劉嘉瑋,張馨蕓,林慧嬌,苑麗葳,劉佳樂(lè),王春梅,孫靖輝,張成義,陳建光,李 賀,敬 舒

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林吉林 132013;2.吉林市中心醫(yī)院,吉林吉林 132013;3.北華大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林吉林 132013)

我國(guó)正處于人口老齡化的高潮期,面臨著十分嚴(yán)峻的老齡化形勢(shì)[1]。衰老是機(jī)體生命過(guò)程中不可避免的現(xiàn)象,是指生物在發(fā)育成熟后,機(jī)體組織器官隨著時(shí)間推移,功能逐漸衰退的過(guò)程[2-3]。衰老過(guò)程中,神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的機(jī)能顯著下降,機(jī)體會(huì)逐漸出現(xiàn)力量下降、運(yùn)動(dòng)耐力下降等疲勞表現(xiàn),對(duì)生活質(zhì)量影響較大[4]。因此,研發(fā)具有抗衰老及抗疲勞的藥物和保健食品將對(duì)提高老齡人口的生活質(zhì)量具有十分重要的意義[5]。

南五味子也稱(chēng)華中五味子,是木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí),具有收斂、滋補(bǔ)、保肝、抗癌、抗氧化等活性,是藥物和保健食品開(kāi)發(fā)的理想資源[6]。安五脂素(Anwulignan,AN)是南五味子木脂素中具有代表性的單體活性成分,但關(guān)于其功效研究較少,目前僅有研究報(bào)道其對(duì)血小板聚集有一定的抑制作用[7],含安五脂素的中藥制劑五酯片對(duì)肝功能具有改善作用[8]。在本研究前期工作中發(fā)現(xiàn),安五脂素對(duì)D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠的肝臟具有顯著的保護(hù)作用[9],顯示出較好的抗衰老活性。但關(guān)于其對(duì)衰老小鼠運(yùn)動(dòng)耐力及疲勞相關(guān)血清尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、乳酸(Lactic acid,LD)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(Creatine kinase,CK)的含量的影響未見(jiàn)報(bào)道。

因此,本研究應(yīng)用D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠亞急性衰老模型以觀察安五脂素的抗疲勞作用,以期為開(kāi)發(fā)抗衰老和抗疲勞藥物及保健食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

安五脂素 由四川省維克奇生物科技有限公司提供;BUN、LD、LDH、CK、超氧化物酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒 由南京建成生物工程研究所提供;雄性ICR小鼠40只(合格證號(hào):SCXK(吉)2019-0004) 由長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

YLS-13A型大小鼠抓力測(cè)定儀 由成都泰盟軟件有限公司提供;YLS-4C型小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒儀 由上海軟隆科技發(fā)展有限公司提供;ChampChemi 500型全自動(dòng)多色熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 由北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司提供;全自動(dòng)酶標(biāo)儀 由瑞士TECAN集團(tuán)公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(CON)、模型組(MOD)、低劑量AN組、高劑量AN組。CON組、MOD組給予0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液10 mg/kg灌胃,AN低劑量組和高劑量組分別給予1，4 mg/kg的AN灌胃。除CON組皮下注射生理鹽水外,其他組均皮下注射D-半乳糖(220 mg/kg)。每日一次,持續(xù)6周。

1.2.2 小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 于末次給予藥物60 min之后,進(jìn)行疲勞轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)(轉(zhuǎn)速30 r/min)。在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)前,提前進(jìn)行3次適應(yīng)性訓(xùn)練,然后記錄小鼠從轉(zhuǎn)棒上跌落的時(shí)間。

1.2.3 小鼠前肢握力實(shí)驗(yàn) 于末次給予藥物60 min之后,進(jìn)行小鼠前肢握力的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)小鼠喜用爪抓物的習(xí)性[10],應(yīng)用前肢握力測(cè)試儀,對(duì)各組小鼠進(jìn)行前肢握力測(cè)試,將小鼠可接受的最大張力作為其前肢握力。

1.2.4 小鼠體內(nèi)疲勞相關(guān)的生化指標(biāo)檢測(cè) 于末次給予藥物60 min之后,麻醉,眼球采血后3000 r/min離心10 min制備血清,取骨骼肌生理鹽水漂洗后,以備用。檢測(cè)血清中BUN、LD、LDH、CK的水平。

1.2.5 小鼠體內(nèi)氧化相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè) 取上述制備的骨骼肌組織,參照相應(yīng)試劑盒所提供的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)SOD活力和MDA的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 安五脂素對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和前肢握力實(shí)驗(yàn)被廣泛用于評(píng)估動(dòng)物的體力和疲勞程度[11-12]。如圖1A所示:轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中,與CON組相比,MOD組轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間極顯著縮短(P<0.01);與MOD組相比,An-H組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間顯著增加(P<0.05)。前肢握力實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1B所示:與CON組相比,MOD組小鼠前肢握力極顯著縮短(P<0.01);與MOD組相比,An-L組小鼠和An-H組小鼠前肢握力顯著增加(P<0.05或P<0.01)。提示安五脂素能夠增強(qiáng)D-半乳糖致衰老小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。

