陳 嫣,段振華,*,劉 艷,段秋霞,唐美玲,段偉文,唐小閑

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034;2.賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,廣西賀州 542899)

香芋(Colocasiaesculenta)又名地栗子、檳榔芋,屬天南星科魁芋屬植物,是熱帶潮濕地區(qū)普遍種植的根莖類經(jīng)濟(jì)作物,既可食用又可藥用,含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分,還含有多糖、酚類等活性物質(zhì),具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、健胃清腸、抗腫瘤和降血脂等功效[1-2]。我國(guó)南方特別是廣西地區(qū)香芋資源極豐富,且銷售價(jià)格低廉,可作為輔料加入食品,如廣西特色香芋扣肉,也可直接對(duì)其進(jìn)行加工,廣泛用于面包、蛋糕、脆片、冰淇淋、固體飲料、酸奶、調(diào)味品等食品中[3]。近年來隨著香芋加工不斷發(fā)展,香芋在加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物[4],主要是香芋皮。工廠很少對(duì)香芋皮進(jìn)行利用,大多數(shù)將其當(dāng)成肥料,有些甚至丟棄,這直接影響了香芋的加工利用率,造成資源浪費(fèi)。目前對(duì)香芋副產(chǎn)物香芋皮的研究甚少,陳秋娟等[5-7]研究了改性香芋皮粉末對(duì)Cr(Ⅵ)、Cu(Ⅱ)、Pb2+的吸附性能,將香芋皮應(yīng)用于吸附廢水中的重金屬離子,對(duì)改善環(huán)境有著積極的影響;施帥等[8]研究微波輔助提取芋頭生物堿工藝,但并沒有深入研究芋頭皮生物堿的作用;朱憲龍等[9]用超聲波輔助提取檳榔芋皮的生物堿并研究其抑菌性質(zhì)。研究表明在香芋皮中發(fā)現(xiàn)的活性成分為生物堿,而香芋皮中其他的組成成分尚未有文獻(xiàn)詳細(xì)報(bào)道,值得深入研究。因此研究香芋皮中的活性成分及其作用對(duì)香芋副產(chǎn)物的利用有重要意義。

香芋皮中生物堿的提取為香芋皮活性成分的提取提供了一定的參考。雖然香芋皮中其他活性成分的提取未見報(bào)道,但多酚在多種植物中廣泛存在,且植物中皮、根、葉和果等部位中大都含有植物多酚[10]。王佳宏[11]的研究也表明了芋頭中含有較多的多酚類物質(zhì),特別是近周皮部位。多酚類成分在抗氧化方面有著良好的效果,它可以有效的清除人體產(chǎn)生的自由基,以達(dá)到抗氧化、延緩衰老的目的,是安全有效的天然抗氧化劑[12-15],但目前尚未見到從香芋皮中提取多酚的研究。本文利用超聲波所產(chǎn)生的空化和熱效應(yīng)等特殊作用,能將多酚快速高效地提取出來[16-18]。因此本研究以香芋加工副產(chǎn)物香芋皮為原料,采用超聲輔助提取香芋皮多酚,并對(duì)抗氧化活性進(jìn)行研究,有助于揭示香芋皮具有的保健功能,為香芋副產(chǎn)物活性物質(zhì)的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香芋 購(gòu)于賀州百家福超市;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、六水合三氯化鐵、無水乙醇、抗壞血酸 分析純,廣東光華科技股份有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼自由基 分析純,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽 生物試劑,合肥博美生物科技有限公司;福林酚 生物試劑,上海源葉生物科技有限公司;無水碳酸鈉 分析純,西隴科學(xué)股份有限公司;沒食子酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀 分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠;過硫酸鉀 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

