周垂楊 楊 明 高仁賢

急性肺損傷（ALI）及其更嚴(yán)重形式急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）病理過(guò)程是由于肺部廣泛的炎癥反應(yīng)，可能導(dǎo)致肺間質(zhì)水腫，肺順應(yīng)性惡化，引起嚴(yán)重低氧血癥[1-2]。ALI 死亡率較高，約為40%[3]。ALI 的發(fā)病機(jī)制是由累積和激活的炎癥細(xì)胞，促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的分泌以及活性氧類別（ROS）的釋放導(dǎo)致的急性炎癥反應(yīng)[4-5]。研究表明，抗炎介質(zhì)或抗炎藥物可以治療早期ALI[6]。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌中外膜的主要成分，是先天免疫系統(tǒng)的極強(qiáng)刺激物，在數(shù)種動(dòng)物模型中常被用來(lái)誘導(dǎo)ALI[7-8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，部分中藥用于治療ALI 具有較好療效，其作用機(jī)制與炎癥信號(hào)調(diào)控和microRNA 生成有關(guān)[9]。苯甲酰芍藥苷是毛茛科植物芍藥、牡丹根部（赤芍）的提取物芍藥總苷中的單體成分，此前研究發(fā)現(xiàn)，芍藥總苷能夠減輕LPS 誘導(dǎo)的小鼠ALI，然而其具體作用成分尚不明確[10]。基于此，本研究探討苯甲酰芍藥苷對(duì)小鼠ALI 的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 實(shí)驗(yàn)用75 只SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠，體質(zhì)量22～25g，6～7 周齡，購(gòu)自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006。小鼠飼養(yǎng)于溫度18～26℃、相對(duì)濕度40%～70%環(huán)境中，自由飲水進(jìn)食，晝夜各12h。本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)，批準(zhǔn)編號(hào)：SYXK（浙）2018-0012。

1.2 細(xì) 胞 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7（批號(hào)260748）購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司。

1.3 藥 物 苯甲酰芍藥苷（批號(hào)51165123）購(gòu)自深圳虹彩祥根生物科技有限公司，溶于無(wú)菌生理鹽水，配制成低濃度0.625mg/mL 及高濃度1.250mg/mL，動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用苯甲酰芍藥苷參考芍藥總苷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用量。

1.4 試 劑 血必凈注射液（規(guī)格：10mL×5 支/盒，批號(hào)190845）購(gòu)自醫(yī)院藥房，產(chǎn)自天津紅日藥業(yè)股份有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)20180648）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（批號(hào)1541216）、小鼠白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（批號(hào)2165216）均購(gòu)自艾美捷科技有限公司；微小RNA 520c-3p（miR-520c-3p）inhibitor 及對(duì)照品NC（批號(hào)21651）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；磷酸化IκB激酶（p-IKKβ）兔單抗（批號(hào)26542）、IKKβ 兔單抗（批號(hào)22642）、核因子κB（NF-κB）p-p65 兔單抗（批號(hào)32645）、NF-κB p65 兔單抗（批號(hào)45142）均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，Actin 作為內(nèi)參。

1.5 儀 器 上海恒平FA2004 電子分析天平購(gòu)自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；GDW/GDJS-100高低溫（濕熱）試驗(yàn)箱購(gòu)自上海蘇盈試驗(yàn)儀器有限公司；Alpha 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Cell Biosciences 公司；SpectraMax iD5 多功能微孔酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器（上海）有限公司；Life Technologies ABI QuantstudioTMDX 定量PCR 儀購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠ALI 模型構(gòu)建及藥物干預(yù) 將75 只SPF級(jí)小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成五組，每組15 只，分別為空白對(duì)照組、ALI 組、陽(yáng)性對(duì)照組、苯甲酰芍藥苷低劑量組、苯甲酰芍藥苷高劑量組。小鼠造模前16h 內(nèi)禁食，造模時(shí)使用4%水合氯醛麻醉，采用腹腔注射法，ALI 組、陽(yáng)性對(duì)照組、苯甲酰芍藥苷低、高劑量組小鼠腹腔注射2mg/kg LPS 100μL，空白對(duì)照組腹腔注射等體積生理鹽水，4h 后苯甲酰芍藥苷低劑量組小鼠腹腔注射2.5mg/kg 苯甲酰芍藥苷100μL，高劑量組注射5.0mg/kg 苯甲酰芍藥苷100μL，陽(yáng)性對(duì)照組注射血必凈注射液100μL，ALI 組和空白對(duì)照組注射相同劑量生理鹽水。24h 后取肺組織稱重，并計(jì)算濕/干重比。

