應(yīng) 璐, 張書芬, 邢家溧,*, 李 楊, 王小寶, 畢曉麗, 周鑫達(dá)

(1. 寧波市食品檢驗(yàn)檢測研究院, 浙江 寧波 315048; 2. 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院, 浙江 寧波 315211)

膽固醇和生育酚都是人體所必需的重要營養(yǎng)元素,是乳粉中的重要質(zhì)量指標(biāo)。人體血液中的膽固醇濃度是高血脂癥的重要評價(jià)指標(biāo)之一[1],膽固醇參與人體代謝,是合成類固醇激素的原料,也是膽汁酸、激素和維生素D的前體[2,3]。維生素E(vitamin E, VE)又稱生育酚,是一種人體必需的脂溶性維生素,對維持人體正常生理功能起重要作用,能提高機(jī)體免疫力和生育能力,也是人體內(nèi)最重要的抗氧化劑[4-6]。維生素E包括生育酚和三烯生育酚兩類8種化合物[7],其中生物效價(jià)較高的4種是α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚[8,9]。

目前,國家標(biāo)準(zhǔn)中用于檢測食品中膽固醇和維生素E是兩個不同的方法[10,11],且均需要經(jīng)過傳統(tǒng)的加熱回流皂化、分液漏斗多次液液萃取、洗滌、濃縮,再用高效液相色譜或氣相色譜法分離,而文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于維生素E或者膽固醇的方法[12-14]幾乎也都是與國家標(biāo)準(zhǔn)相同的前處理方法。這些前處理方法過程復(fù)雜、耗時長,色譜法分離膽固醇的干擾較大。此外,嚴(yán)婉盈等[15]采用固相萃取(SPE)法測定膽固醇,但是該方法只能測定游離膽固醇而非總膽固醇[16],影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。鑒于乳粉基質(zhì)成分復(fù)雜,該文獻(xiàn)將SPE用于測定植物油的方法并不適用于乳粉的前處理。考慮到目前對于膽固醇和混合生育酚同時檢測的方法報(bào)道甚少,本研究通過多次實(shí)驗(yàn)摸索了一套適用于各種乳粉中膽固醇和混合生育酚定性定量檢測的方法,采用簡易皂化萃取的前處理方法,用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀在多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下定性和定量,相比簡單的氣相色譜、液相色譜及單級質(zhì)譜更加準(zhǔn)確。本研究將此快速法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法[10,11]進(jìn)行了比對,并將本方法應(yīng)用于同時快速測定各種乳粉中膽固醇和4種生育酚的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ800Evo氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾公司);萬分之一天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司); SW22恒溫振蕩水浴槽(德國優(yōu)萊博公司); ST16離心機(jī)(美國賽默飛世爾公司); VORTEX 3渦旋混合儀(廣州儀科實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司)。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度>97.2%,德國Dr. Ehrenstorfer); DL-α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度96.6%,曼哈格)、β-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.08%, SUPELCO)、γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度97.0%, SUPELCO)和δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度93.0%, SUPELCO);氫氧化鉀和磷酸二氫鉀(分析純,國藥集團(tuán));正己烷(色譜純,德國默克);脂肪酶(L1754-100 g, SIGMA),酶活為1 229 U/mg;所用水均為超純水。

樣品:隨機(jī)購買市售的嬰幼兒配方乳粉20種,低脂乳粉4種。

1.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:準(zhǔn)確稱取0.010 5 g膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品,正己烷溶解并定容至10.00 mL,配制成1.00 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液,保存于-18 ℃冰箱中。分別準(zhǔn)確稱取0.010 4 gα-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品,0.010 1 gβ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品、0.010 3 gγ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品、0.010 8 gδ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品,分別用無水乙醇溶解并定容至10 mL,分別得到1.00 g/L的α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,保存于-18 ℃冰箱中,備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液:量取適量的膽固醇、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,配制成膽固醇含量為200 mg/L,α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚含量均為100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,備用。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液:由于加標(biāo)回收率考察的含量和實(shí)際樣品中的含量差距較大,因此,配制兩個標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.025、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL于10 mL棕色容量瓶中,正己烷定容至刻度,標(biāo)準(zhǔn)系列1中膽固醇的質(zhì)量濃度為:0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)系列2中膽固醇的質(zhì)量濃度為:5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)系列1中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的質(zhì)量濃度均為0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)系列2中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的質(zhì)量濃度均為2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/L。

