吳文偉, 王 翌, 劉可鑫, 李天松*, 楊詠潔*

(1. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 吉林 延吉 133002; 2. 北華大學(xué)理學(xué)院, 吉林 吉林 132001)

孔雀石綠(malachite green, MG)屬于三苯甲烷類染料。它既是染料,也是殺菌劑,具有較強(qiáng)的抗真菌、抗寄生蟲和防腐的功效,曾被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1]。然而,MG具有潛在的致畸、致癌和致突變作用[2],現(xiàn)已被世界各國列為水產(chǎn)品養(yǎng)殖禁用藥物[3]。無色孔雀石綠(leucomalachite green, LMG)是MG在生物體內(nèi)的主要代謝還原產(chǎn)物。與MG相比,LMG在體內(nèi)殘留的半衰期更長、毒性更強(qiáng)[4],可作為MG殘留檢測的主要標(biāo)志物[5]。然而,MG防霉效果顯著,價格低廉,用量少,易得到,致使MG殘留的食品安全事件頻頻發(fā)生，這不僅給消費者健康帶來了極大的安全隱患,也給我國水產(chǎn)品出口貿(mào)易造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。

截至目前,MG或LMG的檢測方法主要有兩大類。一類是儀器分析檢測法,包括高效液相色譜法(HPLC)[6]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[7]。這些方法靈敏且可靠,但樣品制備煩瑣耗時，儀器昂貴且需要專業(yè)的儀器操作人員,難以滿足基層現(xiàn)場快速篩查的要求。另一類是快速檢測分析法,常見的有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[8]、表面增強(qiáng)拉曼散射免疫測定[9]、膠體金免疫層析法(GICA)[10]和化學(xué)發(fā)光免疫分析法[11]等。這些方法雖然操作簡便，快速,但多數(shù)以單克隆抗體為檢測探針。單克隆抗體存在制備煩瑣、價格昂貴、穩(wěn)定性差、難以保存和運輸?shù)热秉c[12]。而且,單克隆抗體只能檢測單一指標(biāo),無法實現(xiàn)對MG和LMG的同時快速檢測。因此,針對該問題,本課題組前期篩選獲得了能夠同時識別MG和LMG的雙特異性核酸適配體aptamer3(A3)。

納米金(AuNPs)比色核酸適配體傳感技術(shù)具有操作簡單、便攜、快速、可視化、無須特殊設(shè)備等優(yōu)點,在食品安全、疾病診斷和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[13]。目前,該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌[14,15]、金屬離子[16]、蛋白質(zhì)[17]和小分子[18]等目標(biāo)物的快速檢測中,但鮮有用于水產(chǎn)品中MG和LMG同步快速檢測的研究報道。因此,本研究擬采用核酸適配體A3作為傳感探針,以AuNPs為指示載體、NaCl溶液為聚集誘導(dǎo)劑,利用AuNPs的光學(xué)特性及核酸適配體的雙特異性識別特性,初步構(gòu)建了一種免標(biāo)記的AuNPs比色核酸適配體傳感器,以期實現(xiàn)水產(chǎn)品中MG和LMG的同步、快速、可視化檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Epoch多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek儀器有限公司); AL104電子分析天平(感量0.01 mg)(瑞士Moettler Toledo公司); TWJR-B調(diào)溫磁力攪拌器(鞏義市科瑞儀器有限公司); VORTEX-5渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器有限公司); FS-100T超聲波細(xì)胞破壁處理器(上海生析超聲儀器有限公司); Microfuge 20R低溫高速離心機(jī)(美國Beckman Coulter儀器有限公司); JEM-1011型透射電鏡(TEM,日本JEOL公司)。

