王苗苗,劉宗浩,張 永,嚴 歡,田 合,毛瓊玲,李慕春,*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院,新疆天然產(chǎn)物綠色加工工程技術(shù)研究中心,新疆烏魯木齊 830011;2.新疆康元生物技術(shù)集團股份有限公司,新疆阿勒泰 836700;3.喀什慕峰酒業(yè)有限責任公司,新疆喀什 844000)

沙棘(HippophaeRhamnoidesL.,Sea Buckthorn)又名醋柳、酸刺等,主要多分布于我國西北、華北、西南等干旱地區(qū)[1-3]。沙棘生命力極強,且耐寒耐早,適用于沙漠綠化、防止水土流失。沙棘系蒙古族、藏族習用藥材,現(xiàn)如今,則作為一種藥食同源植物被廣泛關(guān)注。沙棘中含有蛋白質(zhì)、糖類、黃酮、多酚、維生素、氨基酸、有機酸及微量元素等多種對人體有益的功能活性成分和營養(yǎng)成分,具有獨特的保健功能和藥用價值,享有“綠色黃金”的美譽[4-6]。

據(jù)報道,沙棘中黃酮含量較高,已經(jīng)分離出近40類黃酮類化合物,由于這些豐富的黃酮類化合物,沙棘才具有了止咳祛痰、活血化瘀、抗輻射、抗氧化、抗抑郁、抗菌消炎、調(diào)節(jié)血脂、保護肝臟、預防心腦血管疾病等多種藥理作用[7-9]。研究表明,自由基引發(fā)的氧化反應是導致身體各組織器官損傷、病變的主要原因之一,人類衰老及諸多重大疾病均與自由基造成的氧化損傷有關(guān)[10-12]。沙棘中含有黃酮、多酚、皂苷、鞣質(zhì)及生物堿等抗氧化活性物質(zhì),可以在一定程度上減少機體的氧化損傷[13-14]。目前,以沙棘為藥源植物的研究大都只局限于單一品種,且針對黃酮含量測定的研究方法較單一,而對不同品種及活性成分不同測定方法的系統(tǒng)研究鮮有報道。

沙棘中主要的黃酮類化合物是異鼠李素、槲皮素、山奈酚等,本實驗采用分光光度法測定了總黃酮的含量,使用超高效液相色譜法,測定了新疆2種沙棘中槲皮素、山奈酚、異鼠李素的含量,為沙棘在食品、藥品、化妝品、保健品及日用化工等多種領(lǐng)域高附加值的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。此外,采用多種抗氧化活性試驗測定新疆2種沙棘的抗氧化活性,從天然植物沙棘中尋找高效、低毒、價廉的抗氧化劑,符合人們對健康、安全的新需求,為沙棘的綜合利用提供新方向、新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆自產(chǎn)的大果沙棘 標記為沙棘A;新疆自產(chǎn)的中亞沙棘 標記為沙棘B;甲醇、無水乙醇、無水乙醚、福林酚試劑 分析純,天津富宇精細化工有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀 分析純,天津市致遠化學試劑有限公司;乙酸鈉 分析純,天津市福晨化學試劑廠;三氯化鐵、氫氧化鈉 分析純,天津盛奧化學試劑有限公司;硫酸亞鐵 分析純,西安化學試劑廠;三氯乙酸(分析純)、甲酸(色譜純) 天津市大茂化學試劑廠;沒食子酸 分析純,成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū);無水碳酸鈉 分析純,上海試四赫維化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ) 分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司;抗壞血酸(VC) 分析純,鄭州市化學試劑三廠;總抗氧化能力檢測試劑盒A015 生產(chǎn)批號:20181228,南京建成生物工程研究所;甲醇 色譜純,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;異鼠李素標準品 98.3%,Nature Standard-5992;山奈酚標準品 95.8%,MUST-11041101;槲皮素標準品 98.5%,aladdin-D1415003。

ALPHA2-4/Ldplus實驗室冷凍干燥機 德國CHRIST公司;RT-02A碎樣機 北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司;TE612-L電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司;XS-204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀 美國沃特世公司;UV-2700紫外分光光度計 日本島津公司;HH.S11-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;MINI-QACHANLAGE A10超純水系統(tǒng) 美國密理特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙棘提取液制備 取適量新鮮沙棘果,使用冷凍干燥機凍干后,粉碎并過60目篩。稱2.0 g沙棘粉末,無水乙醚脫脂后,加入100 mL 70%乙醇溶液,室溫下浸泡2 h后,70 ℃回流提取2 h;過濾;濾渣加入100 mL 70%乙醇溶液重復提取一次,濾液合并,濃縮凍干,使用70%乙醇溶液配制成適宜濃度備用[15]。每個樣品做3個平行。