PTX-FA110S電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司;HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵 河南省予華儀器有限公司;DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;RE311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本雅馬拓(YAMATO);XH-300B微波超聲組合萃取儀 北京祥鵠科技有限公司;UV-1780紫外可見分光光度計(jì) 島津儀器(蘇州)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 香芋皮多酚的提取工藝 將購(gòu)買的香芋洗凈,用削皮刀削皮,厚度在1～2 mm,收集廢棄香芋皮放在60 ℃干燥箱中恒溫烘干,粉碎后過60目篩,貯于干燥避光處備用。按照一定料液比,精密稱取香芋皮粉末1.000 g,按照工藝研究中的不同參數(shù)設(shè)定超聲提取條件進(jìn)行多酚的提取,離心,上清液即為多酚溶液。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 超聲功率對(duì)香芋皮多酚得率的影響 稱取1.000 g香芋皮粉于50 mL的萃取瓶中,設(shè)定乙醇濃度為70%,料液比為1∶30 g/mL,提取時(shí)間為20 min,分別在100、200、300、400、500 W超聲功率的條件下進(jìn)行提取,平行試驗(yàn)三次,考察不同超聲功率對(duì)香芋皮多酚得率的影響,確定較佳超聲功率。

1.2.2.2 乙醇濃度對(duì)香芋皮多酚得率的影響 稱取1.000 g香芋皮粉于50 mL的萃取瓶中,設(shè)定超聲功率400 W,料液比為1∶30 g/mL,提取時(shí)間為20 min,分別在30%、40%、50%、60%、70%乙醇濃度的條件下進(jìn)行提取,平行試驗(yàn)三次,考察不同乙醇濃度對(duì)香芋皮多酚得率的影響,確定較佳乙醇濃度。

1.2.2.3 料液比對(duì)香芋皮多酚得率的影響 稱取1.000 g香芋皮粉于50 mL的萃取瓶中,設(shè)定超聲功率400 W,乙醇濃度50%,提取時(shí)間20 min,分別在1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL料液比的條件下進(jìn)行提取,平行試驗(yàn)三次,考察不同料液比對(duì)香芋皮多酚得率的影響,確定較佳料液比。

1.2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)香芋皮多酚得率的影響 稱取1.000 g香芋皮粉于50 mL的萃取瓶中,設(shè)定超聲功率400 W,乙醇濃度50%,料液比1∶50 g/mL,分別在10、20、30、40、50 min超聲時(shí)間的條件下進(jìn)行提取,平行試驗(yàn)三次,考察不同超聲時(shí)間對(duì)香芋皮多酚得率的影響,確定較佳超聲時(shí)間。

1.2.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,為了多方面的分析不同因素間的相互作用對(duì)超聲輔助提取香芋皮多酚的影響,根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的結(jié)果選擇正交表L9(34)對(duì)香芋皮中多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究,正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 香芋皮多酚得率的測(cè)定

1.2.4.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 參照文獻(xiàn)[19]的方法,略作修改。精確稱取0.2500 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,用蒸餾水溶解并定容到50 mL棕色容量瓶中,取1 mL用蒸餾水定容到100 mL,得到質(zhì)量濃度為50 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于8個(gè)10 mL容量瓶中,再分別加入2 mL福林酚試劑,振蕩搖勻,在0.5～8 min內(nèi)加入2.5 mL 12% Na2CO3溶液,反應(yīng)30 s后用蒸餾水定容,室溫避光反應(yīng)2 h,用蒸餾水作空白對(duì)照,在765 nm下測(cè)定其吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo),沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到?jīng)]食子酸在濃度0～7 μg/mL內(nèi)與其吸光值呈良好的線性關(guān)系,得到線性回歸方程y=0.13112x+0.00772,相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

1.2.4.2 多酚得率計(jì)算 精密量取提取液0.1 mL于10 mL容量瓶中,按1.2.4.1所述的方法測(cè)定提取液的吸光值,將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中,計(jì)算出樣品液中多酚的濃度,代入下式中計(jì)算出1.000 g香芋皮粉末中多酚類物質(zhì)的含量(以沒食子酸計(jì),mg/g),計(jì)算公式如式(1)所示。

