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù) 如圖3所示,牡丹籽的出油率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時,出油率為63.63%;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)提高到35%時,出油率增加到74.55%,表明乙醇起到了良好的破乳效果,其主要機(jī)理:乙醇具有較強(qiáng)的極性,加入到酶解后的溶液中可使體系中原本穩(wěn)定的水包油型乳狀液失穩(wěn),促使油滴釋放和聚集,從而提高出油率[24-25]。然而,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加,牡丹籽的總出油率出現(xiàn)下降趨勢,如乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%時,牡丹籽出油率僅為65.38%。說明乙醇體積分?jǐn)?shù)也并非越高越好,過高濃度的乙醇不僅不能提高出油率而且還會增加后續(xù)乙醇的回收難度,增加能耗。因此,選取的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%。
圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對出油率的影響
由圖4可知,高溫水煮預(yù)處理,牡丹籽水酶法提油率明顯低于酸煮或堿煮方式,其中堿煮法出油率最高,為74.55%。這可能與高溫堿煮條件下牡丹籽細(xì)胞結(jié)構(gòu)更易被溶脹破壞,暴露更多的酶促反應(yīng)位點,利于后續(xù)酶解反應(yīng)和油脂的釋放有關(guān)。
圖4 蒸煮方式對出油率的影響
2.3.1 蒸汽爆破壓力 如圖5所示,當(dāng)蒸汽爆破壓力從0.0 MPa(未經(jīng)爆破處理)增加到0.3 MPa時,牡丹籽的出油率顯著增加,從74.55%增加到82.07%,可能是由于爆破進(jìn)一步破壞了牡丹籽的細(xì)胞結(jié)構(gòu),暴露了更多的酶促反應(yīng)位點,提高了后續(xù)酶解效果和油脂釋放量。然而,進(jìn)一步增加爆破壓力(0.3~0.7 MPa),牡丹籽的出油率則呈逐漸下降的趨勢,如爆破壓力提高至0.7 MPa時,牡丹籽的出油率僅為67.84%,可能是過高的爆破壓力使牡丹籽中的蛋白質(zhì)發(fā)生變性和交聯(lián),同時導(dǎo)致淀粉發(fā)生糊化并在后續(xù)干燥過程中發(fā)生老化和交聯(lián),隱藏酶反應(yīng)位點,使包裹其中的油脂不易釋放出來。因此,選擇的最優(yōu)蒸汽爆破壓力為0.3 MPa。
圖5 蒸汽爆破壓力對出油率的影響
2.3.2 蒸汽爆破維壓時間 如圖6所示,當(dāng)維壓時間從0 s 增加到30 s時,能顯著提高牡丹籽的出油率,但繼續(xù)增加維壓時間則會導(dǎo)致出油率的下降,并且維壓時間越長,出油率越低,如當(dāng)維壓時間為5 min時,出油率僅為67.19%。這主要是由于維壓時間過長導(dǎo)致牡丹籽中的淀粉發(fā)生糊化并在后續(xù)干燥時發(fā)生老化和交聯(lián),同時還會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性和交聯(lián),隱藏酶反應(yīng)位點,使包裹其中的油脂不易釋放出來,導(dǎo)致出油率下降。因此,最優(yōu)的蒸汽爆破維壓時間為30 s。
圖6 蒸汽爆破處理時間對出油率的影響
綜上,原料經(jīng)高溫堿煮聯(lián)合蒸汽爆破處理后,牡丹籽水酶法提油的出油率得到顯著提高,最高為82.07%。
