沈思聰 羅佳璇 魏元浩 李志威 黃倩倩

（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225000）

近年來，為了提高動物生產(chǎn)效率、改善動物健康和減少畜牧生產(chǎn)對環(huán)境的負(fù)面影響，植物提取物作為飼料添加劑在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用成為了研究熱點(diǎn)之一。但是，植物提取物在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中存在含量少、提取工藝復(fù)雜、提取率低、產(chǎn)品純度差以及價(jià)格昂貴等問題。許多優(yōu)質(zhì)牧草中含有豐富的活性物質(zhì)，在反芻動物生產(chǎn)中可直接飼喂富含活性物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)牧草來解決這一問題。

百脈根（Lotus corniculatus L.）是一種富含縮合單寧的多年生豆科牧草，在我國南北地區(qū)均有栽培。其葉量豐富、產(chǎn)量高，尤其是其莖稈細(xì)軟，適口性和營養(yǎng)價(jià)值均優(yōu)于其他豆科牧草。而且，百脈根的生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，尤其是對肥力差、pH值較低或排水不良等貧瘠土壤的適應(yīng)能力要強(qiáng)于苜蓿等大多數(shù)豆科牧草。因此，在我國南方尤其是高溫多雨、苜蓿易爛根的平原地區(qū)，適宜推廣種植[1]。單寧是植物體內(nèi)一類復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同通常分為水解單寧、縮合單寧和間苯酚單寧三大類。單寧由于其適口性較差，易與蛋白質(zhì)、糖類和金屬離子等結(jié)合成難以消化吸收的復(fù)合物，降低動物的采食量和營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，長期以來一直被認(rèn)為是飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)日糧中含有適量的單寧不僅可以提高反芻動物蛋白質(zhì)利用率[2]、有效預(yù)防瘤胃臌脹病[3]和提高動物生產(chǎn)性能[4]，還可以減少反芻動物胃腸道寄生蟲病的發(fā)生[5]和減少甲烷的排放[6]，降低綿羊糞中大腸桿菌O157∶H7 的排泄量[7]。單寧對反芻動物的營養(yǎng)作用取決于其攝入量和化學(xué)結(jié)構(gòu)[8]，而單寧在植物體內(nèi)的含量和化學(xué)結(jié)構(gòu)受植物種類、種植環(huán)境、生長階段和貯藏方法等因素的影響[9]。因此，在研究單寧在動物生產(chǎn)中利用時(shí)要充分考慮這些因素。

國外研究表明飼喂百脈根可以提高綿羊小腸內(nèi)氨基酸的利用率[2]、提高羊毛產(chǎn)量[10]和增加羊奶產(chǎn)量及改善奶品質(zhì)[11]，這些與其體內(nèi)的縮合單寧有關(guān)。但目前國內(nèi)有關(guān)百脈根在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用研究較少。因此，本研究擬采用體外發(fā)酵系統(tǒng)評估百脈根對瘤胃發(fā)酵特性和消化率的影響，并通過添加聚乙二醇（PEG）的方法確定其體內(nèi)含有的縮合單寧在瘤胃發(fā)酵過程中的作用，為我國百脈根在畜牧生產(chǎn)中的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的百脈根和燕麥干草均來自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場。百脈根在盛花期進(jìn)行收獲，105 ℃殺青10 min，然后65 ℃烘干。烘干后的百脈根和燕麥干草粉碎過1 mm篩，密封備用。

體外發(fā)酵所用瘤胃液采集自3 頭揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場的帶有永久性瘤胃瘺管的綿羊。試驗(yàn)當(dāng)天在晨飼前采集瘤胃內(nèi)容物，經(jīng)4 層無菌紗布過濾后置于保溫瓶中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)，設(shè)置六組處理，分別為燕麥（O 組）、燕麥和百脈根混合（OL 組，干物質(zhì)比例為1∶1）、百脈根（L組）、燕麥+聚乙二醇（PEG）（OP組）、燕麥干草和百脈根+聚乙二醇（OLP組）、百脈根+聚乙二醇（LP 組），作為發(fā)酵底物。聚乙二醇的作用是與單寧特異性結(jié)合，消除單寧的活性，聚乙二醇與單寧的比例為2∶1時(shí)可以完全結(jié)合單寧[12]。