圖1 安五脂素對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響(Mean±SD,n=10)Fig.1 Effects of anwulignan on exercise endurance in mice(Mean±SD,n=10)注:A:疲勞轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn);B:前肢握力實(shí)驗(yàn)。#表示與CON組相比,P<0.05;##表示與CON相比,P<0.01;*表示與MOD組相比,P<0.05,**表示與MOD組相比,P<0.01；圖2～圖3同。

2.2 安五脂素對(duì)小鼠疲勞相關(guān)生化指標(biāo)含量的影響

2.2.1 安五脂素對(duì)小鼠血清BUN含量的影響 BUN是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物,同時(shí)是體力負(fù)荷時(shí)承受能力的指標(biāo),其含量反映了蛋白質(zhì)分解代謝和身體對(duì)運(yùn)動(dòng)的耐受性[13-14]。在本研究中,小鼠血清BUN含量檢測(cè)結(jié)果顯示圖2A,與CON組相比,MOD組小鼠BUN含量顯著升高(P<0.05),與MOD組相比,An-H組小鼠BUN含量顯著下降(P<0.05)。提示AN可以降低血清BUN含量,增強(qiáng)D-半乳糖致衰老小鼠的運(yùn)動(dòng)耐受性。

圖2 安五脂素對(duì)小鼠體內(nèi)疲勞相關(guān)生化指標(biāo)活性及含量的影響(Mean±SD,n=10)Fig.2 Effects of anwulignan on fatigue-related biochemical indexes in mice(Mean±SD,n=10)注:A：BUN;B：LD;C:LDH;D：CK。

2.2.2 安五脂素對(duì)小鼠血清LD含量的影響 LD水平是對(duì)機(jī)體有氧代謝能力和疲勞程度的反映,機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間大量運(yùn)動(dòng)會(huì)使血液中乳酸的濃度升高,乳酸堆積的越多疲勞的程度就越嚴(yán)重[15]。在運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中,有氧能量供應(yīng)變?yōu)榧∪庵械臒o(wú)氧糖酵解,產(chǎn)生大量的LD,LD在肌肉和血液中的累積會(huì)導(dǎo)致肌肉疲勞[16-18]。對(duì)各組小鼠血清LD活性檢測(cè)結(jié)果顯示圖2B,與CON組相比,MOD組小鼠LD含量極顯著升高(P<0.01),與MOD組相比,An-L組An-H組小鼠血清LD含量顯著下降(P<0.05)。提示安五脂素可以降低血清LD含量,緩解D-半乳糖致衰老小鼠的疲勞程度。

2.2.3 安五脂素對(duì)小鼠血清LDH含量的影響 血清中LDH的量反映機(jī)體運(yùn)動(dòng)肌肉損傷的程度。當(dāng)肌肉受損時(shí)細(xì)胞破裂,LDH釋放入血使其在血液中的活性升高[19-20]。對(duì)各組小鼠血清LDH活性檢測(cè)結(jié)果顯示圖2C,與CON組相比,MOD組小鼠血清中LDH活性極顯著升高(P<0.01),與MOD組相比,An-L組和An-H組小鼠血清LDH活性顯著下降(P<0.05或P<0.01)。提示安五脂素可以降低血清LD含量,緩解D-半乳糖致衰老小鼠肌肉損傷程度,顯示出抗疲勞作用。

2.2.4 安五脂素對(duì)小鼠血清CK含量的影響 CK是判定肌肉損傷的另一重要指標(biāo),在一定程度反映了機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力[21]。對(duì)各組小鼠血清CK含量檢測(cè)結(jié)果顯示圖2D,與CON組相比,MOD組小鼠血清CK含量顯著升高(P<0.05);與MOD組相比,An-H組小鼠血清CK含量顯著降低(P<0.05),進(jìn)一步證明安五脂素對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠具有抗疲勞作用。

2.3 安五脂素對(duì)小鼠骨骼肌氧化相關(guān)生化指標(biāo)含量的影響

2.3.1 安五脂素對(duì)小鼠骨骼肌SOD活性的影響 在緩解疲勞的過(guò)程中,SOD是人體中最主要的抗氧化酶,發(fā)揮著保持體內(nèi)氧化和抗氧化平衡的作用[22-23]。在本實(shí)驗(yàn)中,對(duì)各組小鼠骨骼肌中SOD活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3A,與CON組相比,MOD組小鼠SOD活性極顯著下降(P<0.01);與MOD組相比,An-L組和An-H組小鼠SOD活性顯著升高(P<0.05或P<0.01)。提示安五脂素可能通過(guò)增加SOD活性,增強(qiáng)抗氧化能力而發(fā)揮對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠抗疲勞作用。