1.2.2 黃酮含量測定 標準曲線制定:準確稱取10.0 mg蘆丁標準品,用甲醇配制成1 mg·mL-1標準溶液母液,使用時稀釋。分別取不同濃度蘆丁標準液于10 mL比色管中,加入4 mL 1% AlCl3溶液,甲醇定容至10 mL,充分混勻,40 ℃水浴反應60 min,測410 nm處吸光度值[16]。根據(jù)吸光度值做標準曲線。

樣品測定:取1 mL提取液于10 mL比色管中,加入4 mL 1% AlCl3溶液,甲醇定容至10 mL,充分混勻,40 ℃水浴反應60 min,測410 nm處吸光度值。每個樣品做3個平行。

1.2.3 多酚含量測定 標準曲線制定:準確稱取2.0 mg沒食子酸標準品,用超純水配制成200 μg·mL-1標準溶液母液,使用時稀釋。分別取不同濃度沒食子酸標準液于10 mL比色管中,加入5 mL 福林酚試劑,加入3 mL 10% Na2CO3溶液,超純水定容至10 mL,充分混勻,避光反應60 min,測765 nm處吸光度值[17]。根據(jù)吸光度值做標準曲線。

樣品測定:取0.1 mL提取液于10 mL比色管中,加入5 mL 福林酚試劑,加入3 mL 10% Na2CO3溶液,超純水定容至10 mL,充分混勻,避光反應60 min,測765 nm處吸光度值。每個樣品做3個平行。

1.2.4 抗氧化活性測定

1.2.4.1 DPPH清除率IC50測定 DPPH乙醇溶液配制:準確稱取DPPH粉末14.2 mg,用無水乙醇配制成0.72 mmol·L-1儲備液,低溫避光保存;臨用前稀釋為0.072 mmol·L-1使用。

樣品測定:樣品組(i):取3.0 mL DPPH乙醇溶液,加入0.5 mL不同濃度提取液;對照組(j):取3.0 mL無水乙醇,加入0.5 mL不同濃度提取液;空白組(c):取3.0 mL DPPH乙醇溶液,加入0.5 mL無水乙醇;充分混勻,37 ℃避光反應30 min,在516 nm處測定吸光值,用無水乙醇調(diào)零,抗壞血酸(VC)溶液作為陽性對照[18]。按以下公式計算各濃度下DPPH自由基清除率及IC50濃度。

計算公式:清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中:AC為未加抗氧化劑時DPPH溶液的吸光度,即空白組吸光度;Ai為加抗氧化劑后DPPH溶液的吸光度,即樣品組吸光度;Aj為提取液在測定波長的吸光度,即對照組吸光度。

1.2.4.2 FRAP測定 FRAP工作液配制:300 mmol·L-1乙酸鈉水溶液(pH=3.6):10 mmol·L-1TPTZ(使用40 mmol·L-1HCl水溶液配制):20 mmol·L-1FeCl3水溶液=10∶1∶1,體積比,現(xiàn)用現(xiàn)配,充分混勻后,置于37 ℃水浴中備用[19]。

標準曲線測定:取0.1 mL不同濃度的FeSO4溶液于10 mL比色管中,加入3 mL FRAP工作液,加入2 mL超純水,混勻,避光反應50 min,測596 nm處吸光度值。

樣品測定:取0.1 mL樣品提取液于10 mL比色管中,加入3 mL FRAP工作液,加入2 mL超純水,混勻,避光反應50 min,測596 nm處吸光度值。每個樣品做3個平行。

1.2.4.3 T-AOC測定 按照總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒說明書,準備各工作液。樣品測定組:取0.1 mL提取液于10 mL比色管中,加入檢測試劑3.5 mL,充分混合,在37 ℃水浴反應30 min,再加入顯色試劑0.1 mL,充分混勻,靜置10 min,在520 nm處測定吸光值;樣品對照組:取3.5 mL檢測試劑置于10 mL比色皿中,37 ℃水浴反應30 min,再加入顯色試劑0.1 mL,最終加入0.1 mL提取物液,充分混勻,靜止10 min,在520 nm處測定吸光值。用無水乙醇調(diào)零,抗壞血酸(VC)作為陽性對照。每個樣品做3個平行[20]。