式(1)

式中:X表示香芋皮多酚得率,mg/g;C表示樣品液中多酚的濃度,μg/mL;V表示提取液的總體積,mL;m表示稱取的香芋皮粉的質(zhì)量,g。

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定 將1.2.1提取出多酚溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后測(cè)定其濃度,最后稀釋成適當(dāng)濃度進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定。

1.2.5.1 總還原能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[20]測(cè)定2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 μg/mL的香芋皮多酚、VC和沒食子酸溶液在700 nm處的吸光度值,吸光度值越高表明其總還原能力越強(qiáng)。

1.2.5.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[21]在517 nm處測(cè)定0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 μg/mL的香芋皮多酚、VC和沒食子酸溶液對(duì)DPPH自由基的清除能力,計(jì)算清除率。計(jì)算公式見式(2)。

式(2)

式中:Ai表示2.0 mL樣品液與2.0 mL 0.02 mmol/L DPPH溶液的吸光度值;Aj表示2.0 mL樣品液與2.0 mL無水乙醇的吸光度值;A0表示2.0 mL 0.02 mmol/L DPPH溶液與2.0 mL無水乙醇的吸光度值。

1.2.5.3 ABTS自由基清除率測(cè)定 參照文獻(xiàn)[22]在734 nm處測(cè)定0、20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL的香芋皮多酚、VC和沒食子酸溶液對(duì)ABTS自由基的清除能力,計(jì)算清除率。計(jì)算公式見式(3)。

式(3)

式中:Ai表示0.1 mL樣品液與3.9 mL ABTS溶液的吸光度值;Aj表示0.1 mL樣品液與3.9 mL 10 mmol/L磷酸緩沖溶液的吸光度值;A0表示0.1 mL 10 mmol/L磷酸緩沖液與3.9 mL ABTS溶液的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作,運(yùn)用Origin 8.5和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析和圖形繪制,測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。根據(jù)IC50來判斷其抗氧化能力,IC50值越小,樣品抗氧化活性越強(qiáng)[23]。IC50的定義為:使得自由基的清除率達(dá)到50%時(shí)需要的樣品液的濃度,通過SPSS 20.0求出IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲功率對(duì)香芋皮多酚得率的影響

由圖1知,在超聲功率100～200 W范圍時(shí),超聲波功率對(duì)香芋皮多酚得率的影響不大,這是因?yàn)樾」β史秶鷥?nèi)超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)和能量較小,不能有效破壞組織細(xì)胞,功率在200 W以下時(shí)對(duì)多酚得率幾乎無影響。超聲功率從200 W提升至400 W時(shí),香芋皮多酚得率逐漸提高,在400 W時(shí)達(dá)到最大值。超聲功率繼續(xù)增大時(shí),多酚得率開始下降,這主要是由于超聲功率增加,超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)使體系溫度升高,促使細(xì)胞破裂,分子擴(kuò)散、滲透和溶解速度加快,有利于多酚物質(zhì)的浸出[24],但功率過大時(shí)會(huì)使多酚結(jié)構(gòu)破壞,雜質(zhì)溶出過多,使多酚得率降低[25]。綜合節(jié)約能耗和提高多酚得率的角度考慮,選取350、400、450 W的超聲功率為正交試驗(yàn)篩選水平范圍。

圖1 超聲功率對(duì)香芋皮多酚得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polyphenols from taro peel