1.3 體外發(fā)酵培養(yǎng)

參照Menke 等[13]的方法配制人工瘤胃緩沖液，通入CO2至無色，預(yù)熱至39 ℃，與采集過濾后的瘤胃液以2∶1的比例混合均勻。稱取0.5 g發(fā)酵底物裝入濾袋內(nèi)（ANKOM 公司，USA）置于150 ml 培養(yǎng)瓶中，每組3 個(gè)重復(fù)，同時(shí)做3個(gè)空白對照，向每個(gè)發(fā)酵瓶中加入60 ml 混合人工瘤胃培養(yǎng)液，并向瓶中立即通入CO2后將培養(yǎng)瓶置于39 ℃的恒溫振蕩水浴鍋中培養(yǎng)。分別于0、1、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h快速取出測量瓶內(nèi)氣壓，計(jì)算產(chǎn)氣量。培養(yǎng)72 h后，取出置于冰上終止發(fā)酵。裝有殘?jiān)臑V袋洗滌烘干后稱重，發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，測pH值后于-80 ℃保存。

1.4 測定指標(biāo)與方法

產(chǎn)氣量（ml/g）=（不同時(shí)間點(diǎn)記錄的各瓶產(chǎn)氣量-該時(shí)間點(diǎn)空白瓶的產(chǎn)氣量）/發(fā)酵底物重量

瘤胃干物質(zhì)降解率(DMD，%)=[（發(fā)酵前底物重-發(fā)酵后殘?jiān)兀?發(fā)酵前底物重]×100

采用馮宗慈等[14]比色法測定氨氮濃度。使用氯化銨作為標(biāo)準(zhǔn)品，在700 nm條件下進(jìn)行比色。

采用日本島津GC-14B 氣相色譜法測定揮發(fā)性脂肪酸含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)采集的所有數(shù)據(jù)先由Excel 2007 軟件進(jìn)行整理，再利用SAS 9.4 的Mix 模型對所有指標(biāo)進(jìn)行方差分析，采用LSD 法進(jìn)行多重比較。顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 體外產(chǎn)氣量

圖1 燕麥、燕麥百脈根混合物、百脈根及添加PEG的瘤胃產(chǎn)氣量

從圖1 可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，各處理組的產(chǎn)氣量呈增長趨勢。從4 h 開始，各處理組產(chǎn)氣量出現(xiàn)顯著性差異，48 h 后趨于一致。在4～24 h 之間，L 組產(chǎn)氣量顯著低于O 組（P＜0.05），從8 h 開始，OL 組逐漸向O 組產(chǎn)氣量接近（P＞0.05）。在6～24 h之間，LP 組產(chǎn)氣量顯著低于OP 組（P＜0.05），在6～12 h，OLP 組產(chǎn)氣量位于OP 組和LP 組之間（P＞0.05），12 h后趨于向OP組接近（P＞0.05）。在8～24 h之間，L組顯著高于LP組產(chǎn)氣量（P＜0.05）。

2.2 瘤胃干物質(zhì)降解率（DMD）

圖2 燕麥、燕麥百脈根混合物、百脈根及添加PEG的瘤胃干物質(zhì)降解率

從圖2 可以看出，L 組的DMD 與OL 組差異不顯著(P=0.072)，兩者均顯著高于O組（P＜0.05）。LP組的DMD 在所有組中最高(P＜0.05),但與L 組無顯著差異（P=0.18）。O 組和OP 組，OL 組和OLP 組之間均沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3 瘤胃發(fā)酵性能

混合瘤胃培養(yǎng)液的初始pH 值為6.86，經(jīng)過72 h的培養(yǎng)后，各組發(fā)酵底物的pH 值在6.16～6.27 之間（表1）。其中，L 組的pH 值顯著高于O、OL、OLP、OP組（P＜0.05），但與LP 組之間無顯著差異（P＞0.05）。LP組的pH值顯著高于OLP組，但與其他組差異不顯著（P＞0.05）。O、OL、OLP、OP 組之間pH 值無顯著差異（P＞0.05）。