2.4.1 牡丹籽油的質(zhì)量和特征指標(biāo) 高溫堿煮聯(lián)合蒸汽爆破輔助水酶法提取所得牡丹毛油與2種商品牡丹籽油的主要質(zhì)量和特征指標(biāo)檢測結(jié)果如表1所示。3種牡丹籽油在4 ℃均呈金黃色、透明、液態(tài)狀,相對密度(20 ℃)為0.913~0.933,過氧化值和酸值均符合中國糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)牡丹籽油(LS/T 3242—2014)一級標(biāo)準(zhǔn)的要求(過氧化值≤6.0 mmol/kg,酸值≤2.0 mg/g),證明油脂質(zhì)量好,這主要與試驗選用的牡丹籽新鮮度高(2019年產(chǎn))和水酶法提油條件溫和有關(guān)[26]。3種牡丹籽油的皂化值和碘值均符合牡丹籽油的典型特征,其中試驗所得牡丹籽油的碘值高于2種商品牡丹油的碘值,表明試驗所得牡丹籽油的不飽和度要比所選商品牡丹油的高,可能與牡丹籽的品種、產(chǎn)地等有關(guān)。
表1 牡丹籽油的主要質(zhì)量和特征指標(biāo)
2.4.2 牡丹籽油的脂肪酸和植物甾醇組成 高溫堿煮聯(lián)合蒸汽爆破輔助水酶法提取所得牡丹毛油與2種商品牡丹籽油的脂肪酸及植物甾醇組成和含量如表2、3所示。牡丹籽油中含量最為豐富的是α-亞麻酸,其次是亞油酸和油酸。試驗中,牡丹籽油總不飽和脂肪酸含量為88.57%~92.18%,其中單不飽和脂肪酸為23.14%~25.13%,多不飽和脂肪酸為63.82%~67.93%,而飽和脂肪酸含量僅為7.82%~11.43%,與文獻(xiàn)[27-28]報道中有關(guān)牡丹籽油脂肪酸組成和含量相似。由于含有豐富的α-亞麻酸、亞油酸和油酸,牡丹籽油被認(rèn)為具有重要的營養(yǎng)和生理調(diào)節(jié)功能[29]。
表2 牡丹籽油脂肪酸組成
牡丹籽油中含量最多的甾醇是△5-燕麥甾烯醇、其次是β-谷甾醇和24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇,它們在降低血清膽固醇水平、預(yù)防心血管病和抗癌方面具有有效的作用[30]。此外,水酶法所得牡丹籽油在甾醇總量和主要單個甾醇含量上均比商品牡丹籽油要高,可能與榨油所用牡丹籽的品種、產(chǎn)地以及提油方法有關(guān)。試驗所用水酶法條件溫和,未經(jīng)高溫精煉,對油中甾醇的保護(hù)具有重要的作用??傊邷貕A煮—蒸汽爆破輔助水酶法所得的牡丹籽油品質(zhì)優(yōu)良,植物甾醇等功能物質(zhì)保留率高,具有很高的營養(yǎng)價值。該毛油只需要經(jīng)過簡單脫水處理即可達(dá)到牡丹籽成品油一級標(biāo)準(zhǔn),無需再經(jīng)過復(fù)雜的精煉工序。
表3 牡丹籽油主要植物甾醇的含量
脫殼牡丹籽在料液比為1∶5 (g/mL),碳酸氫鈉濃度為0.05 mol/L的堿液中經(jīng)高溫堿煮再聯(lián)合蒸汽爆破(爆破壓力0.3 MPa,維壓時間30 s)處理后,其細(xì)胞晶體結(jié)構(gòu)能被充分溶脹和破壞,暴露更多的酶促反應(yīng)位點,利于后續(xù)酶解反應(yīng)的發(fā)生,可加速淀粉、糊精和糖酯等物質(zhì)的水解,使油脂更易從結(jié)合和被包裹狀態(tài)中快速釋放出來,完成牡丹籽油的提取。該工藝條件下,牡丹籽清油得率為82.07%,油品質(zhì)高,符合中國糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)牡丹籽油(LS/T 3242—2014)一級指標(biāo)要求。同時,所得牡丹籽油中植物甾醇的含量顯著高于2種商品牡丹油的甾醇含量,具有更優(yōu)的保健功能作用。另外,試驗在酶解反應(yīng)時只使用了α-淀粉酶和糖化酶,后續(xù)可以進(jìn)一步研究淀粉酶、糖化酶、纖維素酶和蛋白酶的不同組合對酶解效果的影響,以考察能否進(jìn)一步提高出油率和油脂品質(zhì)。