林沛純,諶素華,鄭素麗

(1.廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,廣東湛江 524088;2.廣東海洋大學(xué)深圳研究院,廣東深圳 518108;3.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088)

膽酸鹽是指人和動物的膽汁中由膽固醇衍生而來的具有甾核結(jié)構(gòu)的一類兩性大分子,對脂肪和膽固醇的消化吸收和脂溶性維生素的代謝起重要作用[1]。高脂血癥俗稱高血脂,是因?yàn)檠x障礙所致脂質(zhì)水平(總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇)異常,它是各種健康疾病相關(guān)的主要危險(xiǎn)因素之一,包括肥胖和心血管疾病,高血脂每年在世界上造成400萬人死亡[2]。機(jī)體內(nèi)膽固醇的合成主要在肝臟和腸上皮之后小腸進(jìn)行吸收,通過膽汁和糞便進(jìn)行排泄[3]。膽固醇以膽汁酸形式排出體外,膽汁酸可與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合形成膽酸鹽。因此減少腸道內(nèi)的膽酸鹽,對降膽固醇、降血脂有著重要作用。任丹丹[4]研究已證明從植物黃秋葵中提取的多糖具備吸附膽酸鹽的能力,田月月[5]研究證明了大豆多糖也具備吸附膽酸鹽的能力,劉萍等[6]證實(shí)芋頭多糖能在體外吸附膽酸鹽。

馬尾藻屬褐藻門、墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬[7]。我國的馬尾藻種類繁多,資源豐富,但開發(fā)利用程度較低[8]。馬尾藻多糖主要是巖藻聚糖硫酸酯,其單糖組成主要是巖藻糖,并含有活性基團(tuán)硫酸基,英文名是fucoidan,最早是由Kylin在二十世紀(jì)初提出來并命名的[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)該糖具有抗腫瘤、抗凝血、抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[10-20],具有極大的藥用價(jià)值。這些活性主要是與巖藻糖的含量、活性基團(tuán)硫酸基含量以及所在位置等密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究不同組分的亨氏馬尾藻巖藻聚糖體外吸附膽酸鹽的能力,為亨氏馬尾藻巖藻聚糖降膽固醇活性及其機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ),為馬尾藻巖藻聚糖的綜合利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亨氏馬尾藻 采自廣東省湛江市硇洲島海域;DEAE-52纖維素 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;葡萄糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖 色譜純,購自上海源葉生物科技有限公司;糠醛、PMP分析純 上海麥克林生物科技有限公司;?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉Aladdin Industrial Corporation;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

V-5000型可見分光光度儀 上海元析儀器有限公司;FD8508型冷凍干燥機(jī) 韓國ilShin公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理 將新鮮的亨氏馬尾藻進(jìn)行清洗、曬干、干燥、粉碎,最后過80目篩得到亨氏馬尾藻粉。

1.2.2 亨氏馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯粗多糖的提取 取適量上述馬尾藻粉,按照1∶30的料液比加入蒸餾水,采用超聲波輔助水提法[21]、離心、取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,進(jìn)行二次醇沉除去褐藻膠,將所得沉淀用丙酮和無水乙醇洗滌以除去脂肪,真空冷凍干燥,制得亨氏馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯粗品(HSP0),取2 g HSP0溶于150 mL蒸餾水中,攪拌溶解得多糖液,加入sevage試劑除蛋白質(zhì)[22],劇烈搖晃,離心取上清液,重復(fù)操作至離心時(shí)無沉淀產(chǎn)生,透析48 h后,真空冷凍干燥得到粗多糖(HSP1)。

1.2.3 HSP1的分離純化 將DEAE-52纖維素用0.5 mol/L NaOH、0.5 mol/L HCl、0.5 mol/L NaCl溶液進(jìn)行活化,依次用0、0.5、1.0、1.5 mol/L NaCl溶液對HSP1溶液進(jìn)行洗脫,依次洗脫出的組分分別命名為F0、F1、F2、F3。根據(jù)苯酚硫酸法[23]所檢測得到的吸光度值,繪制洗脫管數(shù)與吸光度值的洗脫曲線,收集曲線中同一峰型的樣品。

1.2.4 化學(xué)組成測定 采用苯酚硫酸法[23]測定多糖含量;半胱氨酸鹽酸鹽法[24]測定L-巖藻糖含量;明膠比濁法[25]測定硫酸基團(tuán)含量;間羥基聯(lián)苯法[23]測定糖醛酸含量。