400 g/L氫氧化鉀溶液:稱取20 g氫氧化鉀于100 mL燒杯中,用20 mL水溶解,冷卻后,加水定容至50 mL,儲存于聚乙烯瓶中。

磷酸鹽緩沖液(pH 8.0): 稱取54.0 g磷酸二氫鉀溶解于300 mL水中,用400 g/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至8.0,加水定容至500 mL。

1.3 樣品前處理

1.3.1酶解和快速皂化

稱取乳粉樣品2.00 g于50 mL離心管中,加入5 mL溫水溶解,加入0.2 g脂肪酶,5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 8.0),混勻后置于37 ℃振蕩水浴中酶解4 h。取出后立即冷卻,待冷卻至室溫后依次加入1 g碳酸鉀、10 mL超純水、10 mL無水乙醇,充分混合后于25 ℃水浴振蕩10 min。

1.3.2萃取

加入5 mL正己烷充分渦旋萃取10 min, 4 000 r/min離心6 min,取上清液過0.22 μm有機(jī)膜,待測定。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件:色譜柱TG-5MS Sil(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進(jìn)樣口溫度280 ℃,程序升溫,不分流模式進(jìn)樣,進(jìn)樣量1 μL,載氣流速1.5 mL/min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊電離源(EI),掃描方式為正離子掃描,MRM模式,離子源溫度300 ℃,接口溫度300 ℃。其他參數(shù)見表1。

表 1 5種物質(zhì)的保留時間、監(jiān)測離子對和碰撞能量

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1色譜條件的優(yōu)化

參照嚴(yán)婉盈等[15]研究成果以TG-5MS Sil色譜柱分離,并通過改變升溫程序,初始柱溫150 ℃,保持1 min,然后以10 ℃/min升至280 ℃,保持12 min,最后20 ℃/min升至300 ℃,保持3 min,使得本研究的5種目標(biāo)化合物得到較好的分離且峰形較好(見圖1)。

2.1.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過將5種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離并全掃描,再與NIST譜庫進(jìn)行對照,可以得到5種物質(zhì)的質(zhì)譜圖,每種物質(zhì)選擇了3～4種強(qiáng)度較高的特征離子,再通過儀器的AutoSRM功能,為每種物質(zhì)優(yōu)化選擇出兩對離子對及其對應(yīng)的碰撞電壓(見表1), 5種物質(zhì)的定量離子提取圖見圖1。

圖 1 5種物質(zhì)的定量離子提取圖Fig. 1 Quantitative ion extraction diagram of the five substances

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

為了探究最優(yōu)的前處理?xiàng)l件,先選定一個膽固醇和4種生育酚含量較低的脫脂乳粉樣品作為空白基質(zhì),5種物質(zhì)的加標(biāo)含量均為2.0 mg/100 g,分別考察酶解時間、皂化溫度、萃取溶劑的種類、溶劑體積以及萃取時間對回收率的影響,每個條件平行測定3次,以加標(biāo)回收率為評價(jià)指標(biāo)選出最優(yōu)的前處理?xiàng)l件。

2.2.1酶解時間

考慮到膽固醇和生育酚都是脂溶性物質(zhì),脂肪酶酶解作為一種溫和的酶解手段,可以將膽固醇和生育酚游離出來,并且避免了高溫強(qiáng)堿環(huán)境。本研究固定條件:皂化溫度25 ℃,水浴振蕩,萃取溶劑及體積為正己烷5 mL,萃取時間為5 min,考察在37 ℃條件下酶解時間(2、4、12 h)對回收率的影響,乳粉中膽固醇和4種生育酚的回收率見圖2。酶解4 h條件下乳粉中膽固醇和4種生育酚的回收率最高,達(dá)95.8%; 2 h和12 h乳粉中膽固醇和4種生育酚的回收率相差不大,均低于酶解4 h,其中酶解2 h回收率低可能是由于酶解時間短,乳粉未得到充分酶解,回收率偏低;酶解12 h回收率低,可能是因?yàn)槊附鈺r間過長,導(dǎo)致待測組分損失[17],因此選擇37 ℃下酶解4 h最佳。

圖 2 酶解時間對乳粉中膽固醇和4種生育酚回收率的影響(n=3)Fig. 2 Effects of enzymatic hydrolysis time on the recoveries of cholesterol and the four tocopherols in milk powder (n=3) Saponification temperature: 25 ℃; extraction solvent and volume: n-hexane 5 mL; extraction time: 5 min.

