李敏波，張 琪，張 芳，宋小青，額日赫木,*

（1.昆明理工大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，云南 昆明650500；2.山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾041004）

紫薯（Solanum tuberdsm）為旋花科番薯屬植物，富含紫色素、花青素、膳食纖維、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有抗氧化、預(yù)防高血壓、抗癌、護(hù)肝等重要作用[1]。然而，紫薯在鮮切處理后極易發(fā)生酶促褐變，不僅大大降低其商品價(jià)值，而且造成了極大浪費(fèi)。鮮切紫薯酶促褐變主要是由于多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）催化氧化酚類化合物而生成黑色素物質(zhì)所致，因此抑制鮮切紫薯PPO活性對(duì)紫薯防褐變研究尤為重要[2]。

關(guān)于鮮切果蔬防褐變問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究和探索[3]。目前，物理和化學(xué)方法是應(yīng)用最廣泛的兩種方法[4]。近年來(lái)，非熱物理技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展為鮮切果蔬護(hù)色研究提供了新思路。它不僅能有效地降低或消除酶活性，而且改善了熱處理對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)成分及感官品質(zhì)造成的不利影響[5]。超聲波（Ultrasounic，US）作為一種非熱處理技術(shù)，在鮮切果蔬護(hù)色研究中得到了較好地推廣應(yīng)用。如楊明冠等[6]和程謙偉等[7]研究表明，適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚砟茱@著抑制鮮切果蔬PPO活性?；瘜W(xué)方法中護(hù)色劑是最常用的手段之一，常見(jiàn)的護(hù)色劑有檸檬酸[8]、抗壞血酸[8]、半胱氨酸[9]和亞硫酸鈉[9]等。劉軍偉等[4]研究表明，在加熱溫度80℃，加熱時(shí)間10 min，抗壞血酸添加量0.9%，檸檬酸添加量1.2 g/L條件下，對(duì)紫薯PPO活性抑制效果最佳。韓秋敏等[5]表明，1.1 g/L的抗壞血酸和1.0 g/L的亞硫酸鈉對(duì)紫薯PPO活性的抑制效果最好，抑制率分別達(dá)到了69.62%和60.17%。曲酸（Kojic acid，KA）是微生物菌株好氧發(fā)酵產(chǎn)生的一種有機(jī)酸[10]，安全無(wú)毒，并具有較強(qiáng)的護(hù)色作用而得到了廣泛的應(yīng)用[11]。KA對(duì)PPO引起的酶促褐變的抑制主要通過(guò)與底物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，螯合多酚氧化酶活性必需的銅離子和還原形成黑色素的底物醌類化合物等共同作用完成[12]。呂艷芳等[13]發(fā)現(xiàn)，不同濃度的KA對(duì)蘑菇PPO活性有不同的抑制效果，當(dāng)KA濃度為0.3 mmol/L時(shí)對(duì)PPO活性的抑制作用最佳，其活性僅為對(duì)照組活性的7.12%。

通過(guò)單一物理或化學(xué)方法來(lái)抑制鮮切果蔬酶促褐變方面的研究已有大量的報(bào)道[14-15]。但通過(guò)非熱物理方法與護(hù)色劑結(jié)合來(lái)抑制鮮切紫薯酶促褐變的研究甚少。因此本研究利用US-KA復(fù)合處理鮮切紫薯來(lái)抑制其PPO活性，繼而減少鮮切紫薯在加工過(guò)程中由于酶促褐變引起的損失，以期為鮮切果蔬防褐變研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

紫薯新引1號(hào)(紫羅蘭紫薯)：產(chǎn)自山東沂蒙山；曲酸(食品級(jí))，廣東味多美食品配料有限公司產(chǎn)品；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水乙醇（分析純），天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；鄰苯二酚（分析純），天津市富成化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；愈創(chuàng)木酚（分析純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品；過(guò)氧化氫30%（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FS-1200N型超聲波處理器，H1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，F(xiàn)A-04型電子天平，DZKW-D-4型電熱恒溫水浴鍋，PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)，752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，DZF-6050型真空干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 抑制原料褐變處理方法