1.2.5 單糖組成分析 根據(jù)化學(xué)組成中多糖、硫酸基和巖藻糖的含量較高,所以選擇HSP0和F2進(jìn)行單糖組成分析,采用高效液相色譜法進(jìn)行分析。參考王晶[26]、戴軍[27]、Fu[28]等人的方法,并略作改動。色譜條件:Agilent1100高效液相色譜儀;色譜柱為XDB-C18,柱溫為30 ℃,柱流量為1.0 mL/min,以磷酸二氫鉀緩沖液(0.05 mol/L,pH7.6)/乙腈(83∶17)為流動相,進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.6 膽酸鹽的測定 參照周小理等[29]采用的糠醛比色法,并做一定修改。分別配制質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的甘氨膽酸鈉、膽酸鈉、牛磺膽酸鈉溶液。配制一系列不同濃度梯度的膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入40%硫酸和0.3%糠醛進(jìn)行反應(yīng),在620 nm波長處測定吸光度,繪制濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 亨氏馬尾藻巖藻聚糖體外吸附膽酸鹽能力的測定 參照周小理等[29]采用的糠醛比色法,并做出一定修改。根據(jù)課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和鐘思燕[30]的實(shí)驗(yàn)中不同馬尾藻粗多糖膽酸鹽結(jié)合率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇一定濃度的組分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。把多糖樣品加入到配制好的膽酸鹽溶液中進(jìn)行反應(yīng),1.5 h 后進(jìn)行離心,在620 nm波長處測定吸光度值,根據(jù)下面公式計(jì)算得各組分馬尾藻巖藻聚糖對膽酸鹽的吸附量。

膽酸鹽吸附率(%)=(1-C1/C0)×100

式中,C1-多糖溶液中膽酸鹽濃度(mg/mL);C0-空白溶液中膽酸鹽濃度(mg/mL)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理,采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSP1的分離純化

如圖1所示,可以得到四個(gè)主要的糖峰,從左到右依次是F0、F1、F2、F3。F0是用蒸餾水洗脫得到的組分,未被纖維素交換,大多是中性糖,所以硫酸基團(tuán)含量少,故本次實(shí)驗(yàn)不對F0進(jìn)行研究;NaCl溶液洗脫出來的是酸性糖,根據(jù)硫酸基團(tuán)的含量不同進(jìn)行洗脫,從而達(dá)到分離純化的效果。

圖1 DEAE-52纖維素層析柱洗脫曲線

2.2 亨氏馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)組成分析

通過表1可知,五種組分均含有多糖、硫酸基、巖藻糖和糖醛酸,但含量占比不一樣。HSP0的多糖含量最大,高達(dá)37.87%,經(jīng)過脫蛋白處理后,HSP1的多糖、硫酸基、巖藻糖含量均有所減少,而糖醛酸的含量升高了3.43%。由于不同濃度NaCl溶液洗脫,F1、F2、F3三種組分的多糖、硫酸基、巖藻糖和糖醛酸的含量存在差異。其中多糖含量從高到低分別是F2、F1、F3,F2比F3升高了6.72%;F2、F3的硫酸基、巖藻糖含量高于F1,F3的硫酸基含量比F1高13.25%,F2的巖藻糖含量比F1高12.56%;而F1糖醛酸的含量高于F2和F3,分別高出 20.89%和21.52%。

表1 五種馬尾藻巖藻聚糖的化學(xué)組成(%)

2.3 單糖組成分析

由表2可知,HSP0與F2均含有六種單糖,但各種單糖的含量存在差異。HSP0中含量最高的是葡萄糖,巖藻糖和半乳糖次之,百分含量分別為48.01%、22.03%和18.59%,葡萄糖所占比例高于其它單糖,幾乎占所有單糖的一半,其中含量最少的是鼠李糖,只有0.94%;在F2中,主要含有巖藻糖、半乳糖、甘露糖,百分含量分別為38.20%、34.72%、14.08%,其中巖藻糖所占比例遠(yuǎn)高于其它單糖,含量最少的是鼠李糖,與HSP0一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過分級純化的馬尾藻巖藻聚糖,糖鏈上巖藻糖、半乳糖的百分含量逐漸增大。

表2 HSP0和F2的單糖組成(%)

2.4 亨氏馬尾藻巖藻聚糖吸附膽酸鹽的作用

圖2為膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線,三種膽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的線性,R2均大于0.99。標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為水合膽酸鈉:y=1.2088x+0.1444,R2=0.9948;甘氨膽酸鈉:y=1.2554x+0.1026,R2=0.9994;?；悄懰徕c:y=1.0028x+0.1157,R2=0.9982。