2.3.2 安五脂素對(duì)小鼠骨骼肌MDA含量的影響 MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物,是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的重要參數(shù),能間接反映組織中過(guò)氧化損傷的程度[24-25]。對(duì)各組小鼠骨骼肌中MDA含量結(jié)果顯示圖3B,與CON相比,MOD組小鼠MDA含量顯著升高(P<0.05);與MOD組相比,An-H組小鼠骨骼肌中MDA含量顯著下降(P<0.05)。提示安五脂素減輕了D-半乳糖致衰老小鼠鼠骨骼肌的氧化損傷,這可能是安五脂素發(fā)揮抗疲勞作用的主要機(jī)制之一。

圖3 安五脂素對(duì)小鼠體內(nèi)氧化相關(guān)生化指標(biāo)的影響(Mean±SD,n=10)Fig.3 Effect of anwulignan on oxidation-related biochemical indicators in mice(Mean±SD,n=10)注：A:SOD;B:MDA;#:與CON組相比,P<0.05;##:與CON相比,P<0.01;*與MOD組相比,P<0.05,**與MOD組相比,P<0.01。

3 討論與結(jié)論

我國(guó)已進(jìn)入老齡化國(guó)家行列,衰老伴有的疲勞已成為影響老年人生活質(zhì)量的主要問(wèn)題之一[26-27]。因此研發(fā)能夠延緩衰老同時(shí)抑制疲勞的藥物和保健食品將具有廣闊的市場(chǎng)前景和深遠(yuǎn)的社會(huì)效益。本研究通過(guò)觀察安五脂素對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠運(yùn)動(dòng)耐力及疲勞相關(guān)生化指標(biāo)的影響,首次明確了安五脂素對(duì)小鼠衰老所致疲勞的抑制作用,為開(kāi)發(fā)抗疲勞和衰老藥物和保健食品提供了理論依據(jù)。

D-半乳糖誘導(dǎo)亞急性衰老動(dòng)物模型是經(jīng)典的衰老模型構(gòu)建方法。與其他相關(guān)報(bào)道完全一致,本研究在連續(xù)皮下注射D-半乳糖后,運(yùn)動(dòng)耐力和疲勞相關(guān)生化指標(biāo)均顯示小鼠呈現(xiàn)疲勞狀態(tài)[28-29]。而給予安五脂素后,小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒及前肢握力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)耐力增強(qiáng),表現(xiàn)出顯著的抗疲勞作用。為進(jìn)一步明確安五脂素的抗疲勞作用,本研究對(duì)小鼠血清BUN、LD、LDH及CK等評(píng)估機(jī)體疲勞程度最經(jīng)典指標(biāo)進(jìn)行觀察。研究結(jié)果顯示,安五脂素能夠降低D-半乳糖所致衰老小鼠血清中上述生化指標(biāo)水平,進(jìn)一步證實(shí)了安五脂素對(duì)衰老小鼠具有抗疲勞作用。

衰老時(shí)骨骼肌氧自由基與體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)平衡狀態(tài)被打破,ROS產(chǎn)生過(guò)多,骨骼肌產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[30-31]。本研究結(jié)果顯示,安五脂素可以提高小鼠骨骼肌中SOD的活性,降低MDA含量,這與前期研究中安五脂素對(duì)D-半乳糖致衰小鼠肝組織中SOD及MDA水平的影響是完全一致的[9]。提示安五脂素可能通過(guò)顯著的抗氧化作用發(fā)揮抗疲勞及抗衰老作用。Nrf2/ARE是機(jī)體抗氧化作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路,前期研究中發(fā)現(xiàn),安五脂素可以激活衰老小鼠肝及腦組織中Nrf2/ARE通路相關(guān)蛋白[9]。因此推測(cè),安五脂素在本研究中所顯示的抗疲勞作用也可能與Nrf2/ARE通路有關(guān),具體相關(guān)機(jī)制將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中深入探討。

本研究依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用低(1 mg/kg)、高(4 mg/kg)兩個(gè)劑量對(duì)安五脂素的抗疲勞作用進(jìn)行觀察。研究結(jié)果顯示,4 mg/kg 安五脂素對(duì)運(yùn)動(dòng)耐力及疲勞、氧化等全部測(cè)定指標(biāo)均具有顯著影響,而1 mg/kg對(duì)BUN、CK、MDA等指標(biāo)的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示安五脂素對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠的抗疲勞作用可能與劑量相關(guān),其具體的劑量效應(yīng)關(guān)系將在后續(xù)的研究中進(jìn)行觀察。

綜上,安五脂素對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠具有顯著的抗疲勞作用,該作用可能與其發(fā)揮抗氧化活性有關(guān)。