2.2 乙醇濃度對(duì)香芋皮多酚得率的影響

由圖2可知,乙醇濃度對(duì)多酚提取效果影響較大,整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)得率達(dá)到最大值,乙醇濃度超過50%后,香芋皮多酚得率開始迅速下降,這可能是由于香芋皮中存的多酚與50%乙醇極性相同,有機(jī)溶劑與水的混合液可以打斷多酚類物質(zhì)-蛋白質(zhì)(多糖)復(fù)合物的結(jié)合鍵,從而釋放多酚物質(zhì)[26]。但高濃度乙醇使細(xì)胞膜變性,導(dǎo)致多酚不能很好的溶解出來[27],另外一些醇溶性雜質(zhì)的溶出也會(huì)與多酚競(jìng)爭(zhēng)與乙醇結(jié)合,造成多酚含量降低。綜合節(jié)約能耗和提高多酚得率的角度考慮,選取45%、50%、55%的乙醇濃度為正交試驗(yàn)篩選水平范圍。

圖2 乙醇濃度對(duì)香芋皮多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols from taro peel

2.3 料液比對(duì)香芋皮多酚得率的影響

由圖3可知,隨著料液比增大,香芋多酚得率呈逐漸上升趨勢(shì),當(dāng)料液比到達(dá)1∶50 g/mL時(shí)出現(xiàn)峰值,之后趨于平緩。這是因?yàn)榱弦罕冗^低,溶液已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài),不利于提取物溶出,提取不完全。料液比的不斷增加,增大了香芋皮粉末與溶劑的接觸面積,增大細(xì)胞壁內(nèi)外的物質(zhì)的擴(kuò)散速度,加快了多酚的溶出[28],但由于在一定質(zhì)量的香芋皮粉里所含的多酚類物質(zhì)有限,所以在料液比1∶50 g/mL之后多酚在溶劑中的得率達(dá)到飽和狀態(tài),再加大料液比并不能顯著提高多酚的得率,而且耗費(fèi)溶劑量變多,也會(huì)造成浪費(fèi)。綜合節(jié)約能耗和提高多酚得率的角度考慮,選取1∶45、1∶50、1∶55 g/mL的料液比為正交試驗(yàn)篩選水平范圍。

圖3 料液比對(duì)香芋皮多酚得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polyphenols from taro peel

2.4 超聲時(shí)間對(duì)香芋皮多酚得率的影響

由圖4可知,在小于30 min時(shí),多酚得率呈上升的趨勢(shì),這是由于超聲波獨(dú)具的物理性質(zhì)能夠促使植物細(xì)胞組織破壁或變形,使多酚物質(zhì)溶出,但提取時(shí)間短會(huì)導(dǎo)致提取不充分,提取30 min時(shí)香芋皮多酚的得率達(dá)到最佳。當(dāng)時(shí)間超過30 min時(shí),隨著時(shí)間增長(zhǎng),超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)逐漸累積[29],強(qiáng)烈的熱效應(yīng)會(huì)使分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,時(shí)間過長(zhǎng)也會(huì)使多酚類物質(zhì)被氧化分解[30],導(dǎo)致多酚得率下降。綜合節(jié)約能耗和提高多酚得率的角度考慮,選取25、30、35 min超聲時(shí)間為正交試驗(yàn)篩選水平范圍。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)香芋皮多酚得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of polyphenols from taro peel

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇超聲功率、乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),以確定提取香芋皮多酚的最優(yōu)工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2中R1、R2、R3、R4可知4個(gè)因素對(duì)香芋皮多酚得率的影響程度依次為:B(乙醇濃度)>C(料液比)>A(超聲功率)>D(超聲時(shí)間),即最顯著的影響因素是乙醇濃度,超聲時(shí)間的影響最不顯著。正交試驗(yàn)得到香芋皮多酚得率的最佳提取工藝組合為A2B1C3D3,即超聲功率400 W,乙醇濃度45%,料液比1∶55 g/mL,超聲時(shí)間35 min。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

由于最佳組合沒有在正交表的組合中,所以按照k值計(jì)算法得到的最佳組合A2B1C3D3做驗(yàn)證試驗(yàn),在該工藝下進(jìn)行五次平行試驗(yàn)得到平均值為(23.61±0.36) mg/g,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.54%。驗(yàn)證試驗(yàn)所得結(jié)果均優(yōu)于正交試驗(yàn)表中任意一個(gè)組合的得率,說明經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的提取工藝組合較為可靠。