2.2 小鼠肺組織石蠟切片HE 染色 取出小鼠肺組織后放入4%多聚甲醛進(jìn)行固定，經(jīng)TISSUE-TEK AUTOTEC A120 自動(dòng)化樣本制備系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)組織石蠟包埋，制成0.4μm 石蠟切片。按照HE 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行染色，中性樹(shù)脂分片，通過(guò)HE 全自動(dòng)切片掃描儀掃描成像，選取HE 染色肺組織特征性區(qū)域展示。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)ALI 小鼠肺組織TNF-α、IL-6 水平 取約5mg 小鼠肺組織，在管中加入約300μL 完全提取緩沖液并用電動(dòng)勻漿器勻漿，在4℃下以13000rpm 轉(zhuǎn)速離心20min。取上清液放在預(yù)冷的新鮮試管中，并在-80℃下保存樣品。按照ELISA 檢測(cè)試劑盒操作步驟檢測(cè)肺組織TNF-α、IL-6 水平。使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450nm 吸光度值。

2.4 蛋白免疫印跡（WB）法檢測(cè)ALI 小鼠肺組織IKKβ、NF-κB p65 蛋白及其磷酸化水平 利用RIPA 強(qiáng)組織裂解液裂解組織蛋白后，經(jīng)過(guò)離心取上清蛋白樣，測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行蛋白凝膠電泳。孵育一抗稀釋比：IKKβ（1:1000）、p-IKKβ（1:1000）、NF-κB p65（1:1000）、NF-κB p-p65（1:1000）、Actin（1:5000）。利用化學(xué)二抗孵育并進(jìn)行曝光分析。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 的完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，并加入1%的青霉素-鏈霉素雙抗。于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到85%～90%進(jìn)行傳代。將A549鋪板于6cm 皿中，分為五組：空白對(duì)照組、ALI 組、苯甲酰芍藥苷組、苯甲酰芍藥苷+miR-520c-3p inhibitor 組、苯甲酰芍藥苷+miR-NC 組。后兩組各預(yù)先轉(zhuǎn)染miR-520c-3p inhibitor 和NC 24h。ALI 組、苯甲酰芍藥苷組、苯甲酰芍藥苷+miR-520c-3p inhibitor 組、苯甲酰芍藥苷+miR-NC 組加入80ng/mL LPS 刺激，同時(shí)后三組加入苯甲酰芍藥苷100ng/mL，空白對(duì)照組加入等體積生理鹽水，處理6h 后提取RNA。關(guān)于探究miR-506-3p 抑制劑對(duì)苯甲酰芍藥苷作用于細(xì)胞TNF-α、IL-6 的影響，設(shè)置四組：空白對(duì)照組給予生理鹽水刺激6h；ALI 組給予LPS（80ng/mL）刺激6h；苯甲酰芍藥苷組給予LPS（80ng/mL）刺激6h+苯甲酰芍藥苷（100ng/mL）；苯甲酰芍藥苷+miR-520c-3p inhibitor 組給予預(yù)轉(zhuǎn)染miR-520c-3p inhibitor 24h，LPS（80ng/mL）刺激6h+苯甲酰芍藥苷（100ng/mL）；苯甲酰芍藥苷+miR-NC 組給予預(yù)轉(zhuǎn)染miR-NC 24h，LPS（80ng/mL）刺激6h+苯甲酰芍藥苷（100ng/mL）。收取細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA 法檢測(cè)，具體步驟見(jiàn)上述。

2.6 RT-PCR 檢測(cè)miR-520c-3p、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平 提取細(xì)胞RNA 后逆轉(zhuǎn)為cDNA 進(jìn)行RTPCR 檢測(cè)，引物如下：miR-520c-3p 引物：forward 5′-ATCGCCGTGTAAAAGGAAGAGGGCTGAGGAATTCAT-3′，reverse 5′-CACTGGACTAGTGGAGGAGAGCACATAAAAACATC-3′；TNF-α 引物：forward 5′-CGGCTACCTAGTCTACGCC-3′，reverse 5′-AAGTCGCCGCCAATGTTGA-3′；NF-κB p65 引物：forward 5′-ATCCCATCTTTGACAATCGTGC-3′，reverse 5′-CTGGTCCCGTGAAATACACCTC-3′。引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。反應(yīng)程序：94℃變性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)32 次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，數(shù)據(jù)分析組內(nèi)比較采用t 檢驗(yàn)，組間比較采用方差檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 苯甲酰芍藥苷降低ALI 小鼠肺組織濕/干重比與空白對(duì)照組比較，ALI 組肺組織濕/干重比明顯升高（P＜0.05），與ALI 組比較，苯甲酰芍藥苷低、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肺組織濕/干重比均明顯下降（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠肺組織濕/干重比比較（）