紫薯經(jīng)過(guò)清洗，切片（厚度為0.3 cm），浸泡于300 mL KA溶液中，燒杯外層采取冰浴處理，再將其置于US-KA處理裝置（圖1）內(nèi)，將變幅桿探頭調(diào)節(jié)至1 cm KA溶液深度，固定頻率為20 kHz，變幅桿直徑為20 mm，在此條件下進(jìn)行處理?？疾斐曁幚頃r(shí)間、功率及KA濃度對(duì)鮮切紫薯PPO活性產(chǎn)生的影響，并篩選出抑制PPO活性的最佳工藝條件。

1.2.2 粗酶液的提取和PPO活性的測(cè)定

參照Tribst等[16]的方法提取粗酶液，稍作改動(dòng)。將紫薯片切成小塊，稱取5 g樣品，加入20 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 5.5，4℃）進(jìn)行研磨、過(guò)濾，在10 000 r/min、4℃下離心10 min，上清液即為粗酶液。

PPO活性的測(cè)定：參照郭宇婷等[17]和王靜等[18]的方法并改進(jìn)。分別取2 mL的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 5.5）、1 mL 0.02 mol/L的鄰苯二酚及1 mL粗酶液，混勻，30℃下預(yù)熱5 min，在410 nm處測(cè)定其吸光值，每隔30 s記錄1次，共記錄4 min。一個(gè)酶活性單位（U）定義為：測(cè)定條件下，每分鐘引起吸光值改變0.001所需的酶量（mL）。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)中，選擇超聲功率、超聲處理時(shí)間和曲酸濃度作為超聲波-曲酸復(fù)合處理的3個(gè)主要條件。按表1設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分別考察3個(gè)因素對(duì)鮮切紫薯PPO活性的影響，以此來(lái)篩選出最佳超聲波-曲酸復(fù)合處理?xiàng)l件。

表1超聲波-曲酸復(fù)合處理?xiàng)l件的設(shè)定Table 1 Experimental design of US-KA treatment

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)中心組合（Box-Bohnken）設(shè)計(jì)原理，超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）、曲酸濃度（C）3個(gè)因素為自變量，PPO活性為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中12個(gè)為析因試驗(yàn)，5個(gè)為中心試驗(yàn)。其因素水平見(jiàn)表2。

表2響應(yīng)面因素水平Table 2 Factors and levels of response surface test

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，單因素試驗(yàn)利用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯氏多重范圍比較法進(jìn)行顯著性分析，利用Origin 2018軟件進(jìn)行作圖。Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案并進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲功率對(duì)鮮切紫薯PPO活性的影響

如圖2所示，在超聲時(shí)間和曲酸濃度不變的條件下，超聲功率在0～360 W范圍內(nèi)，PPO活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，超聲功率在360 W時(shí)的PPO活性呈最低值，即2 232.67 U/mL，與對(duì)照組（0 W）相比，其活性降低了35.93%。酶活性的高低主要取決于酶分子構(gòu)象的合理程度，用超聲處理酶溶液時(shí)，超聲產(chǎn)生的剪切力可能會(huì)破壞酶的分子結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出酶活性下降。鄭炯等[19]利用熱處理和超聲處理鮮榨西瓜汁，結(jié)果表明隨著超聲功率的增加，PPO活性逐漸下降；用300 W的超聲處理西瓜汁30 min后，其PPO活性已降低至約為對(duì)照組的40%，這與本試驗(yàn)結(jié)果相符。當(dāng)超聲功率超過(guò)360 W時(shí)，其PPO活性略有上升，但與對(duì)照組（0 W）相比，仍處于較低水平。酶活性的升高可能與酶活性中心的暴露程度有關(guān)，鐘烈洲[20]的研究表明，超聲處理可導(dǎo)致酶分子能量的增加，使酶分子的超微結(jié)構(gòu)更具柔性，增加酶活性中心的暴露程度，從而使PPO活性升高。因此抑制鮮切紫薯PPO活性的適宜超聲功率為360 W。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)紫薯PPO活性的影響