MG、LMG、磺胺嘧啶(sulfadiazine, SDZ)、硝基呋喃妥因(nitrofurantoin, NFT)和四氯金酸三水合物(HAuCl4·3H2O)(色譜純,美國Sigma-Aldrich公司);檸檬酸三鈉和制備杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)的藥品(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司);核酸適配體序列為本實驗室篩選A3∶5′-ATTGGCACTCCACGCATAGGGACGCGAATAG-CGGACCTATGTGTGGTGTGTTACGGCGAGCCTA-TGCGTGCTACCGTGAA-3′(南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成并純化);實驗用鯽魚為吉林市超市購買;實驗用水均為超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

1.2 AuNPs的合成

采用檸檬酸三鈉還原法[13,19]制備納米金(AuNPs)溶液。用王水浸泡所用玻璃容器過夜,超純水充分清洗,鼓風(fēng)干燥箱烘干備用[20,21]。將100 mL 1 mmol/L的HAuCl4·3H2O加入錐形瓶中,在磁力攪拌下維持600 r/min的轉(zhuǎn)速不變。當(dāng)溶液開始沸騰時,加入10 mL 38.8 mmol/L檸檬酸三鈉溶液,當(dāng)溶液變成酒紅色后且顏色不再變化時,繼續(xù)加熱煮沸5 min。冷卻后將制備好的AuNPs溶液存放于棕色磨砂瓶中,于4 ℃冰箱內(nèi)保存。利用多功能酶標(biāo)儀對所得AuNPs溶液進(jìn)行光譜掃描,通過透射電鏡(TEM)對AuNPs的單分散尺寸的顆粒粒徑大小及微觀形貌進(jìn)行表征。

1.3 樣品前處理及檢測方法

樣品的制備參照國家標(biāo)準(zhǔn)[22]和Stead等[23]發(fā)表的文獻(xiàn)。稱取市售鯽魚5 g,分別與5 mL不同終濃度的MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)溶液混合,組織勻漿。然后,利用超聲波細(xì)胞破壁處理器輔助提取2 min,以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速勻漿提取30 s,以4 000 r/min離心5 min,收集上清液,過0.22 μm過濾器,待用。

分別取150 μL AuNPs(終濃度1.25 nmol/L)與50 μL核酸適配體(終濃度150 nmol/L)混合,于室溫孵育6 min。隨后,取50 μL待測樣品加入到檢測體系中,繼續(xù)孵育30 min。最后,再加入50 μL NaCl溶液(終濃度150 mmol/L),室溫孵育4 min。觀察溶液顏色變化,分別檢測MG和LMG在650 nm和520 nm波長處的吸光度(A),并計算吸光度比值A(chǔ)650nm/A520nm[24-27]。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

AuNPs比色核酸適配體傳感器的檢測原理見圖1。裸露的AuNPs可被高鹽溶液誘導(dǎo)而發(fā)生團(tuán)聚,溶液顏色由紅色變藍(lán)色(見圖1a)。核酸適配體為單鏈DNA(ssDNA),可通過靜電作用吸附到AuNPs表面,保護(hù)AuNPs抑制高鹽溶液誘導(dǎo)的聚集,使AuNPs溶液顏色不變(見圖1b)。當(dāng)加入靶標(biāo)MG、LMG或二者混合物后,核酸適配體能夠與靶標(biāo)特異性結(jié)合,并從AuNPs表面解離,AuNPs失去保護(hù)作用而在高鹽溶液誘導(dǎo)下發(fā)生聚集,溶液顏色由紅變藍(lán);而加入非靶標(biāo)物質(zhì)時,高鹽溶液不會引發(fā)顏色變化(見圖1c)。

圖 1 AuNPs比色核酸適配體傳感器檢測原理圖Fig. 1 Detection schematic illustration of gold nanoparticles (AuNPs) colorimetric aptasensor