圖2 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖3可以看出,隨著HSP0濃度的增加,對三種膽酸鹽的吸附率增加。在HSP0的濃度為10 mg/mL后增長減緩,說明了HSP0與膽酸鹽吸附快接近飽和狀態(tài)。HSP0與水合膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c的吸附率也不同,吸附能力從大到小分別是水合膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c。從以上結(jié)果來看,HSP0有吸附膽酸鹽的能力。

圖3 不同濃度HSP0對吸附膽酸鹽的能力

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和多糖樣品的制取實(shí)際情況,選擇2、4 mg/mL兩個(gè)濃度的HSP1進(jìn)行吸附膽酸鹽能力的實(shí)驗(yàn)。如圖4,低濃度的HSP1吸附膽酸鹽的能力低于高濃度。結(jié)合圖3,HSP1結(jié)合膽酸鹽的能力比HSP0強(qiáng),當(dāng)濃度為2 mg/mL時(shí),與HSP0相比,HSP1與水合膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c的吸附率分別增加了4.32%、0.48%、1.49%,當(dāng)HSP1濃度為4 mg/mL時(shí),與HSP0相比，HSP1與水合膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c的吸附率分別增加了5.62%、1.95%、1.80%。因?yàn)镠SP1經(jīng)過除褐藻膠、脫蛋白、除脂肪,使得巖藻聚糖純度提高,從而吸附膽酸鹽的能力提高。

圖4 HSP1吸附膽酸鹽的能力

根據(jù)DEAE-52纖維素洗脫多糖的實(shí)際情況,配制濃度為2 mg/mL的三種洗脫組分進(jìn)行吸附膽酸鹽的實(shí)驗(yàn)。由圖5可以看出,在相同濃度下,洗脫組分中F2、F3吸附膽酸鹽的能力明顯高于F1。F2、F3的硫酸基和巖藻糖含量都明顯大于F1,F1含有的硫酸基和巖藻糖較低,僅有5.31%、5.07%,F2、F3表現(xiàn)出的高效吸附膽酸能力與硫酸基和巖藻糖含量有關(guān),這兩者含量越高,吸附膽酸鹽能力越強(qiáng)。

圖5 五種相同濃度的組分吸附膽酸鹽的能力

當(dāng)五種組分濃度為2 mg/mL時(shí),F3吸附水合膽酸鈉和甘氨膽酸鈉的能力最強(qiáng),吸附率達(dá)到26.35%和11.35%,吸附能力由高到低依次是F3、F2、HSP1、HSP0、F1;F2吸附?；悄懰徕c的能力最強(qiáng),吸附率達(dá)到13.36%,吸附能力由高到低依次是F2、F3、HSP1、HSP0、F1。HSP1吸附膽酸鹽的能力大于HSP0,這與HSP1純度高于HSP0有關(guān)。由于F2和F3經(jīng)過DEAE-52纖維素陰離子層析柱,純度更高,推測馬尾藻巖藻聚糖體外吸附膽酸鹽的能力跟多糖本身純度有關(guān)。劉曉菲等[31]對茯苓多糖的結(jié)構(gòu)及生物活性的研究表明,茯苓多糖純度越高,其生物活性越高,本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。

3 結(jié)論

亨氏馬尾藻巖藻聚糖粗品經(jīng)除蛋白之后通過DEAE-52纖維素,用不同濃度NaCl溶液洗脫得到的分離純化的F1、F2、F3。化學(xué)組成分析顯示,多糖含量最高的是HSP0和F2,巖藻糖含量最高的是F2和F3,硫酸基含量最高的是F3和HSP0。根據(jù)液相色譜顯示,HSP0主要含有葡萄糖、巖藻糖和半乳糖,其中葡萄糖幾乎占所有單糖的一半,在F2中,主要含有巖藻糖、半乳糖、甘露糖,其中巖藻糖所占比例遠(yuǎn)高于其它單糖,這兩種糖的主要區(qū)別在于葡萄糖、半乳糖、巖藻糖,尤其是葡萄糖,相差39.67%?？啡┍壬ū砻?HSP0結(jié)合膽酸鹽的能力隨著濃度的升高而增強(qiáng),在10 mg/mL后趨近于飽和;當(dāng)各組分馬尾藻巖藻聚糖濃度為2 mg/mL時(shí),F2和F3結(jié)合膽酸鹽的能力最好,這與其含有較高的巖藻糖、硫酸基含量和糖的純度有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)中,亨氏馬尾藻巖藻聚糖吸附膽酸鹽的機(jī)制尚不夠具體,還需進(jìn)一步深入研究。