石 浩,王仁才,王芳芳,王 琰,卜范文,周 倩

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長沙410128；2.湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，湖南 常德415100；3.湖南省園藝研究所，湖南 長沙410125）

獼猴桃是一種VC含量極為豐富的藤本漿果果樹，果實細(xì)嫩多汁，清香鮮美，酸甜宜人，營養(yǎng)極為豐富[1-2]。含大量的糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種有機(jī)物和人體必需的多種礦物質(zhì)，具有較高的食用價值和一定的保健效果[3-4]。在全球獼猴桃273.38萬t的年產(chǎn)量中，我國年產(chǎn)量約121.67萬t，占44.5%[5]。獼猴桃屬于呼吸躍變型果實，在常溫下極易軟化和腐爛變質(zhì)[6-7]。同時獼猴桃不耐貯藏很大程度上是因為貯藏期間有病原菌的侵入而引起的各種病害及腐爛[8-9]。因此，采收后應(yīng)盡快放在適宜的貯藏條件下，并采取有效的防腐保鮮措施。目前市面上的諸多保鮮劑大多都夾雜了一些化學(xué)試劑，經(jīng)常使用化學(xué)試劑會給人們的健康帶來很大的安全隱患。天然、高效、安全、無毒、性能穩(wěn)定的水果防腐劑日益受到人們關(guān)注[10-11]。植物提取物取材容易、經(jīng)濟(jì)實惠、殺菌作用好，對人體和環(huán)境無危害。因此，研究天然提取物在獼猴桃鮮果上的貯藏保鮮的應(yīng)用也成為熱點中的熱點[12-14]。同時據(jù)相關(guān)報道稱[15]，相比單一藥劑，復(fù)合劑具有活性高、成本低等優(yōu)點，可避免高劑量時帶來的食品安全問題，有很好的應(yīng)用前景。目前，復(fù)配多采用正交法、Isobologram分析法和響應(yīng)面法，其中響應(yīng)面法是通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)參數(shù)，解決多變量問題，較前兩種方法而言具有一定的優(yōu)勢。本文在對原有120種植物源藥抑菌篩選試驗的基礎(chǔ)上得到了7種具有較好抑菌效果的中藥材，以這7種不同植物提取物為研究對象，通過測定其對葡萄座腔菌的抑菌效果，并采用響應(yīng)面分析法[16]對提取物復(fù)配后的抑菌性能進(jìn)行了全面分析，以期得到較適宜的天然復(fù)配抑菌劑以代替化學(xué)防腐保鮮劑，開發(fā)適合獼猴桃果實貯藏特性的植物源防腐保鮮劑。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

丁香、肉桂、黃芩、廣藿香、菖蒲、皂角刺等藥材購自湖南九芝堂大藥房，打粉過篩（孔徑250μm），裝袋備用。油茶粕等植物購自湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院油茶基地。葡萄座腔菌，由植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室從獼猴桃病果中自行分離、鑒定、保藏。

木瓜蛋白酶（≥60萬U/g）購自Sigma公司；氯化鈉、無水乙醇、丙酮、正丁醇、三氯甲烷、無水乙醇均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

THZ-92B型可調(diào)速控溫?fù)u床，ZW1105051705型紫外可見分光光度計，SB-3200D型超聲波清洗機(jī)，AUW220D型電子天平，DR-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，TG16型臺式高速離心機(jī)，DK-98-IIA型電熱恒溫水浴鍋，MicroModulyo型冷凍干燥儀。

1.2 方法

1.2.1 植物提取物的制備

（1）黃芩、油茶粕和皂角刺供試液的制備，參考文獻(xiàn)[17]。取各植物粉末100 g，以料液比1∶30（g/mL）添加提取溶劑（80%乙醇），150 r/min恒溫振蕩提取12 h后，在75℃水浴、850 W超聲提取2次，每次提取2 h。抽濾棄去濾渣，合并2次濾液，濾液經(jīng)濃縮至30 mL左右，加入1/3體積的Sevag試劑（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1（V∶V）），混合振蕩15 min后，靜置10 min，除去水層與溶劑交界處的變性蛋白質(zhì)。濾液經(jīng)60℃減壓蒸餾濃縮至20～30 mL后，提取物用30 mL三氯甲烷洗滌2～3次，得到初步純化的植物提取物，將其濃縮至浸膏狀后干燥，計算得率，4℃條件下保存。

