賈 塘，歐陽穎，母發(fā)光，何海蘭

(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川省人民醫(yī)院·四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院兒科，四川 成都 610072)

偏頭痛不僅表現(xiàn)血管搏動(dòng)性疼痛還影響語言、視覺空間記憶和注意力，兒童發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)[1]，Pira等[2]發(fā)現(xiàn)患兒的語言及智力可能會(huì)出現(xiàn)下降[3，4]。而核苷酸結(jié)合寡聚化受體3(neutrophilic alkaline phosphatase 3；NALP3)是炎性反應(yīng)過程中的一個(gè)代表因子[5]，Lenart 認(rèn)為NALP3是連接血管疾病與神經(jīng)炎性疾病的樞紐，提出偏頭痛的發(fā)病機(jī)制可能與炎性小體有關(guān)[6]，國內(nèi)研究也提示NALP3通過神經(jīng)源性反應(yīng)參與偏頭痛的發(fā)病機(jī)制[5，7]。而二甲雙胍能抗炎、緩解疼痛[8，9]。本研究利用這方面的藥理作用探究二甲雙胍干預(yù)后偏頭痛大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)是否改善，并選取NALP3與既是其上游因子也與偏頭痛發(fā)病機(jī)制嘌呤信號(hào)相關(guān)的P2X7受體的表達(dá)，來判斷二甲雙胍對(duì)偏頭痛有無改善作用[10]。

1 資料與方法

1.1 一般資料2018年12月，購入SPF級(jí)SD雄性大鼠48只(成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)。體重(200±20)g，8～10周齡，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：正常對(duì)照組、模型組、二甲雙胍組、經(jīng)典氟桂利嗪組。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于四川省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由活動(dòng)及飲食，5天內(nèi)不刺激及干預(yù)使大鼠適應(yīng)環(huán)境。

1.2 造模及實(shí)驗(yàn)干預(yù)模型組(B組)的制備：Tassorelli法：采取硝酸甘油注射法(硝酸甘油為NO供體，NO不僅能擴(kuò)張血管，造成無菌性腦炎而且有神經(jīng)毒性作用，激活三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)，引起偏頭痛，通過爬籠、搔頭、耳紅等行為學(xué)表現(xiàn)出來)在頸背部注射10 mg/kg，空白組(A組)則換為同等劑量的生理鹽水(10 mg/kg)，每周注射1次，共4周，記錄行為學(xué)表現(xiàn)，造模5 min后行為學(xué)評(píng)分，持續(xù)觀察30 min。具體方法見表1。第二周二甲雙胍組(C組)予以200 mg/(kg·d)(抗炎及治療神經(jīng)病理性疼痛的劑量[11，12]灌胃)，經(jīng)典氟桂利嗪組(D組)予以氟桂利嗪1.25 mg/(kg·d)灌胃共3周，剩余組都使用生理鹽水灌胃10 ml/(kg·d)灌胃，最后1次灌胃4小時(shí)后予以10%水合氯醛麻醉并留取三叉神經(jīng)組織進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑電泳槽JY-SCZ4+、電泳儀JY200C(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀5200(上海天能科技有限公司)；全功能酶標(biāo)儀MK3(美國ThermoFisher公司)；硝酸甘油注射液(河南潤(rùn)弘制藥公司)；鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥公司)；氟桂利嗪膠囊(重慶科瑞制藥公司)；P2X7R一抗(abcam)；NALP3抗體(genxspan公司)；β-actin抗體(Merckmillipore公司)；BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天)。

表1 行為學(xué)評(píng)分方法[13](累計(jì)≥6分則造模成功)

1.4 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)①免疫組化測(cè)定P2X7受體的表達(dá)：取出固定的三叉神經(jīng)組織制片后，按照試劑盒提示步驟操作，數(shù)碼三目顯微攝像系統(tǒng)圖像采集，分析光密度。②Western blot測(cè)定NALP3的表達(dá)：取大鼠三叉神經(jīng)節(jié)樣本進(jìn)行裂解，提取總蛋白，再進(jìn)行抗體孵育，制膜后電泳分析蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。行為學(xué)評(píng)分、NALP3及P2X7等計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)。再用直線相關(guān)分析P2X7及NALP3的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組及編號(hào)說明：A、B、C、D四組：每組編號(hào)1～12。A4、C4在第2周及第3周灌胃失誤死亡，D4第4周時(shí)由于頸背部皮下注射導(dǎo)致注射處壞死出血感染死亡。

2.1 行為學(xué)結(jié)果通過Tassorelli法制作偏頭痛模型后，大鼠在3～5 min內(nèi)迅速表現(xiàn)在籠內(nèi)來回走動(dòng)，較為煩躁，在行為學(xué)表現(xiàn)上主要為持續(xù)搔頭及理毛，個(gè)別大鼠出現(xiàn)咬尾，30 min后以上現(xiàn)象逐漸減少，最后閉目臥于籠內(nèi)。A組大鼠僅在注射生理鹽水 5～8 min后出現(xiàn)上述癥狀，持續(xù)時(shí)間及程度都較輕。C及D組在藥物干預(yù)后上述表現(xiàn)在程度及持續(xù)時(shí)間上也較前減少，行為學(xué)評(píng)分顯示：①在造模后，行為學(xué)評(píng)分累加>6分，提示造模成功。②C與D組實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)后大鼠行為學(xué)變化評(píng)分降低(P<0.01)，二甲雙胍及氟桂利嗪可能緩解偏頭痛大鼠臨床表現(xiàn)。③C與D行為學(xué)評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體評(píng)分見表2。

