管靜靜

青藤堿是從中草藥青藤中提取的一種活躍的生物堿。青藤堿可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)通過抑制淋巴細(xì)胞的活化，減少巨噬細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生[1]，對多種自身免疫性和炎癥相關(guān)疾病具有良好的效果[2-4]。青藤堿能有效抑制核因子κB（NF-κB）的抑制蛋白（IκB）磷酸化及后續(xù)降解反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB 下游炎癥基因轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄的減少[5]。急性肺損傷與過度的炎癥反應(yīng)以及NF-κB 信號通路的激活密切相關(guān)，同時青藤堿具有明顯的改善脂多糖（LiPoPoly-saccharide，LPS）誘導(dǎo)的急性炎癥的功效[3-4]。然而青藤堿對于急性肺損傷的作用尚未進(jìn)行深入研究。因此，本研究擬通過LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷模型炎癥探索青藤堿對急性肺損傷的保護(hù)作用。

1 實驗材料

1.1 動 物 雄性C57BL/6J 小鼠48 只，體質(zhì)量20～30g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK（京）2012-0001，動物倫理審批號wydw 2015-0182。動物飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，SPF 環(huán)境，溫度、濕度、換氣次數(shù)由IVC 系統(tǒng)自動控制，光照為12h 明、12h 暗循環(huán)。自由攝食飲水，飼料由浙江省實驗動物中心提供，飲水為純凈水。

1.2 藥品與試劑 青藤堿（德思特生物，中國，DQ0008）；LPS（Sigma 公司，美國，L2630）；腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factorα，TNF-α）（R&D 公司，美國，MTA00B）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）（R&D 公司，美國，M6000B）、IL-1β（Thermo，美國，BMS6002）、單核細(xì)胞趨化因子1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）（賽默飛，美國，BMS6005）酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（碧云天，中國，P0012）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天，中國，C0109）；表面抗原分化簇68（CD68）抗體（Abcam，美國，ab125212）；驢抗兔熒光二抗（Alexa Fluor 647）（Abcam，美國，ab150075）；即用型免疫組化試劑盒（邁新生物，中國，KIT-9720）。

1.3 儀 器 Varioskan Flash 酶標(biāo)儀（Thermo，美國）；E3000-0.5 型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），BX51 倒置熒光顯微鏡（OlymPus，日本）。

2 實驗方法

2.1 分組、模型制備及給藥 選用C57BL/6J 小鼠48 只，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成四組，假手術(shù)組、模型組、青藤堿低劑量組（40mg/kg），青藤堿高劑量組（160mg/kg），每組12 只。急性肺損傷模型制備：術(shù)前12h 禁食，自由飲水；采用1%戊巴比妥鈉，75mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉；仰臥位，四肢外展固定后直立固定板；采用留置針進(jìn)行氣管插管，1mL 注射器注入50μL 生理鹽水形成液柱后插入留置針，液柱隨小鼠呼吸上下浮動為插入氣道成功；LPS（0.5mg/kg）滴注留置針后，使用1mL 注射器將LPS 推入氣道。假手術(shù)組采用同樣操作，氣道給予同劑量的生理鹽水。青藤堿治療組小鼠造模前3 天每天腹腔注射相應(yīng)劑量的青藤堿。建模后6h，處死小鼠，取外周血與肺部組織進(jìn)行檢測。

2.2 測定指標(biāo)

2.2.1 血清炎癥因子測定 建模后6h，處死小鼠，行眼球取血300～500μL，以3000rpm、離心半徑8.5cm，離心5min，收集上清，按照試劑盒說明書檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1。

2.2.2 肺組織病理切片與免疫組化染色 取出未經(jīng)灌洗的左肺下葉放入福爾馬林中固定，24h 后脫水，透明，石蠟包埋處理，5μm 切片，HE 染色與CD68 免疫組化染色。HE 染色步驟根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，其中蘇木素染色5min，伊紅染色10s。CD68 免疫熒光染色前期根據(jù)即用型免疫組化試劑盒步驟操作，一抗稀釋比例1:200，熒光二抗稀釋比例1:10000，二抗孵育完畢4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色5min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗凈，抗熒光淬滅劑封片鏡檢。觀察肺臟組織形態(tài)病理學(xué)變化，觀察有無肺水腫，以及通過Image J 軟件對同一組織切片的6 個不同視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計，觀察巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞浸潤情況。

2.2.3 肺組織胞外信號調(diào)控激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2）/核因子κB（nuclear factor kaPPa-B，NF-κB）信號通路檢測 剪取未經(jīng)肺泡灌洗的肺臟組織約100mg，剪碎勻漿，以12000rpm、離心半徑8.5cm，離心20min，收集上清，考馬斯亮藍(lán)定量，100℃水浴使蛋白變性，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF），轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂牛奶封閉常溫孵育1h，一抗稀釋比例1:1000，4℃冷庫孵育過夜，PBST洗3 次，每次7min，二抗稀釋比例1：10000，室溫孵育1.5h，PBST 洗3 次，每次7min，化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影，凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白表達(dá)，GAPDH 為內(nèi)參。