表1 燕麥、燕麥百脈根混合物、百脈根及添加PEG的瘤胃發(fā)酵參數(shù)

各組瘤胃液的氨態(tài)氮（NH3-N）濃度無顯著差異（P=0.27）。L 組和OL 組瘤胃液的總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著高于O 組（P＜0.05）。OP 組總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著高于O 組（P＜0.05），L 組和LP、OL 組和OLP 組之間無顯著差異（P＞0.05）。所有處理組中乙酸的比例最大，其次是丙酸，丁酸占7%～8%左右。其中OL組和L組瘤胃液的乙酸比例明顯高于O組瘤胃液（P＜0.05），添加PEG三組瘤胃液的乙酸比例為LP組＞OLP組＞OP 組。L 組和LP 組乙酸比例沒有明顯差異（P＞0.05），O 組的乙酸比例顯著高于OP 組（P＜0.05），OL組的乙酸比例顯著高于OLP組。O、OL組和L組的丙酸和丁酸比例均沒有顯著差異（P＞0.05），LP組丙酸比例顯著低于OP 組和OLP 組（P＜0.05），但丁酸比例顯著高于其他兩組（P＜0.05）。OL組和OLP、L組和LP組的丙酸和丁酸比例無顯著差異（P＞0.05）。O組戊酸和己酸的比例均在所有組中最高。O組和L組瘤胃液異丁酸比例顯著高于OL組（P＜0.05），L組異丁酸比例顯著高于LP 組（P＜0.05）。O、OL 組和L 組三組的乙酸/丙酸值沒有顯著性差異（P＞0.05），但LP 組的乙酸/丙酸值顯著高于OP組和OLP組（P＜0.05）。O、OL組和L組三組與相應(yīng)的PEG組之間的乙酸/丙酸值也沒有顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

產(chǎn)氣量作為體外發(fā)酵體系中評定反芻動物瘤胃微生物發(fā)酵的重要指標(biāo)，綜合性地反映了發(fā)酵底物的可發(fā)酵程度，表明了瘤胃微生物發(fā)酵活動的總趨勢，是反映發(fā)酵底物可利用性的綜合指標(biāo)之一[15]。在本試驗(yàn)中，雖然48 h和72 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量各處理組之間沒有差異，但是在4～24 h和6～24 h之間，百脈根組和百脈根燕麥混合組的產(chǎn)氣量明顯低于燕麥組，說明日糧中添加百脈根可以降低瘤胃發(fā)酵的產(chǎn)氣量。這可能與百脈根和燕麥的營養(yǎng)組成相關(guān)，百脈根是豆科牧草，相比與禾本科燕麥，可溶性碳水化合物含量低，而蛋白質(zhì)含量高。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中糖（可發(fā)酵纖維）的產(chǎn)氣量要高于蛋白質(zhì)的產(chǎn)氣量，飼料的可發(fā)酵有機(jī)物含量越多，瘤胃微生物的活性越高，產(chǎn)氣量就越大[16-17]。與本試驗(yàn)結(jié)果類似，李龍瑞等[18]報(bào)道了在稻草秸稈中添加不同比例的百脈根，隨著發(fā)酵底物中百脈根比例的增加，產(chǎn)氣量降低，并推測是與百脈根所含的單寧有關(guān)。本研究通過在發(fā)酵底物中添加聚乙二醇來明確百脈根中單寧的作用。本研究發(fā)現(xiàn)在8～24 h，添加聚乙二醇后的百脈根產(chǎn)氣量降低，百脈根燕麥混合組也表現(xiàn)出這種趨勢，這表明百脈根中的單寧促進(jìn)了瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣。王慧玲等[19]利用Syringe 體外培養(yǎng)體系研究單寧酸對綿羊瘤胃發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)單寧酸提高了24 h體外產(chǎn)氣量。這些研究表明單寧對瘤胃整體微生物活性沒有影響，并對瘤胃發(fā)酵有一定的促進(jìn)作用，但機(jī)理尚不清楚。今后需要更多的研究來闡明百脈根單寧對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣的作用。