（2）肉桂、丁香、廣藿香、菖蒲供試液的制備，參考文獻(xiàn)[17]，略有改變。各取植物粉末100 g，以料液比1∶30（g/mL）添加提取溶劑（100%乙醇），150 r/min恒溫振蕩提取12 h后，在70℃水浴、850 W超聲提取2次，每次提取2 h。抽濾棄去濾渣，合并2次濾液，濾液經(jīng)濃縮至30 mL左右，加入2.0 mL、3.0%木瓜蛋白酶，混合振蕩15 min后，靜置10 min，除去蛋白質(zhì)，重復(fù)1次。濾液經(jīng)60℃減壓蒸餾濃縮至20～30 mL后，得到初步純化的植物提取物，將其濃縮至浸膏狀后干燥，計算得率，4℃條件下保存。

1.2.2 提取物對菌絲生長抑制率的影響

配制提取物最終濃度為0.1、0.4、0.7、1.0、1.3、1.5 mg/mL PDA培養(yǎng)基。納他霉素濃度依次為0.01、0.03、0.05、0.07、0.10、0.12、0.15 mg/mL。在超凈工作臺上，鋪板于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后將直徑大小為0.6 cm的供試菌餅植入培養(yǎng)基中，每皿3塊，封口培養(yǎng)皿，每個處理3次重復(fù)，在28℃的培養(yǎng)箱中遮光培養(yǎng)96 h。用游標(biāo)卡尺左右、上下量取菌落長度，求取平均值。同時采用SPSS軟件對菌絲生長半抑制率濃度IC50進(jìn)行計算。菌絲生長抑制率計算公式如下：

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落凈生長距離-處理菌落凈生長距離）/對照菌落凈生長距離×100

1.2.3 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計

通過“1.2.2”對7種不同濃度單一藥材進(jìn)行抑菌試驗，得到各藥材的半抑制率濃度IC50，試驗設(shè)置3個水平，分別為0.5倍IC50、1.0倍IC50、2.0倍IC50，以菌抑制直徑（Y）為考察指標(biāo)，進(jìn)行七因素三水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，優(yōu)化提取物最佳抑菌配方比，二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液溶解，提取物處理的終濃度為0.4 mg/mL PDA培養(yǎng)基。

表1響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.4 最佳復(fù)配物抑菌試驗及經(jīng)濟(jì)效益分析

通過所得最佳復(fù)配物，將復(fù)配物配制成最終濃度為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL PDA培養(yǎng)基，進(jìn)行抑菌試驗，試驗方法同“1.2.2”。配制一定濃度的復(fù)配物藥劑處理獼猴桃果實進(jìn)行耐貯藏試驗，折算其復(fù)配物經(jīng)濟(jì)效益。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)的處理分別采用Microsoft Excel(Office 2018)、Design Expert 10.0.4等軟件進(jìn)行分析及繪制圖形。采用SPSS18.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。滿足正態(tài)性分布且方差齊的兩組之間差異的比較用兩組獨立樣本的t檢驗。不同大寫字母表示α=0.01極顯著性水平，P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物對菌絲生長抑制率的測定結(jié)果