總抗氧化能力(U·mL-1)=(測定管吸光度值-對照管吸光度值)×反應液(mL)×樣品測試前稀釋倍數(shù) ÷ 0.01 ÷ 30 ÷ 取樣量(mL)

1.2.4.4 還原力測定 樣品測定:取0.5 mL樣品液置于10 mL離心管中,加入2.5 mL 0.2 mmol·L-1PBS緩沖液(pH=6.6),加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,充分混勻,50 ℃水浴20 min后,加入2.5 mL 10%三氯乙酸;3000 r·min-1離心10 min,取2.5 mL上清液于一比色管中,加入2.5 mL超純水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液,充分混合,靜置10 min后,與700 nm處測定吸光度值[21]。用超純水調(diào)零,抗壞血酸(VC)作為陽性對照。每個樣品做3個平行。

1.2.4.5 鐵離子螯合測定 樣品測定:取1 mL樣品液于比色管中,加入0.1 mL 2 mmol·L-1FeCl2,室溫下靜置5 min;加入0.2 mL 5 mmol·L-1菲啰嗪溶液,超純水定容,混勻后靜置10 min,測562 nm處吸光度值[22]。用超純水調(diào)零,抗壞血酸(VC)作為陽性對照。每個樣品做3個平行。

1.2.5 UPLC測定沙棘黃酮中槲皮素、山奈酚、異鼠李素的含量

1.2.5.1 標準溶液配制 分別準確稱取標準品槲皮素、山奈酚、異鼠李素于10.0 mg于三個10 mL容量瓶中,甲醇(UPLC)充分溶解,定容,配制成適宜濃度的標準品母液,使用時取適量混勻稀釋至適宜濃度。

1.2.5.2 樣品供試液制備 稱取10.0 g沙棘粉末,加入30 mL乙醇,70 ℃回流60 min,離心,棄去上層油層,沉淀及上清攪拌均勻后轉(zhuǎn)移至錐形瓶,加入6.0 mL鹽酸溶液,加熱回流2 h,冷卻后,離心,棄去油層,溶液0.22 μm濾膜,保存?zhèn)溆肹23-25]。

1.2.5.3 UPLC條件 色譜柱:Waters BEH C18(2.1 mm×5 cm×1.7 μm);流動相:以甲醇為流動相A相,以0.1%甲酸-水溶液為流動相B相,按表1進行梯度洗脫;柱溫:35 ℃;進樣量:2 μL;流速:0.25 mL·min-1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.5.4 線性關(guān)系考察 取標準品母液適量混合,采用等倍逐級方式分別稀釋,得到標準曲線系列溶液,分別進樣2 μL,在“1.2.5.3”項色譜條件下分析。以標準品溶液濃度(μg·mL-1)為橫坐標,峰面積為縱坐標,得標準曲線方程。

1.2.5.5 精密度試驗 精密吸取上述混合標準品溶液2 μL,按“1.2.5.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄各成分的峰面積值,計算RSD值,確定儀器精密度是否良好。

1.2.5.6 重復性試驗 取同一沙棘樣品6份,精密稱定,按“1.2.5.2”項下方法制備供試品溶液,按“1.2.5.3”項下色譜條件進樣分析,記錄各成分的峰面積值,計算各成分含量和RSD值,確定方法的重復性是否良好。

1.2.5.7 加標回收率試驗 取已知各成分含量的樣品6份,精密稱定,加入一定體積混合標準品溶液,按“1.2.5.2”項下方法制備供試品溶液,按“1.2.5.3”項下色譜條件進樣分析,記錄各成分的峰面積值,計算各成分的加標回收率和RSD。

1.2.5.8 樣品測定 取“1.2.5.2”制備樣品供試液,進樣2 μL,在“1.2.5.3”項色譜條件下進樣分析,以外標法計算各成分含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均做3組平行,采用SPSS 17.0和Origin 8進行數(shù)據(jù)分析處理,結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘黃酮及多酚含測結(jié)果

以蘆丁濃度(C)為橫坐標,吸光度值(A)為縱坐標,得標準曲線(圖1):A=0.0245C+0.0065,R2=0.9980,表明標準品蘆丁在1.0～30.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好。測得黃酮含量見表2,沙棘A黃酮含量為(7.02±0.19) mg·g-1,沙棘B黃酮含量為(9.56±0.53) mg·g-1,沙棘B的黃酮含量高于沙棘A。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of the rutin