2.2 AuNPs的表征

利用紫外可見光譜及透射電鏡掃描圖譜對AuNPs進(jìn)行表征,結(jié)果見圖2。AuNPs溶液呈現(xiàn)穩(wěn)定的紅色且久置無沉淀現(xiàn)象,520 nm波長處有最大吸收峰,吸收峰單一且尖銳(見圖2a),表明制備的AuNPs溶液均勻、穩(wěn)定且粒徑均一。利用紫外-可見吸收光譜法(UV-Vis),參考Haiss等[28]發(fā)表的文獻(xiàn),測定AuNPs的濃度為2.5 nmol/L。利用TEM掃描AuNPs溶液,結(jié)果表明，金納米顆粒呈球形,大小均一(見圖2b),說明制備的AuNPs分散良好。不同的金納米顆粒對應(yīng)不同的最大吸收波長,而520 nm波長處對應(yīng)的金納米顆粒直徑為13 nm[29]。

圖 2 AuNPs(a)吸收光譜圖和(b)TEM掃描照片F(xiàn)ig. 2 (a) Absorption spectrum and (b) transmission electron microscopy (TEM) scanning photo of AuNPs

2.3 AuNPs比色核酸適配體傳感器性能的優(yōu)化

2.3.1NaCl濃度的優(yōu)化

NaCl溶液作為AuNPs的聚集誘導(dǎo)劑,其用量對AuNPs聚集效果有較大影響。若NaCl濃度過低,則不能使AuNPs完全聚集;若NaCl濃度過高,即使AuNPs表面附著核酸適配體,高濃度的鹽也可使AuNPs發(fā)生聚集，因此需要優(yōu)化NaCl溶液的濃度。

分別取50 μL不同濃度的NaCl溶液(終濃度各為0、90、105、120、130、140、150、160、170、180、190、200和210 mmol/L)與150 μL的AuNPs(終濃度1.25 nmol/L)混合,室溫孵育4 min,分別掃描400～800 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜,測量650 nm和520 nm的吸光度值,實驗平行重復(fù)3次。以A650nm/A520nm為縱坐標(biāo),以NaCl濃度為橫坐標(biāo),繪制飽和度曲線圖,選擇NaCl溶液最佳使用濃度,結(jié)果見圖3。隨著NaCl濃度的增加,AuNPs在520 nm波長處的吸光度值逐漸減小,而在650 nm波長處吸光度值逐漸升高。AuNPs的顏色也由紅色逐漸變?yōu)樽仙踔粱疑?見圖3a),表明NaCl引發(fā)了AuNPs的聚集,且隨著NaCl濃度的增加,AuNPs的聚集程度逐漸增強(qiáng)。因此,選擇使AuNPs完全聚集的最低NaCl濃度為最佳使用濃度。由圖3b所示,隨著NaCl濃度的增加,A650nm/A520nm比值逐漸增高。當(dāng)NaCl濃度為150 mmol/L時,比值達(dá)到最大,之后開始趨于平穩(wěn),表明AuNPs聚集完全。因此,選擇NaCl最佳使用濃度為150 mmol/L。

圖 3 不同NaCl濃度下AuNPs的(a)吸收光譜圖和(b)A650nm/A520nm比值飽和曲線圖(n=3)Fig. 3 (a) Absorption spectra and (b) A650nm/A520nmratio saturation curve of AuNPs at the different NaCl concentrations (n=3)

2.3.2核酸適配體濃度的優(yōu)化

核酸適配體作為靶標(biāo)的識別元件,其用量對檢測結(jié)果有很大影響。當(dāng)核酸適配體濃度過低時,不能完全抑制AuNPs的聚集。因此,無論靶標(biāo)存在與否,在NaCl作用下均會使AuNPs發(fā)生聚集,易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。當(dāng)核酸適配體濃度過高時,溶液中游離的核酸適配體先與靶標(biāo)充分結(jié)合,致使吸附在AuNPs表面的核酸適配體無法完全解吸附,導(dǎo)致AuNPs仍被核酸適配體保護(hù)而無法聚集,易產(chǎn)生假陰性結(jié)果[30]。因此,需要優(yōu)化核酸適配體使用濃度。