不同濃度不同提取物及納他霉素對葡萄座腔菌抑菌效果的影響如圖1所示。

由圖1可知，各物質(zhì)對葡萄座腔菌均具有較強(qiáng)的抑制效果。納他霉素抑菌效果略強(qiáng)于提取物的抑菌效果，納他霉素在0～0.15 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，其對葡萄座腔菌的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)納他霉素處理濃度在0.12 mg/mL時，菌絲生長抑制率達(dá)到了55.01%，半抑制率IC50為0.121 mg/mL。丁香、肉桂、黃芩、廣藿香、菖蒲、皂角刺、油茶粕等提取物在濃度0～1.5 mg/mL的范圍內(nèi)，同樣隨著濃度的增大其對菌的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。圖1A中菖蒲、黃芩抑菌效果較好，黃芩半抑制率IC50為1.058 mg/mL，菖蒲IC50為0.993 mg/mL，菖蒲在1.0 mg/mL處理濃度時，菌絲生長抑制率已達(dá)到了51.10%，此時菖蒲提取物的抑菌效果極顯著高于黃芩提取物(P＜0.01)。圖1B中廣藿香抑菌效果較好，IC50為1.086 mg/mL，油茶粕IC50為1.409 mg/mL。圖1C中肉桂、丁香抑菌效果較好，半抑制率IC50分別為0.940、0.910 mg/mL，在1.0 mg/mL處理濃度時，菌絲生長抑制率分別達(dá)到了52.31%、55.40%，2種植物強(qiáng)于皂角刺（IC50為1.02 mg/mL）提取物的抑菌效果，皂角刺相對于丁香抑菌效果具有極顯著性差異(P＜0.01)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面工藝回歸模型的建立及方差分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計進(jìn)行了62組試驗，試驗結(jié)果見表2，回歸模型的方差分析如表3所示。經(jīng)過不同比例復(fù)配后，各復(fù)配物質(zhì)抑菌效果較單一組分均具有較大程度的提高。

表2響應(yīng)曲面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and result of response surface test

表3試驗結(jié)果回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model of experimental results

由軟件Design Expert 10.0.4對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到不同試驗條件與菌絲生長抑制率的二次多項式：Y=28.24+0.85A+1.34B+0.28C+2.35D-2.13E-2.84F+2.79G-1.15AB+1.08AC+0.98AD+0.69AE+1.4AF-1.1AG+0.2BC+1.45BD+0.82BE+1.47BF+0.065BG-0.48CD-0.26CE-0.47CF+0.34CG+1.25DE+0.13DF-0.42DG-0.27EF-0.6EG-0.83FG-0.011A2+0.45B2+0.16C2-0.53D2+0.79E2+0.033F2+0.083G2。式中：Y為提取物對菌絲生長抑制率的預(yù)測值；A為黃芩、B為丁香、C為肉桂、D為皂角刺、E為廣藿香、F為菖蒲、G為油茶粕的編碼值。從F值可知各因素對響應(yīng)值的影響順序為：F＞G＞D＞E＞B＞A＞C，即菖蒲＞油茶粕＞皂角刺＞廣藿香＞丁香＞黃芩＞肉桂。模型P＜0.000 1，說明該模型具有極顯著性差異。其中模型決定系數(shù)R2為0.927，說明該模型能夠解釋92.7%響應(yīng)值的變化。因此，用該試驗?zāi)Ｐ鸵跃z生長抑制率為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化提取物配方比的研究方法是可行的。

2.2.2 驗證試驗

由軟件計算得到提取物的最佳抑菌配方條件為：黃芩、丁香、肉桂、皂角刺、廣藿香、菖蒲、油茶粕的最佳配方比為1.375∶1.125∶0.45∶0.5∶1.35∶1.25∶2.8，此條件下所得復(fù)配物對菌絲生長抑制率的理論值為43.2%。實際測得試驗結(jié)菌抑制直徑為43.8%(SD=0.6)，與理論預(yù)測值相比，其相對誤差較小，而且重復(fù)性也很好，說明該模型可以較好地預(yù)測菌絲生長抑制率大小與各試驗條件之間的關(guān)系，具有一定的實用價值。

2.3 復(fù)配物抑菌效果分析

對最佳配方的復(fù)配物進(jìn)行不同濃度抑菌試驗。試驗結(jié)果如圖2所示，隨著復(fù)配物濃度的提高，抑菌效果逐漸增強(qiáng)，當(dāng)處理濃度達(dá)到0.6 mg/mL時，相對于0.4～0.5mg/mL有極顯著提高（P＜0.01）。當(dāng)濃度繼續(xù)提高到0.7～0.8 mg/mL時，抑菌效果均有顯著性的提升。當(dāng)濃度達(dá)到0.8 mg/mL時，相對于0.4 mg/mL的抑菌效果提高了94.72%，此時抑菌效果已非常好，菌絲生長抑制率達(dá)到了85%以上。通過SPSS軟件求得復(fù)配物的IC50為0.489 mg/mL，抑菌效果已明顯超過原有單一藥材0.9 mg/mL的半抑制濃度，和納他霉素的0.121mg/mL也較為相近，說明藥材經(jīng)過復(fù)配后可明顯的提升其抑菌的能力。