表2 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分 (分)

a與A組比較，P<0.01；b與B組比較，P<0.01

2.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定P2X7的結(jié)果偏頭痛模型組P2X7受體的表達(dá)量多于其他組(P<0.05)，二甲雙胍及氟桂利嗪干預(yù)后P2X7受體表達(dá)減少(P<0.05)，表達(dá)量上二甲雙胍組少于氟桂利嗪組。見表3及圖1。

表3 大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織P2X7受體平均光密度統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖1 三叉神經(jīng)節(jié)中使用免疫組化測(cè)定P2X7受體分布情況 a:A組；b:B組；c:C組；d:D組(×400，標(biāo)尺=40 μm) 箭頭所示為P2X7分布的神經(jīng)元。主要分布三叉神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)，陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈黃色或棕黃色

2.3 Western blot測(cè)定NALP3結(jié)果當(dāng)與造模后未行藥物干預(yù)組相比時(shí)二甲雙胍組三叉神經(jīng)節(jié)中NALP3表達(dá)明顯降低(P<0.05)，但氟桂利嗪組NALP3表達(dá)與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但其表達(dá)量的數(shù)值上有減少。故二甲雙胍減少炎性小體表達(dá)上效果優(yōu)于氟桂利嗪。見圖2、圖3及表4。

表4 各實(shí)驗(yàn)組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中NALP3蛋白表達(dá)

圖2 各組三叉神經(jīng)節(jié)NALP3蛋白的表達(dá)

圖3 各組三叉神經(jīng)節(jié)NALP3蛋白western-blot情況

2.4 P2X7受體與NALP3炎性小體的相關(guān)性大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X7受體與NALP3蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.75，P<0.01)，提示P2X7受體表達(dá)增加的同時(shí)伴隨NALP3蛋白的表達(dá)，兩者共同參與偏頭痛的發(fā)病機(jī)制。見圖4。

圖4 P2X7受體與NALP3炎性小體的相關(guān)性

3 討論

三叉神經(jīng)節(jié)作為炎性介質(zhì)、血管、三叉神經(jīng)系統(tǒng)之間的樞紐共同闡述偏頭痛的發(fā)病機(jī)制，偏頭痛反復(fù)發(fā)作激活三叉神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)炎性介質(zhì)的釋放，炎性因子刺激感覺神經(jīng)末梢，痛覺信號(hào)沿三叉神經(jīng)傳導(dǎo)經(jīng)腦干丘腦傳入皮層產(chǎn)生痛覺，對(duì)于偏頭痛的治療需要尋找有效且安全的藥物，本實(shí)驗(yàn)選取二甲雙胍作為實(shí)驗(yàn)藥物是因?yàn)槎纂p胍能抗炎、減輕神經(jīng)病理性疼痛及外周敏化，并且二甲雙胍副作用較少，安全性高，不經(jīng)肝臟代謝，多以原型從腎臟排出。此外，兒童偏頭痛患兒也可從中受益，兒童偏頭痛的長(zhǎng)期發(fā)作可能造成學(xué)習(xí)記憶受損，而實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)低劑量的二甲雙胍長(zhǎng)期腹腔注射可以改善學(xué)習(xí)記憶能力[14]。

二甲雙胍可能通過多個(gè)途徑減輕神經(jīng)源性炎性反應(yīng)：①直接產(chǎn)生抗炎作用，減少炎性因子的表達(dá)，使炎性小體NALP3的表達(dá)減少。②激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路，ATP與AMP是神經(jīng)系統(tǒng)傳遞嘌呤信號(hào)的遞質(zhì)，當(dāng)AMP/ATP比例升高時(shí)AMPK 通路被激活，ATP減少可以導(dǎo)致ATP與其P2X7嘌呤離子受體結(jié)合減少，則依賴ATP的鉀離子通道開放減少從而使其下游的NALP3的組裝受抑，從而減輕炎性反應(yīng)；③二甲雙胍在代謝方面使膽固醇晶體合成減少，而膽固醇晶體是激活NALP3的上游分子[15]。此外，據(jù)研究二甲雙胍能通過AMPK-TAB1-P38通路發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用并且促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放內(nèi)啡肽抑制膠質(zhì)細(xì)胞JNK-縫隙連接功能，減輕慢性疼痛[11]

綜上，此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示二甲雙胍可能在減少NALP3炎性小體的表達(dá)的同時(shí)減輕偏頭痛的癥狀，提示二甲雙胍可能對(duì)偏頭痛有潛在的治療作用，希望在未來能深入進(jìn)行相關(guān)研究，為二甲雙胍治療偏頭痛提供更多證據(jù)。