曾澤湘,范中奇,陳建業(yè),*

（1.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣東省果蔬保鮮重點實驗室，南方園藝產(chǎn)品保鮮教育部工程研究中心，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州510642；2.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后技術(shù)研究所，福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002）

轉(zhuǎn)錄因子在基因表達調(diào)控過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它們通過結(jié)合下游靶基因啟動子上特定的DNA元件，進而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄[1]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，因其廣泛參與調(diào)控植物的生物學(xué)過程，包括果實成熟、葉片衰老、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及響應(yīng)生物和非生物脅迫等而受到人們的重點關(guān)注[2]。據(jù)植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB在線網(wǎng)站的統(tǒng)計，目前已鑒定出165種植物的58類轉(zhuǎn)錄因子家族，其中共包括14 549個WRKY基因[3]。在模式植物擬南芥和水稻的基因組中，分別有74個和109個WRKY基因[4-5]。然而，與模式植物的基因組相比，園藝作物的基因組通常更為龐大和復(fù)雜，例如三倍體的香蕉基因組[6]和25條染色體的菠蘿基因組[7]。隨著多種園藝作物的基因組測序數(shù)據(jù)的公布，園藝作物中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究報道也逐漸增多。深入研究園藝作物WRKY轉(zhuǎn)錄因子在園藝產(chǎn)品品質(zhì)形成和維持的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，將豐富植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究基礎(chǔ)，也對培育優(yōu)質(zhì)園藝產(chǎn)品具有重要的理論價值和指導(dǎo)意義。

1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的概述

1994年，Ishiguro和Nakamura從甘薯中分離到了第一個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并命名為SPF1，SPF1蛋白可以結(jié)合SP8a（ACTGTGTA）和SP8b（TACTATT）序列，該序列分別存在于甘薯根塊貯藏蛋白基因和β-淀粉酶基因的上游5’區(qū)域中[8]。1995年，在野麥中分離到了兩個參與調(diào)控種子萌發(fā)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子ABF1和ABF2[9]。1996年，在歐芹中首次出現(xiàn)了WRKY的命名，并報道了WRKY1、WRKY2和WRKY3特異結(jié)合編碼病程相關(guān)蛋白的基因PR-1，PR-3和PR1-3啟動子上的(T)TGAC(C)序列[10]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是由WRKY結(jié)構(gòu)域來定義的，該結(jié)構(gòu)域含有至少一個約60個氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域，其中N端含有高度保守的七肽結(jié)構(gòu)域（WRKYGQK），C端含有C2-H2或C2-HC的鋅指結(jié)構(gòu)域。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的不同，將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為三大類，分別是Group I、Group II和Group III，Group II中因氨基酸序列的不同，又可分為a、b、c、d、e五個亞族[11]。除保守的WRKY結(jié)構(gòu)域外，絕大部分的WRKY轉(zhuǎn)錄因子還含有核信號定位區(qū)（NLS）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、亮氨酸拉鏈、絲氨酸/蘇氨酸富集區(qū)、谷氨酸富集區(qū)等其他結(jié)構(gòu)區(qū)，其結(jié)構(gòu)的多樣性也為WRKY轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能奠定了基礎(chǔ)[12]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子的活性主要受絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）介導(dǎo)的磷酸化調(diào)控。在這一過程中，首先是內(nèi)外部刺激信號與膜受體結(jié)合，再激活體內(nèi)的MAPK級聯(lián)放大系統(tǒng)，經(jīng)過一系列磷酸化反應(yīng)將信號放大并傳遞至細胞內(nèi)，誘導(dǎo)WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過特異識別下游靶基因啟動子區(qū)域的W-box(C/T)TGAC(T/C)結(jié)合元件，激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄活性以調(diào)控其表達，進而調(diào)控植物的生長發(fā)育等過程[13]。需要注意的是，W-box區(qū)域中的核心元件為TGAC，任一核苷酸突變或被替換，WRKY轉(zhuǎn)錄因子對靶基因的結(jié)合能力都會大幅降低甚至消失[14]。另外，經(jīng)系列磷酸化反應(yīng)后傳遞到細胞核內(nèi)的誘導(dǎo)作用受到WRKY蛋白的自身調(diào)節(jié)或是不同WRKY蛋白間的交叉調(diào)控，例如擬南芥中WRKY25、WRKY26和WRKY33之間的自身調(diào)節(jié)，增強了植株對高溫的耐性[15]，WRKY與VQ蛋白[16]、WRKY與鈣調(diào)蛋白[17]等的研究都表明WRKY蛋白與其他蛋白互作協(xié)同調(diào)控目標(biāo)基因的表達。

2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子與園藝產(chǎn)品的品質(zhì)

園藝產(chǎn)品的品質(zhì)包括外觀性狀、風(fēng)味、質(zhì)地，營養(yǎng)及耐貯性等。品質(zhì)的形成與維持過程不僅受到光、溫度、日照時間等外部因素的影響，也受到生長時期和植物激素等內(nèi)部因素的調(diào)控[18]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族作為植物轉(zhuǎn)錄因子中數(shù)量最大的家族之一，廣泛參與著園藝作物的不同生物學(xué)進程。近年來，隨著多種園藝作物基因組測序的完成，關(guān)于園藝作物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的報道也逐漸增多，在白菜、香蕉和蘋果等常見的園藝作物基因組中，被鑒定出的WRKY基因都超過了100個。本文將重點綜述不同園藝作物中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在園藝產(chǎn)品品質(zhì)形成與維持過程中所發(fā)揮的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用及其相關(guān)機制。