2.4 復(fù)配物經(jīng)濟(jì)效益分析

復(fù)配物經(jīng)濟(jì)效益分析由表4所示。每種藥材的價格差別較大，其中皂角刺較貴9.5元/100 g，油茶粕最低，僅為0.1元/100 g。對提取物進(jìn)行冷凍干燥稱重得7種物質(zhì)的提取得率為1.32%～3.30%。通過7種提取物的IC50換算出各物質(zhì)所占比例，由“2.3”試驗結(jié)果可知：采用0.8 mg/mL處理時，菌絲生長抑制率達(dá)到了85%以上，故采用0.8 g/L的藥劑處理果實。由上述比例和藥材單價求得0.8 g復(fù)配物需要2.55元。由于每升藥劑大概可噴施處理250 kg左右的果實，故100 kg果實大約需要1元。

表4復(fù)配防腐保鮮劑經(jīng)濟(jì)效益分析Table 4 Economic benefit analysis of compound preservatives

3 結(jié)論與討論

部分植物活性物質(zhì)對真菌具有一定的抑制作用，在原有試驗的基礎(chǔ)上選取7種抑菌效果較佳，價格較為便宜的植物，對其植物提取物進(jìn)行復(fù)配抑菌試驗。從試驗結(jié)果可以看出：黃芩、丁香、肉桂、廣藿香、菖蒲、皂角刺、油茶粕等抑菌效果均較好，半抑制濃度IC50在1 mg/mL左右，可能是這些物質(zhì)中含有較多的次生代謝物質(zhì)，例如黃酮、皂苷、揮發(fā)油、萜類、醌類、生物堿等[18-19]，據(jù)相關(guān)研究表明，這些物質(zhì)對真菌具有一定的抑制作用[20-21]。植物藥經(jīng)過復(fù)配后一般具有增效的作用，尤其是對含有不同抑菌物質(zhì)的配伍組合。在62組試驗中可發(fā)現(xiàn)絕大部分的復(fù)配組殺菌效果明顯要好于單一的殺菌劑，采用0.4 mg/mL復(fù)配物處理葡萄座腔菌，菌絲生長抑制率達(dá)到35%以上。以黃芩、丁香、肉桂、皂角刺、廣藿香、菖蒲、油茶粕配方比為1.375∶1.125∶0.45∶0.5∶1.35∶1.25∶2.8，此條件下最佳組合配方的抑菌效果可達(dá)43.8%?？赡苁怯捎谟筒杵?、皂角刺中的皂素既可起到殺菌作用，又可作為表面活性劑，提升揮發(fā)油、生物堿、醌類和黃酮等的溶解性，從而起到了協(xié)同抑菌的作用[22]，或者不同植物精油混合抑菌能力得到了提升所致[23-24]。當(dāng)復(fù)配物的濃度提升到0.6 mg/mL時，菌絲生長抑制率明顯的提升，使用0.8 mg/mL復(fù)配物處理時，菌絲生長抑制率達(dá)到了85%以上，說明較高濃度復(fù)配物的抑菌效果更好，可能是因為高濃度的復(fù)配物在對真菌細(xì)胞膜和細(xì)胞生理代謝方面的破壞效果更好，今后試驗中可對其抑菌機(jī)理進(jìn)一步研究，研究協(xié)同復(fù)配物對病原菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞衰老、凋亡基因等的影響[25-26]。同時采用0.8 mg/mL復(fù)配物處理獼猴桃，其經(jīng)濟(jì)效益也較高，100 kg果實僅需要1元左右成本。此復(fù)配物作為一種天然復(fù)配抑菌劑，可代替化學(xué)防腐保鮮劑，是一種非常適合獼猴桃果實貯藏特性的植物源防腐保鮮劑，為今后此類保鮮劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。