以沒食子酸(C)為橫坐標,吸光度值(A)為縱坐標,得標準曲線(圖2):A=0.0874C+0.0338,R2=0.9972,表明標準品沒食子酸在0.25～8.00 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好。測得多酚含量見表2,沙棘A多酚含量為(5.48±0.42) mg·g-1,沙棘B多酚含量為(24.33±1.44) mg·g-1,沙棘B的多酚含量高于沙棘A。

圖2 沒食子酸標準曲線Fig.2 Standard curve of gallic acid

表2 沙棘黃酮及多酚含量測定(n=9)Table 2 Determination of flavonoid and polyphenol(n=9)

綜上可知,沙棘B的多酚、黃酮含量均高于沙棘A,分別為沙棘A的4.44倍和1.36倍。檢測結(jié)果表明,不同產(chǎn)地沙棘樣品中黃酮、多酚的含量存在差異,可能與生長環(huán)境、采收時間有關(guān),其相關(guān)性尚需進一步深入研究[26-27]。

2.2 沙棘抗氧化活性結(jié)果

2.2.1 DPPH清除率測定結(jié)果 測定沙棘的DPPH清除率,由表3可知,沙棘A的DPPH清除率IC50濃度值為(128.953±0.098) μg·mL-1,沙棘B的DPPH清除率IC50濃度值為(7.521±0.027) μg·mL-1,陽性對照VC的DPPH清除率IC50濃度值為(15.139±0.046) μg·mL-1。沙棘B的IC50濃度比沙棘A、VC均小,約為沙棘A的1/17,約為VC的1/2。

表3 抗氧化活性測定結(jié)果表(n=9)Table 3 Results of antioxidant activity assay(n=9)

2.2.2 FRAP測定結(jié)果 以標準品硫酸亞鐵濃度(C)為橫坐標,以吸光度值(A)為縱坐標,繪制標準曲線(圖3):A=0.4582C+0.0495,R2=0.9995,表明在標準品濃度范圍0.1～2 mmol·L-1具有良好的線性關(guān)系。由表3可知,1 mg·mL-1沙棘A提取液的FRAP值為(0.5611±0.0042) mmol·L-1,1 mg·mL-1沙棘B的FRAP值為(0.4853±0.0067) mmol·L-1,沙棘A的FRAP值略高,但二者的FRAP值均明顯低于0.1 mg·mL-1陽性對照抗壞血酸(VC)的FRAP值(9.345±0.030) mmol·L-1。

圖3 硫酸亞鐵標準曲線Fig.3 Standard curve of FeSO4

2.2.3 T-AOC測定結(jié)果 由表3可知,1 mg·mL-1沙棘A的T-AOC值為(6.0457±0.3402) U·mL-1,1 mg·mL-1沙棘B的T-AOC值為(4.5318±0.1553) U·mL-1,沙棘A的T-AOC值比沙棘B略高。二者均低于0.1 mg·mL-1陽性對照抗壞血酸(VC)的T-AOC值為(17.68±0.98) U·mL-1。

2.2.4 還原力測定 由表3可知,1 mg·mL-1沙棘A的還原力測定值為(0.2071±0.0113),1 mg·mL-1沙棘B的還原力測定值為(0.2399±0.0104),0.1 mg·mL-1陽性對照抗壞血酸(VC)的還原力測定值為(0.3079±0.0036)。還原力測定值大小順序為:VC>沙棘B>沙棘A。

2.2.5 鐵離子螯合測定 由表3可知,1 mg·mL-1沙棘A的鐵離子螯合測定值為(0.3003±0.0164),1 mg·mL-1沙棘B的鐵離子螯合測定值為(0.8851±0.0077),0.01 mg·mL-1陽性對照抗壞血酸(VC)的鐵離子螯合測定值為(0.3337±0.0134)。鐵離子螯合測定值大小順序為:沙棘B>沙棘A。

2.3 UPLC測定沙棘黃酮中槲皮素、山奈酚、異鼠李素的含量

2.3.1 線性關(guān)系考察結(jié)果 繪制標準曲線,結(jié)果見表4,各成分在其濃度范圍1.0～40.0 μg·mL-1內(nèi),線性關(guān)系良好。