干物質(zhì)是飼料營養(yǎng)價(jià)值的基礎(chǔ)，也是決定干物質(zhì)采食量（dry matter intake，DMI）的重要組成部分，反映飼料整體可消化的難易程度。Cheema 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，干物質(zhì)瘤胃降解率與日糧中蛋白質(zhì)水平呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中，百脈根組的干物質(zhì)降解率明顯高于燕麥組，可能與百脈根含有較高的粗蛋白有關(guān)，這表明百脈根比燕麥更易被反芻動物消化。添加聚乙二醇的百脈根組和未添加組的干物質(zhì)降解率沒有明顯差別，表明百脈根單寧對瘤胃干物質(zhì)降解率沒有影響。一般來說，攝入縮合單寧含量超過5%干物質(zhì)時(shí)會影響飼料的適口性，降低采食量和消化率，從而影響動物的生產(chǎn)性能，單寧含量低于5%干物質(zhì)則沒有影響[21-22]。本試驗(yàn)所采用百脈根干草的縮合單寧含量為2.9%，與前人研究結(jié)果一致。

維持瘤胃內(nèi)穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境是保證瘤胃微生物正常生長及發(fā)揮正常功能的必要條件。瘤胃pH 值是評價(jià)瘤胃內(nèi)環(huán)境的一個(gè)重要指標(biāo)，影響瘤胃pH 值的因素有很多，包括飼糧組成、動物的采食速度和反芻次數(shù)、瘤胃微生物區(qū)系的變化及瘤胃的VFA 濃度。本試驗(yàn)各處理組瘤胃液的pH 值在6.16～6.27，處于瘤胃發(fā)酵的正常生理范圍內(nèi)。百脈根組的瘤胃液pH 值高于燕麥組,而添加聚乙二醇的百脈根組和未添加組沒有差異，表明百脈根單寧對瘤胃內(nèi)環(huán)境沒有影響。

氨氮（NH3-N）濃度是反映瘤胃氮代謝的重要參數(shù)，與飼糧蛋白質(zhì)或NPN 降解速率、瘤胃內(nèi)微生物利用氨的能力等因素密切相關(guān)。李大彪等[23]研究發(fā)現(xiàn)飼糧單寧添加量達(dá)到6%時(shí)降低了瘤胃液氨氮的濃度。李龍瑞等[18]研究發(fā)現(xiàn)稻草中添加百脈根降低了體外發(fā)酵瘤胃液氨氮的濃度。但本試驗(yàn)結(jié)果表明百脈根和燕麥的瘤胃氨氮濃度沒有差異，所含單寧也對氨氮濃度沒有影響。這可能與百脈根單寧活性不同有關(guān)。單寧來源、植物的種植環(huán)境均會影響單寧的活性[9]。

在反芻動物瘤胃中，飼料碳水化合物被微生物發(fā)酵的主要產(chǎn)物是揮發(fā)性脂肪酸（VFA），其能為動物機(jī)體活動提供能量，并維持瘤胃功能[24]。 VFA是碳鏈為1～6的脂肪酸，主要為乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸，其中乙酸、丙酸和丁酸占據(jù)了揮發(fā)性脂肪酸的95%以上，所以在研究VFA時(shí)主要討論這三種酸的變化。百脈根組的總VFA 含量和乙酸濃度明顯高于燕麥組，表明百脈根在為反芻動物提供能量這方面的營養(yǎng)價(jià)值優(yōu)于燕麥。添加聚乙二醇沒有影響百脈根的VFA模式，這表明百脈根中的單寧對瘤胃揮發(fā)性脂肪酸沒有影響。

4 結(jié)論

與燕麥相比，百脈根瘤胃體外發(fā)酵的產(chǎn)氣量較低，瘤胃干物質(zhì)降解率和瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸含量較高。百脈根所含縮合單寧對瘤胃產(chǎn)氣有促進(jìn)作用，對其他瘤胃發(fā)酵特性沒有影響。結(jié)果表明百脈根的營養(yǎng)價(jià)值優(yōu)于燕麥，百脈根單寧對瘤胃發(fā)酵性能影響較小。未來需要更多研究來探討我國不同地區(qū)種植的百脈根中單寧的含量和化學(xué)結(jié)構(gòu)與其活性的關(guān)系，進(jìn)而明確百脈根單寧在反芻動物生產(chǎn)中的營養(yǎng)作用。