2.2.2皂化溫度

將在37 ℃酶解4 h后的樣品按照1.3.1節(jié)加入試劑,分別在25、40、80 ℃下水浴振蕩進(jìn)行皂化,使用5 mL正己烷萃取5 min。由圖3可看出,25 ℃水浴振蕩的條件下回收率最高,皂化效果最佳,因此選擇皂化溫度為25 ℃。

圖 3 皂化溫度對乳粉中膽固醇和4種生育酚回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effects of saponification temperature on the recoveries of cholesterol and the four tocopherols in milk powder (n=3) Enzymatic hydrolysis time: 4 h; extraction solvent and volume: n-hexane 5 mL; extraction time: 5 min.

圖 4 萃取溶劑對乳粉中膽固醇和4種生育酚回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effects of extraction solvent on the recoveries of cholesterol and the four tocopherols in milk powder (n=3) Enzymatic hydrolysis time: 4 h; saponification temperature: 25 ℃; extraction solvent volume: 5 mL; extraction time: 5 min.

圖 5 萃取溶劑體積對乳粉中膽固醇和4種生育酚回收率的影響(n=3)Fig. 5 Effects of solvent volume on the recoveries of cholesterol and the four tocopherols in milk powder (n=3) Enzymatic hydrolysis time: 4 h; saponification temperature: 25 ℃; extraction solvent: n-hexane; extraction time: 5 min.

2.2.3萃取溶劑和溶劑體積

以膽固醇和4種生育酚的溶解性作為萃取溶劑選擇的依據(jù),在固定條件(酶解時間4 h,皂化溫度25 ℃水浴振蕩,萃取溶劑體積為5 mL,萃取時間5 min)下分別考察正己烷[18]、乙醚/石油醚(1︰1, v/v)[10]、乙酸乙酯[10]作為萃取溶劑對回收率的影響,結(jié)果見圖4,可以看出乙酸乙酯的萃取效果最差,回收率最低至72.2%;乙醚/石油醚萃取效果優(yōu)于乙酸乙酯,膽固醇和4種生育酚的回收率有所提高;正己烷萃取效果最佳,回收率高達(dá)95.5%。

進(jìn)一步考察了萃取溶劑正己烷的體積對回收率的影響,在固定條件(酶解時間4 h,皂化溫度25 ℃水浴振蕩,萃取溶劑為正己烷,萃取時間5 min)下,考察了2、5、10 mL,結(jié)果見圖5。萃取溶劑體積為5 mL和10 mL時的回收率顯著高于2 mL,但萃取溶劑體積為5 mL和10 mL時的回收率結(jié)果無顯著差異,考慮到實(shí)驗(yàn)成本和環(huán)境問題,故最終選擇萃取溶劑的體積為5 mL。

2.2.4萃取時間

考察了溶劑萃取時間(5、10、15 min)對乳粉中膽固醇和4種生育酚回收率的影響,其他條件如下:酶解時間4 h、皂化溫度25 ℃(水浴振蕩)、萃取溶劑及體積為正己烷5 mL、萃取時間5 min。結(jié)果表明,萃取時間為10 min和15 min的回收率結(jié)果顯著高于5 min,但萃取時間為10 min和15 min的回收率無顯著差異,考慮到實(shí)驗(yàn)效率,選擇萃取10 min為最優(yōu)萃取時間。

2.3 方法學(xué)評價(jià)