表4 黃酮中各成分的回歸方程Table 4 Regression equation of flavonoids components

2.3.2 精密度測定 連續(xù)進樣6次,結(jié)果見表5,其RSD值分別為0.34%、0.36%、0.36%,表明該儀器精密度良好。

表5 精密度試驗結(jié)果(n=6)Table 5 Results of precision test(n=6)

2.3.3 重復性測定 結(jié)果見表6,其RSD值分別為0.21%、0.64%、0.19%,表明該方法重復性較好。

表6 重復性試驗結(jié)果(n=6)Table 6 Results of repeatability test(n=6)

2.3.4 加標回收測定 結(jié)果見表7,槲皮素、山奈酚、異鼠李素的加標回收率分別為93.30%、90.90%、94.84%,其RSD值分別為0.58%、1.18%、0.98%,表明該方法較可靠、準確度高。

表7 加標回收率試驗結(jié)果(n=6)Table 7 Experimental results of standard addition recovery(n=6)

2.3.5 沙棘樣品測定 從圖4中可以看出提取液對所測定成分沒有干擾,標準品和樣品中相應的測定成分保留時間一致,整個實驗方法可靠、準確。

圖4 樣品A、樣品B及標準品色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of test and standard sample注:1.槲皮素;2.山奈酚;3.異鼠李素;A、B、C分別表示樣品A、樣品B和標準品。

沙棘樣品測定結(jié)果見表8,沙棘A槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量分別為:(0.6708±0.0410)、(0.0788±0.0292)和(1.5814±0.0372) mg·g-1,沙棘B槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量分別為:(0.9438±0.0403)、(0.1194±0.0153)和(1.0727±0.0406) mg·g-1。沙棘B含有較高含量的槲皮素和山奈酚,沙棘A的異鼠李素含量略高。

表8 黃酮中各組分含量測定結(jié)果(n=6)Table 8 Results of content determination of various constituents(n=6)

2.4 沙棘黃酮、多酚含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

大量研究表明,植物活性成分的抗氧化成分可能與黃酮、多酚含量相關(guān)[28-29]。為了進一步研究沙棘抗氧化活性與黃酮、多酚及沙棘中的黃酮化合物槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量的相關(guān)性,對相關(guān)數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計分析,結(jié)果見表9。由表9可知,黃酮、多酚及黃酮化合物槲皮素、山奈酚含量與還原力、DPPH自由基清除能力、鐵離子螯合能力均成正相關(guān),與FRAP值、T-AOC值成負相關(guān);黃酮化合物異鼠李素反之。

表9 黃酮、多酚含量與抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)Table 9 Correlations between values for antioxidant activities and the contents of flavonoid and polyphenol in samples

3 結(jié)論

2種沙棘的黃酮、多酚含量,抗氧化活性及槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量各不相同。沙棘B黃酮、多酚含量明顯高于沙棘A。沙棘A、B的抗氧化活性略有差異,但差別不明顯,DPPH自由基清除活性、還原力、鐵離子螯合能力順序:沙棘B>沙棘A,FRAP值、T-AOC值大小:沙棘A>沙棘B,結(jié)合各抗氧化指標,沙棘B的抗氧化能力略高于沙棘A。通過UPLC對沙棘A、B中槲皮素、山奈酚、異鼠李素的含量進行了測定,沙棘B槲皮素、山奈酚含量均高于沙棘A,而異鼠李素含量低于沙棘A。綜上所述,沙棘B多酚、黃酮含量及抗氧化活性均略優(yōu)于沙棘A。研究表明,黃酮、多酚類物質(zhì)具有良好的抗氧化活性。進一步實驗也驗證了黃酮、多酚的含量與其抗氧化活性具有相關(guān)性。由此證明,沙棘B可作為抗氧化功能食品的原料之一。此外,2種沙棘存在的差異可能與遺傳基因、地理位置以及土壤氣候環(huán)境有關(guān),需要更深入細致的研究。

本文采用了紫外分光光度法對沙棘總黃酮進行了測定,同時采用超高效液相色譜法對沙棘中較常見的槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量進行了測定,對二者進行了簡單的比較。沙棘A中,槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量之和約為測得總黃酮含量的33%;在沙棘B中,這個占比小于23%,這也提示對于沙棘B中的黃酮成分可以進一步分析研究。在抗氧化活性測定時,不同方法結(jié)果不盡相同,如何選取更合適的方法,測得更可靠的結(jié)果亦值得考察。本文為新疆沙棘資源培育和開發(fā)利用提供了理論基礎和數(shù)據(jù)參考。