圖 4 不同核酸適配體濃度下AuNPs的(a)吸收光譜圖和(b)A650nm/A520nm比值飽和曲線圖(n=3)Fig. 4 (a) Absorption spectra and (b) A650nm/A520nmratio saturation curve of AuNPs at the different aptamer concentrations (n=3)

分別取50 μL不同濃度的核酸適配體溶液(終濃度各為0、25、50、75、150、300、500和1 000 nmol/L)與150 μL的AuNPs(終濃度1.25 nmol/L)混合,室溫孵育6 min。隨后,分別加入50 μL NaCl溶液(終濃度150 mmol/L),繼續(xù)室溫孵育4 min。最后,分別掃描400～800 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜,測量650 nm和520 nm的吸光度值,實驗平行重復(fù)3次。以A650nm/A520nm為縱坐標(biāo),以核酸適配體濃度為橫坐標(biāo),繪制飽和度曲線圖,選擇核酸適配體最佳使用濃度,結(jié)果見圖4。隨著核酸適配體濃度逐漸增加,AuNPs溶液在520 nm波長處的吸光度值逐漸升高,而在650 nm波長處吸光度值逐漸減小。AuNPs溶液的顏色由紫色逐漸變?yōu)榧t色至不再變化(見圖4a)。表明隨著核酸適配體濃度的增加,AuNPs的聚集被逐漸抑制。因此,選擇AuNPs聚集被完全抑制的最低核酸適配體濃度為最佳使用濃度。由圖4b所示,隨著核酸適配體濃度的增加,A650nm/A520nm值逐漸減小。當(dāng)核酸適配體濃度為150 nmol/L時,比值達(dá)到最小,之后曲線趨于平穩(wěn),表明AuNPs的聚集被完全抑制。因此,選擇核酸適配體的最佳使用濃度為150 nmol/L。

2.4 AuNPs比色核酸適配體傳感器特異性驗證

圖 6 不同(a)MG和(b)LMG濃度下AuNPs溶液的吸收光譜圖Fig. 6 Absorption spectra of AuNPs at different (a) MG or (b) LMG concentrations

圖 5 AuNPs比色核酸適配體傳感器特異性檢測(n=3)Fig. 5 Specificity tests by AuNPs based colorimetric aptasensor (n=3) DPBS: dulbecco’s phosphate buffered saline (blank group); SDZ: sulfadiazine; NFT: nitrofurantoin; Mix1: SDZ-NFT (1∶1, v/v); MG: malachite green; LMG: leucomalachite green; Mix2: MG-LMG (1∶1, v/v).

考慮到目前水產(chǎn)品養(yǎng)殖中,抗生素濫用情況比較普遍,可能會干擾實際樣品的檢測。因此,選擇水產(chǎn)養(yǎng)殖中兩種濫用情況比較普遍的抗生素SDZ和NFT進(jìn)行特異性驗證。同時,分別設(shè)置兩組混合靶標(biāo):Mix1(SDZ-NFT(1∶1, v/v))和Mix2(MG-LMG(1∶1, v/v)),分析靶標(biāo)或非靶標(biāo)物質(zhì)共存時,AuNPs比色核酸適配體傳感器的檢測性能。即在最優(yōu)反應(yīng)條件下,以不同的檢測靶標(biāo)(SDZ、NFT、Mix1、MG、LMG、Mix2)為變量,靶標(biāo)終濃度均為17.5 μmol/L,考察方法的特異性。結(jié)果如圖5所示,加入MG或LMG或Mix2時,溶液的顏色由紅色變?yōu)樽仙退{(lán)色。A650nm/A520nm均明顯高于對照組(SDZ、NFT和Mix1)和空白組(DPBS),而空白組和對照組的溶液顏色幾乎沒有變化。說明該核酸適配體傳感器能特異性識別MG和LMG,而對SDZ、NFT及二者混合物沒有識別作用。