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在優(yōu)化條件下,對標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測定,以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x, mg/L)為橫坐標(biāo),以相應(yīng)的峰面積(y)為縱坐標(biāo),擬合線性方程得出相關(guān)系數(shù)(r2),其中膽固醇在0.5～50.0 mg/L,α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚在0.25～25.0 mg/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系(見表2)。以最低加標(biāo)結(jié)果推算10倍信噪比對應(yīng)的含量為定量限,膽固醇的定量限為10.0 μg/100 g,4種生育酚的定量限均為5.0 μg/100 g。

表 2 膽固醇和生育酚的校準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

表 3 膽固醇和4種生育酚的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

表 4 本研究方法與國標(biāo)方法測得結(jié)果的比較(n=6)

2.3.2回收率與精密度試驗(yàn)

以脫脂乳粉為樣品進(jìn)行3個水平的加標(biāo)試驗(yàn),膽固醇加標(biāo)含量分別為1.0 mg/100 g、5.0 mg/100 g、25.0 mg/100 g, 4種生育酚加標(biāo)含量分別為0.1 mg/100 g、0.5 mg/100 g、2.5 mg/100 g,每一水平平行測定6次,計(jì)算方法的回收率和精密度,結(jié)果見表3。

2.4 本研究方法與標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

考慮到加標(biāo)回收率并不能完全反映該方法對實(shí)際樣品的分解和萃取能力,尤其是本研究的5種物質(zhì)皆為脂溶性物質(zhì),與脂肪密切結(jié)合,加標(biāo)回收并不能真正驗(yàn)證酶解效果。為了考察本研究方法對實(shí)際乳粉樣品的測試效果,選取一種嬰幼兒乳粉樣品,按照本文方法測試該乳粉中5種物質(zhì)的含量,又按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.82-2016《食品中維生素A、D、E的測定》第一法測定4種生育酚的含量,按照GB 5009.128-2016《食品中膽固醇的測定》第一法測定膽固醇含量,每一方法平行測定6次,結(jié)果見表4。

由表4可知,相較于國家標(biāo)準(zhǔn)方法,本研究方法測得的膽固醇含量略低,但其余4種生育酚的測定含量均比國家標(biāo)準(zhǔn)方法略高。經(jīng)顯著性分析,國家標(biāo)準(zhǔn)方法與本研究方法對該乳粉中膽固醇、4種生育酚含量的檢測結(jié)果無顯著性差異(p>0.05)。相較于國家標(biāo)準(zhǔn)方法前處理操作繁瑣,且需要按照兩種前處理方法分別測定膽固醇和4種生育酚,本研究開發(fā)的方法更加快速、簡便,便于實(shí)際乳粉中膽固醇和4種生育酚的同時快速檢測。

2.5 樣品分析

為了解目前市售嬰幼兒乳粉、其他低脂乳粉中膽固醇和4種生育酚的含量狀況,利用上述所建立的分析方法,對20種嬰幼兒配方奶粉及4種低脂乳粉中膽固醇和4種生育酚的含量進(jìn)行了分析測試,檢測結(jié)果見表5。

由表5可知,嬰幼兒配方乳粉中膽固醇與4種生育酚的含量均高于低脂乳粉:嬰幼兒乳粉中膽固醇含量最高可達(dá)81.4 mg/100 g,α-生育酚和β-生育酚的平均值分別是3.6 mg/100 g和2.0 mg/100 g,γ-生育酚和δ-生育酚含量均較低,平均值分別為0.26 mg/100 g和0.79 mg/100 g。

表 5 實(shí)際乳粉中膽固醇和4種生育酚的含量(n=3)

3 結(jié)論

現(xiàn)行膽固醇和4種生育酚的測定分別采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.82-2016《食品中維生素A、D、E的測定》第一法和GB 5009.128-2016《食品中膽固醇的測定》。鑒于這2個標(biāo)準(zhǔn)的前處理方法過程復(fù)雜、耗費(fèi)時間長,而且不能同時測定膽固醇和4種生育酚。本研究開發(fā)了一種前處理只需經(jīng)過酶解、室溫(25 ℃)皂化、直接萃取3個步驟,不需要轉(zhuǎn)移和多次萃取,高效便捷,且可以批量處理樣品,對膽固醇和4種生育酚可以同時測定的方法。本方法檢出限、線性范圍、回收率均能滿足乳粉中膽固醇和4種生育酚的檢測要求。