表1 各組小鼠肺組織濕/干重比比較（）

注：空白對(duì)照組給予腹腔注射生理鹽水200μL；ALI 組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+生理鹽水100μL；陽(yáng)性對(duì)照組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+血必凈注射液100μL；苯甲酰芍藥苷低劑量組給予腹腔注射LPS （2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍藥苷（2.5mg/kg，100μL）；苯甲酰芍藥苷高劑量組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍藥苷（5.0mg/kg，100μL）；ALI 為急性肺損傷；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與ALI 組比較，bP＜0.05

3.2 苯甲酰芍藥苷對(duì)各組ALI 小鼠肺組織病理變化的影響 空白對(duì)照組小鼠肺組織呈現(xiàn)氣管黏膜纖毛柱狀上皮細(xì)胞，呼吸道和肺泡上皮結(jié)構(gòu)完整。肺泡形態(tài)均勻，纖毛排列整齊。而ALI 組小鼠肺泡和肺泡隔中可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡隔中可見(jiàn)增厚。在肺組織觀察到明顯的毛細(xì)血管充血、水腫和肺泡出血，表明成功建立肺損傷模型。與ALI 組比較，苯甲酰芍藥苷低、高劑量組小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肺泡中隔增厚情況減輕，毛細(xì)血管幾乎無(wú)充血情況。見(jiàn)插頁(yè)圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE，100×）

3.3 苯甲酰芍藥苷降低ALI 小鼠肺組織TNF-α、IL-6 水平 與空白對(duì)照組比較，ALI 組小鼠肺組織TNF-α、IL-6 水平明顯升高（P＜0.05）；與ALI 組小鼠比較，苯甲酰芍藥苷低、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肺組織TNF-α、IL-6 水平均明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 苯甲酰芍藥苷對(duì)ALI 小鼠肺組織TNF-α、IL-6 的影響（pg/mL，）

表2 苯甲酰芍藥苷對(duì)ALI 小鼠肺組織TNF-α、IL-6 的影響（pg/mL，）

注：空白對(duì)照組給予腹腔注射生理鹽水200μL；ALI 組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+生理鹽水100μL；陽(yáng)性對(duì)照組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+血必凈注射液100μL；苯甲酰芍藥苷低劑量組給予腹腔注射LPS （2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍藥苷（2.5mg/kg，100μL）；苯甲酰芍藥苷高劑量組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍藥苷（5.0mg/kg，100μL）；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白介素-6；ALI 為急性肺損傷；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與ALI 組比較，bP＜0.05

3.4 苯甲酰芍藥苷抑制ALI 小鼠肺組織IKKβ/NFκB 信號(hào) ALI 組IKKβ、NF-κB p65 磷酸化水平明顯高于空白對(duì)照組，總IKKβ、NF-κB p65 表達(dá)無(wú)明顯差異；苯甲酰芍藥苷低、高劑量組與ALI 組比較，IKKβ、NF-κB p65 磷酸化水平明顯下降，同時(shí)總NF-κB p65 水平也明顯下降，總IKKβ 水平無(wú)明顯變化。推測(cè)苯甲酰芍藥苷可能通過(guò)抑制NF-κB 的表達(dá)抑制了炎癥信號(hào)。見(jiàn)插頁(yè)圖2。

圖2 各組小鼠肺組織IKKβ/NF-κB 及其磷酸化表達(dá)

3.5 苯甲酰芍藥苷促進(jìn)ALI 小鼠肺組織miR-520c-3p 表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，ALI 組小鼠肺組織miR-520c-3p 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）；與ALI 組比較，苯甲酰芍藥苷低、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肺組織miR-520c-3p 表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠肺組織miR-520c-3p 表達(dá)比較（）

表3 各組小鼠肺組織miR-520c-3p 表達(dá)比較（）

注：空白對(duì)照組給予腹腔注射生理鹽水200μL；ALI 組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+生理鹽水100μL；陽(yáng)性對(duì)照組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+血必凈注射液100μL；苯甲酰芍藥苷低劑量組給予腹腔注射LPS （2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍藥苷（2.5mg/kg，100μL）；苯甲酰芍藥苷高劑量組給予腹腔注射LPS（2mg/kg，100μL）+苯甲酰芍藥苷（5.0mg/kg，100μL）；ALI 為急性肺損傷；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與ALI 組比較，bP＜0.05