如圖3所示，在超聲功率和曲酸濃度不變的條件下，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮切紫薯PPO活性大體呈下降趨勢(shì)，當(dāng)延長(zhǎng)至9 min時(shí)，其PPO活性最低，即2 359.45 U/mL，與對(duì)照組（0 min）相比降低了32.6%，但9 min以后，PPO活性基本保持不變。王文宗等[21]的研究表明，在一定時(shí)間內(nèi)，超聲處理可改變PPO的分子構(gòu)象，使其酶活性在短時(shí)間內(nèi)迅速降低，而繼續(xù)延長(zhǎng)超聲處理時(shí)間，對(duì)其分子結(jié)構(gòu)不會(huì)有太大影響；程謙偉等[22]發(fā)現(xiàn)，豐水梨PPO活性隨著超聲時(shí)間（0～6 min）的增加而下降，而在6 min后其PPO活性下降速度變緩，這與該試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。由此可見(jiàn)，連續(xù)的超聲場(chǎng)致效應(yīng)可能會(huì)使PPO分子構(gòu)象發(fā)生改變，影響了PPO與底物的親和力，從而改變其活性，但由于酶的結(jié)構(gòu)具有柔性，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲處理時(shí)間對(duì)PPO活性的影響較小。由此可得，抑制鮮切紫薯PPO活性的適宜超聲時(shí)間為9 min。

2.1.3 曲酸溶液濃度對(duì)紫薯PPO活性的影響

如圖4所示，在超聲功率和時(shí)間不變的條件下，10～50μg/mL濃度范圍內(nèi)的曲酸溶液均能有效抑制鮮切紫薯的PPO活性，且30μg/mL的曲酸溶液對(duì)紫薯PPO活性的抑制作用最好，表現(xiàn)為PPO活性最低，即2 368.73 U/mL，與對(duì)照組相比降低了33.77%。何世微等[23]的研究表明，曲酸溶液濃度在0.1～0.4 mmol/L內(nèi)，菠蘿蜜PPO活性呈下降趨勢(shì)，而在0.6～1.0 mmol/L內(nèi)，PPO活性下降緩慢。默書(shū)霞等[24]發(fā)現(xiàn)，不同濃度曲酸溶液對(duì)果蔬中PPO均有不同的抑制效果，曲酸溶液在抑制PPO活性時(shí)，不同的果蔬產(chǎn)品最適曲酸濃度不盡相同。這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。曲酸對(duì)PPO的抑制作用主要為螯合PPO活性必需的銅離子[25]。在超聲波的協(xié)同作用下，不同濃度的曲酸溶液對(duì)鮮切紫薯PPO活性的銅離子的螯合作用不同，所以PPO活性表現(xiàn)也有差異，因此抑制鮮切紫薯PPO活性的適宜曲酸濃度為30μg/mL。

綜上所述，利用超聲波-曲酸復(fù)合處理能夠有效抑制鮮切紫薯PPO活性，并隨著超聲功率、超聲時(shí)間及曲酸濃度的增加，其PPO活性得到了明顯的抑制。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了超聲波-曲酸最佳工藝條件，即超聲功率360 W，超聲時(shí)間9 min，曲酸溶液濃度30μg/mL。

2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Box-behnken設(shè)計(jì)原理，以PPO活性作為響應(yīng)值Y，以超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）和曲酸溶液濃度（C）設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of response surface analysis test

2.2.2 建立模型方程及方差分析。

應(yīng)用Design-Expert軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到了響應(yīng)值Y對(duì)3個(gè)自變量A、B和C的三元多項(xiàng)回歸方程：