2.7 抗氧化活性測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

2.7.1 總還原能力的測(cè)定結(jié)果 由圖5可知,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)香芋皮多酚的總還原能力隨著濃度的增加而增強(qiáng),存在良好的線性關(guān)系和劑量-效應(yīng)關(guān)系[31],當(dāng)濃度為20.0 μg/mL時(shí)香芋皮多酚的還原能力為0.4431±0.0027。在所測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),可以看出香芋皮多酚的總還原能力略高于VC,但明顯低于沒食子酸。

圖5 還原能力試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of reduction capacity

2.7.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定 由圖6可知,香芋皮多酚、VC和沒食子酸在較低的濃度范圍就有很好的DPPH自由基清除能力,并隨著濃度的增大而增強(qiáng),香芋皮多酚在濃度小于12.5 μg/mL時(shí)與DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,當(dāng)濃度達(dá)到12.5 μg/mL之后變化趨于緩慢,IC50為(5.6647±0.2545) μg/mL;VC在濃度小于15.0 μg/mL時(shí)與DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,濃度達(dá)到15.0 μg/mL之后變化趨于緩慢直至基本不變,IC50為(6.9018±0.0470) μg/mL;沒食子酸在濃度小于5.0 μg/mL時(shí)與DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)線性關(guān)系,大于5.0 μg/mL時(shí)變化趨于緩慢直至基本不變,IC50為(1.6843±0.2025) μg/mL。由IC50大小判斷出香芋皮多酚DPPH自由基清除率高于VC但是遠(yuǎn)小于沒食子酸。在20.0 μg/mL時(shí)香芋皮多酚、VC和沒食子酸的DPPH清除率達(dá)到87.7179%±0.1419%、93.7033%±0.1130%和93.7192%±0.1132%,綜合IC50值可以得出,香芋皮多酚對(duì)DPPH自由基有較好的清除效果。

圖6 DPPH自由基清除試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of DPPH free radical scavenging capacity

2.7.3 ABTS自由基清除率測(cè)定 由圖7可知,香芋皮多酚、VC和沒食子酸對(duì)ABTS自由基的清除能力都是隨著底物濃度的增大而增強(qiáng),香芋皮多酚、VC和沒食子酸分別在濃度小于100、160、40 μg/mL時(shí)與ABTS自由基的清除率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,之后變化趨于緩慢基本不變。計(jì)算出IC50分別為(36.3630±2.4013)、(61.6051±0.9560)、(14.5621±0.1483) μg/mL,由IC50判斷出ABTS自由基的清除率大小順序?yàn)闆]食子酸>香芋皮多酚>VC。在160 μg/mL時(shí)香芋皮多酚、VC和沒食子酸的ABTS清除率均達(dá)到99%以上,無顯著差異。香芋皮多酚ABTS自由基清除率最大可達(dá)到99.8242%±0.0718%。綜上,香芋皮多酚對(duì)ABTS自由基有較好的清除能力。

圖7 ABTS自由基清除試驗(yàn)Fig.7 Results of ABTS free radical scavenging capacity

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)提取香芋皮多酚的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化,影響香芋皮多酚得率主次因素依次為:乙醇濃度>料液比>超聲功率>超聲時(shí)間,其中最顯著的影響因素是乙醇濃度;超聲提取香芋皮中多酚的最佳工藝條件為超聲功率400 W,乙醇濃度45%,料液比1∶55 g/mL,超聲時(shí)間35 min,此條件下香芋皮中多酚得率達(dá)到(23.61±0.36) mg/g。

抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明,在最佳條件下提取得到的香芋皮多酚具有一定的還原能力,對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基清除作用均表現(xiàn)出良好的清除效果,相應(yīng)的IC50值分別為(5.6647±0.2545)和(36.3630±2.4013) μg/mL。