2.5 AuNPs比色核酸適配體傳感器靈敏度測試

在最優(yōu)反應(yīng)條件下,以靶標(biāo)MG、LMG的用量為變量,分別考察其不同終濃度(1.0、2.5、5.0、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、30.0 μmol/L)對AuNPs比色核酸適配體傳感器性能的影響。結(jié)果如圖6a和6b所示,隨著MG、LMG濃度的增加,AuNPs溶液顏色均由紅色逐漸變成紫色,再變成穩(wěn)定的藍(lán)色。同時,AuNPs溶液的吸收光譜也發(fā)生變化,A650nm值逐漸增加,而A520nm值逐漸降低。這表明隨著MG、LMG濃度的增加,吸附在AuNPs表面的核酸適配體逐漸被解吸附,致使AuNPs逐漸失去保護(hù)作用而發(fā)生聚集。由圖7所示,當(dāng)MG和LMG的濃度在0～17.5 μmol/L范圍內(nèi),靶標(biāo)濃度與吸光度比值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.993 8和0.971 5,線性回歸方程分別為y=0.049 65x+0.172 6和y=0.053 96x+0.141 3(y:A650nm/A520nm,x:靶標(biāo)濃度, μmol/L)。參考已發(fā)表文獻(xiàn)[24,25,31],根據(jù)公式3δ/slope(δ為9個平行空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差,slope為線性方程的斜率)確定了MG和LMG最低檢出限分別為6.93和6.38 nmol/L,表明該比色核酸適配體傳感器對MG和LMG具有較好的檢測靈敏度。

圖 7 不同MG和LMG濃度下AuNPs溶液的A650nm/A520nm比值飽和曲線圖(n=3)Fig. 7 A650nm/A520nm ratio saturation curves of AuNPs at the different MG or LMG concentrations (n=3)

2.6 加標(biāo)回收率及精密度

為了評估方法的準(zhǔn)確度及精密度,選擇鯽魚樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。在鯽魚樣品空白基質(zhì)中,分別添加3個不同水平的MG及LMG(終濃度5、10和20 μmol/L),每個水平做3次重復(fù),得到的加標(biāo)回收率及精密度結(jié)果見表1。在低、中、高3個不同添加水平下,MG的加標(biāo)回收率和RSD分別為88.60%～93.30%和2.27%～3.55%; LMG的加標(biāo)回收率和RSD分別為101.80%～107.00%和2.62%～3.75%。表明該方法的準(zhǔn)確度及精密度良好。

表 1 鯽魚樣品中MG和LMG的加標(biāo)回收率和RSD(n=3)

Zhao等[32]建立了基于MG-RNA-AuNPs檢測水樣中MG的方法,其線性范圍為0～15 μmol/L,平均回收率為92%～108%,檢出限為4 nmol/L。而本研究建立的方法,雖然MG檢出限上略高,但能夠同時識別MG和LMG,避免了樣品前處理中LMG轉(zhuǎn)化為MG的過程,可以大大簡化操作步驟。Jia等[33]建立了基于MG-RNA-AuNPs檢測魚樣中MG的方法,其線性范圍為0～300 nmol/L,平均回收率為96.00%～104.81%,檢出限為15.95 nmol/L。而本研究建立的方法,具有更低的檢出限和更寬的線性范圍。

3 結(jié)論

本文采用MG和LMG雙特異性核酸適配體作為識別元件,NaCl溶液作為聚集誘導(dǎo)劑,AuNPs作為指示劑,初步建立了一種免標(biāo)記的比色核酸適配體傳感器,可實現(xiàn)水產(chǎn)樣品中MG和LMG的同步、快速、可視化檢測。該方法能夠特異性檢出MG和LMG,而對SDZ和NFT無交叉反應(yīng)。此外,該AuNPs核酸適配體傳感器可用于鯽魚樣品中MG和LMG的快速檢測,準(zhǔn)確度及精密度良好,可為水產(chǎn)品中MG和LMG的同步快速檢測提供一種新方法。