表4為對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析的結(jié)果。

表4回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance of regression model

由表4可知，該回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)P值為0.417 1，說(shuō)明失擬項(xiàng)對(duì)于純誤差是不顯著的，模型的決定系數(shù)R2=0.957 8，說(shuō)明模型擬合度良好。因此該模型可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)抑制PPO活性的最佳條件。由F值可知，各因素對(duì)PPO活性影響的主次順序?yàn)椋呵崛芤簼舛龋–）＞超聲功率（A）＞超聲時(shí)間（B）。顯著性分析結(jié)果表明，A、C、AC、BC對(duì)鮮切紫薯PPO活性的影響顯著（P＜0.05），A2、B2、C2對(duì)PPO活性的影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.3 鮮切紫薯PPO活性響應(yīng)面交互作用分析

圖4是各個(gè)試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值所構(gòu)成的三維空間響應(yīng)面-等高線圖，每個(gè)曲面圖顯示了某一個(gè)變量保持最佳水平時(shí)，另外兩個(gè)獨(dú)立變量間的相互作用。

通過(guò)這些曲面圖可以看到各個(gè)因素之間的相互作用及對(duì)響應(yīng)值的影響。結(jié)合方差分析可以得出，除因素B，模型中的一次項(xiàng)都有較高的顯著性，因素B的P值為0.423 8，不顯著，說(shuō)明超聲時(shí)間對(duì)線切紫薯PPO活性的影響不大。二次項(xiàng)的影響均為極顯著（P＜0.01），表明各個(gè)因素對(duì)鮮切紫薯PPO活性的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。交互項(xiàng)AC和BC的影響顯著（P＜0.05），說(shuō)明超聲功率和曲酸溶液濃度、超聲時(shí)間和曲酸濃度的交互作用對(duì)鮮切紫薯PPO活性有一定的影響，超聲功率和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)PPO活性的影響較小。利用回歸方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和理論預(yù)測(cè)，忽略不顯著項(xiàng)，簡(jiǎn)化回歸方程為：

2.2.4 抑制鮮切紫薯中PPO活性最佳工藝條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

優(yōu)化得到抑制鮮切紫薯PPO活性理論的最佳工藝條件為：超聲功率327.37 W，超聲時(shí)間9.07 min，曲酸溶液濃度28.26μg/mL，該條件下鮮切紫薯PPO活性為2 015.9 U/mL。

為檢驗(yàn)響應(yīng)面應(yīng)用優(yōu)化的工藝參數(shù)的可靠性，按照優(yōu)化方案，結(jié)合試驗(yàn)實(shí)際條件，將工藝條件調(diào)整為：超聲功率320 W，超聲時(shí)間544 s，曲酸溶液濃度28.3μg/mL。按照該工藝條件進(jìn)行5組平行試驗(yàn)，實(shí)際鮮切紫薯PPO活性為2 017.8 U/mL，與優(yōu)化試驗(yàn)預(yù)測(cè)值比較接近，驗(yàn)證了該模型的有效性。因此，確定抑制鮮切紫薯PPO活性的最佳工藝依次是：超聲功率320 W，超聲時(shí)間544 s，曲酸溶液濃度28.3μg/mL，此時(shí)鮮切紫薯PPO活性與未處理組相比降低了42.36%。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析得出，超聲波-曲酸復(fù)合處理抑制鮮切紫薯PPO活性最佳工藝條件為：超聲功率360 W，超聲時(shí)間9 min，曲酸溶液濃度30μg/mL。通過(guò)Box-Bohnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析法對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得出抑制鮮切紫薯PPO活性理論最佳工藝條件為：超聲功率327.37 W，超聲時(shí)間9.07 min，曲酸溶液濃度28.26μg/mL，該條件下所得PPO活性為2 015.9 U/mL。根據(jù)實(shí)際條件可調(diào)整為：超聲功率320 W，超聲時(shí)間544 s，曲酸溶液濃度28.3μg/mL。在此條件下所得PPO活性為2 017.8 U/mL，與未處理組相比，其PPO活性降低了42.36%。通過(guò)超聲波-曲酸復(fù)合處理能夠有效抑制鮮切紫薯PPO的活性，繼而達(dá)到護(hù)色效果，為今后鮮切果蔬護(hù)色研究提供參考。