表1 各組小鼠血清炎癥因子水平比較（pg/mL，）

表1 各組小鼠血清炎癥因子水平比較（pg/mL，）

注：假手術(shù)組給予氣道滴注生理鹽水（0.5mg/kg）；模型組給予氣道滴注脂多糖（0.5mg/kg）；青藤堿低劑量組給予脂多糖（0.5mg/kg）+青藤堿（40mg/kg）；青藤堿高劑量組給予脂多糖（0.5mg/kg）+青藤堿（160mg/kg）；IL-1β 為白介素-1β；MCP-1 為單核細(xì)胞趨化因子1；TNF-α 為腫瘤壞死因子α；IL-6 為白介素-6；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與青藤堿低劑量組比較，cP＜0.05

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，采用t 檢驗進(jìn)行兩組間比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 對小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1 水平的影響 LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷模型小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1 水平明顯升高（P＜0.05），表明模型組小鼠LPS 刺激后，肺部發(fā)生炎癥，模型構(gòu)建成功。給予青藤堿后小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1 水平明顯降低（P＜0.05），并具有劑量依賴性（P＜0.05）。見表1。

3.2 肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果 鏡檢HE 染色與CD68 免疫組化染色顯示，LPS 刺激后，模型組小鼠肺臟發(fā)生明顯的炎癥病變，肺部出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞聚集、遷移并表現(xiàn)出彌漫性水腫，同時伴有肺泡壁增厚、肺泡腔萎縮等，提示造模成功。給予青藤堿能明顯改善上述病理變化，并具有劑量依賴性。見插頁圖1。

圖1 肺部病理變化及巨噬細(xì)胞浸潤情況（HE 200×，CD68 400×）

3.3 肺組織ERK/NF-κB 信號通路被抑制 Western blot 結(jié)果顯示，模型組肺臟組織ERK/NF-κB 信號通路被激活，ERK1/2 的磷酸化水平明顯升高，IκB 降解明顯，青藤堿低、高劑量組ERK/NF-κB 信號通路明顯被抑制，ERK1/2 磷酸化水平明顯低于模型組，IκB降解程度明顯降低，并且對ERK/NF-κB 的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。提示青藤堿可能通過抑制ERK/NF-κB 信號通路緩解肺損傷，并具有劑量依賴性。見表2，插頁圖2。

圖2 ERK/NF-κB 信號通路激活情況

4 討論

急性肺損傷是一種嚴(yán)重的急性炎癥性疾病，是危重癥醫(yī)學(xué)研究的一個主要問題[6]。通過氣管內(nèi)滴入LPS 誘導(dǎo)急性炎性反應(yīng)誘發(fā)急性肺損傷是目前使用最多的急性肺損傷模型[7-8]。青藤堿為中草藥青風(fēng)藤提取物，目前主要用于治療慢性炎癥，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎等[9-10]。但青藤堿的保護(hù)作用在急性肺損傷中的研究較少。因此本研究采用LPS 氣道滴注誘導(dǎo)急性肺損傷模型，探討青藤堿對急性肺損傷的保護(hù)作用。

表2 各組小鼠肺組織ERK/NF-κB 信號通路

過度的炎癥因子（TNF-α、IL-6）表達(dá)是炎癥性疾病急性期的重要標(biāo)志。在本研究中，LPS 氣道滴注引發(fā)小鼠全身炎癥反應(yīng)，血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1 含量均明顯升高，青藤堿可以明顯抑制炎癥因子的釋放，降低血清炎癥因子水平。這也證實了青藤堿可以通過抑制炎癥反應(yīng)緩解急性肺損傷。此外，青藤堿具有良好的免疫抑制作用，可以有效抑制炎癥細(xì)胞浸潤，緩解機(jī)體損傷。病理切片結(jié)果顯示，青藤堿對肺組織損傷具有良好的保護(hù)作用，并可以有效抑制巨噬細(xì)胞浸潤。青藤堿對ERK/NF-κB信號通路的抑制在不同的疾病模型中已經(jīng)得到了證實[11-14]。在本研究中，LPS 氣道滴注引起ERK/NF-κB信號通路的激活，具體表現(xiàn)為ERK 的磷酸化水平增高以及IκB 的降解，而青藤堿可以明顯抑制上述反應(yīng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)青藤堿對LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用，通過ERK/NF-κB 信號通路對炎癥因子具有顯著抑制作用，并緩解LPS 誘導(dǎo)的組織損傷。