3.6 miR-506-3p 靶向NF-κB p65 亞基RELA 基因序列 通過(guò)microRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan 7.0 軟件分析結(jié)果顯示，miR-506-3p 直接靶向NFκB p65 亞基RELA 基因3′UTR 序列。見(jiàn)表4。

表4 miR-506-3p 靶向NF-κB p65 亞基RELA 基因序列

3.7 miR-506-3p 抑制劑減輕苯甲酰芍藥苷對(duì)TNFα、IL-6 表達(dá)抑制的影響 與空白對(duì)照組比較，ALI組細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA 水平明顯升高（P ＜0.05）；與ALI 組比較，苯甲酰芍藥苷組TNF-α、IL-6 mRNA 水平明顯下降（P＜0.05）；與苯甲酰芍藥苷組比較，苯甲酰芍藥苷+miR-520c-3p inhibitor 組TNFα、IL-6 mRNA 水平明顯升高（P＜0.05），苯甲酰芍藥苷+miR-NC 組TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)無(wú)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表5。

4 討論

ALI 的特征在于急性炎性反應(yīng)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滲出性分泌物，肺細(xì)胞死亡的釋放以及隨后的實(shí)質(zhì)損傷。研究表明，巨噬細(xì)胞在ALI 急性期的免疫反應(yīng)和炎癥過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用，該過(guò)程通過(guò)釋放炎性因子促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集進(jìn)一步釋放促炎性因子TNF-α、IL-6 等[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酰芍藥苷能有效抑制LPS 誘導(dǎo)的小鼠肺組織TNF-α、IL-6 水平。因此，苯甲酰芍藥苷可能通過(guò)抑制TNF-α、IL-6 的水平緩解LPS 誘導(dǎo)ALI。

為了進(jìn)一步探究苯甲酰芍藥苷緩解LPS 誘導(dǎo)ALI 的分子機(jī)制。本研究檢測(cè)了小鼠肺組織中IKKβ/NF-κB 信號(hào)，結(jié)果顯示，苯甲酰芍藥苷能有效降低IKKβ、NF-κB p65 磷酸化水平以及總NF-κB p65水平。NF-κB 代表轉(zhuǎn)錄因子家族，通常通過(guò)與IκB 家族的抑制分子相互作用而在細(xì)胞質(zhì)中保持失活。響應(yīng)多種刺激（例如炎性細(xì)胞因子，細(xì)菌或病毒產(chǎn)物或各種類型的應(yīng)激），IκB 分子在兩個(gè)關(guān)鍵的絲氨酸殘基上被磷酸化。該修飾允許它們的多泛素化和被蛋白酶體破壞。游離的NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核并激活各種基因的轉(zhuǎn)錄，如TNF-α、IL-1β 和IL-6，這些基因參與了免疫和炎癥反應(yīng)，在ALI 發(fā)展和發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[13]。這也進(jìn)一步提示苯甲酰芍藥苷可能通過(guò)抑制IKKβ/NF-κB 信號(hào)活化減低TNF-α、IL-6 水平。

此前研究發(fā)現(xiàn)，miR-506-3p 靶向NF-κB p65序列，參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。推測(cè)苯甲酰芍藥苷可能通過(guò)調(diào)控miR-506-3p 介導(dǎo)NF-κB 炎癥信號(hào)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-506-3p 在ALI 中表達(dá)下調(diào)，而苯甲酰芍藥苷能夠明顯上調(diào)miR-506-3p 的表達(dá)，同時(shí)利用miR-506-3p inhibitor 能有效逆轉(zhuǎn)苯甲酰芍藥苷對(duì)炎癥因子TNF-α、IL-6 水平的抑制作用。

總之，苯甲酰芍藥苷通過(guò)減少炎癥因子TNF-α、IL-6 的產(chǎn)生，對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠ALI 具有保護(hù)作用。苯甲酰芍藥苷的抗炎機(jī)制可能涉及促進(jìn)miR-506-3p 的表達(dá)，抑制IKKβ/NF-κB 途徑。因此，苯甲酰芍藥苷可能是ALI 的潛在治療藥物。后續(xù)全面研究驗(yàn)證將推進(jìn)苯甲酰芍藥苷進(jìn)入臨床應(yīng)用。

表5 miR-506-3p 抑制劑對(duì)苯甲酰芍藥苷調(diào)控TNF-α、IL-6 mRNA 的影響（）

表5 miR-506-3p 抑制劑對(duì)苯甲酰芍藥苷調(diào)控TNF-α、IL-6 mRNA 的影響（）

注：TNF-α 為腫瘤壞死因子α；IL-6 為白介素-6；ALI 為急性肺損傷；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與ALI 組比較，bP＜0.05；與苯甲酰芍藥苷組比較，cP＜0.05