2.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子與園藝產(chǎn)品的品質(zhì)形成

園藝產(chǎn)品的品質(zhì)很大程度取決于其化學(xué)成分的組成，主要包括葉綠素、花青素和類胡蘿卜素等色素類物質(zhì)，糖、酸和單寧等風(fēng)味物質(zhì)，水分、果膠和纖維素等細胞壁結(jié)構(gòu)構(gòu)成物質(zhì)以及維生素、礦物質(zhì)和蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)。品質(zhì)形成過程受到諸多內(nèi)源和外源因素的調(diào)控影響，WRKY轉(zhuǎn)錄因子也廣泛參與其中。在梨果實中選用紅皮梨品種和它的突變體綠皮品種進行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果顯示，果皮顏色的不同與花青素的合成代謝有很大關(guān)系，MYB、AP2、WRKY和MADS等轉(zhuǎn)錄因子家族在兩個品種中的基因表達水平也有顯著差異，暗示這些轉(zhuǎn)錄因子在花青素調(diào)控過程中發(fā)揮著作用[19]。同樣是與花青素合成相關(guān)，在矮牽?；ㄖ校珹N11、AN1和PH4分別是矮牽牛花中的WD40蛋白（MBW復(fù)合物）、bHLH和MYB轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)，AN1和AN11（花青素，ANTHOCYANIN11）可以獨自激活花青素合成和PH基因，而編碼WRKY蛋白的PH3基因也是AN1-AN11-PH4復(fù)合體的下游靶基因，表明PH3在矮牽牛花花青素合成中的重要作用[20]。長春花轉(zhuǎn)錄因子CrWRKY1在根系中優(yōu)先表達，并且受到植物激素JA、GA和乙烯的誘導(dǎo)，超表達CrWRKY1的長春花植株中，色氨酸脫羧酶基因（TDC）和轉(zhuǎn)錄因子ZCT1/ZCT2/ZCT3表達水平都上調(diào)，隨后的研究表明CrWRKY1正調(diào)控萜類吲哚生物堿的合成過程[21]。甜菜素是甜菜和火龍果果實中富含的一種純天然植物色素，目前甜菜素作為一種天然的食品著色劑已被廣泛使用。甜菜素也具有抗菌、抗氧化和預(yù)防心血管疾病等作用。Cheng等[22]發(fā)現(xiàn)，在火龍果果實發(fā)育過程中，HpWRKY4/18/44轉(zhuǎn)錄因子通過直接調(diào)控甜菜素合成相關(guān)基因HpCytP450-like1而參與果實中甜菜素合成。

風(fēng)味物質(zhì)方面，番茄果實液泡中蘋果酸的形成對番茄果實的風(fēng)味有很大影響，而蘋果酸向液泡的轉(zhuǎn)運是通過液泡膜上的轉(zhuǎn)運蛋白來實現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，SlWRKY42通過綁定SlALMT9（鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白，ALMT）啟動子上的W-box元件，負(fù)調(diào)控SlALMT9的表達，進而抑制番茄果實中的蘋果酸積累[23]。除有機酸外，果實體內(nèi)的糖含量也是決定果實風(fēng)味品質(zhì)的重要因素，研究表明，火龍果果實生長過程中，果實中蔗糖含量逐漸下降，而葡萄糖和果糖含量上升，蔗糖可以通過糖轉(zhuǎn)化酶（INVs）和蔗糖合酶（SuSys）不可逆地水解為葡萄糖和果糖，隨糖含量升高而表達水平上調(diào)的HpWRKY31基因，可以綁定HpINV2和HpSuSy1啟動子上的W-box元件，并激活它們的轉(zhuǎn)錄活性[24]。柿果實的脫澀處理，采用的是高濃度CO2結(jié)合低濃度O2貯藏的氣調(diào)方法，而柿果實對低氧脅迫的應(yīng)答機制與WRKY轉(zhuǎn)錄因子也有密切關(guān)系。在高濃度的CO2處理下，DkERFs轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活DkPDC2（脫澀的關(guān)鍵靶標(biāo)結(jié)構(gòu)基因）的啟動子活性，進而促進果實脫澀進程。DkWRKY1蛋白與DkERF24蛋白存在互作關(guān)系，并且二者對DkPDC2啟動子存在協(xié)同增效現(xiàn)象。在柿果實中構(gòu)建的ERF-WRKY復(fù)合體對低氧脅迫的響應(yīng)機制，隨后在擬南芥同源基因分析的試驗中也得到了證實。該研究豐富了柿果實采后低氧脫澀的分子機制，也為優(yōu)化采后果實品質(zhì)的保鮮技術(shù)提供了理論依據(jù)[25]。辣椒素物質(zhì)屬于辣椒果實胎座中產(chǎn)生的一類特有的次生代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)生使辣椒果實具有自身防御功能，也是辣椒果實產(chǎn)生辣味的主要原因，Zhu等[26]從辣椒中鑒定出在辣椒胎座特異表達的MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB31，發(fā)現(xiàn)MYB31與辣椒素合成相關(guān)基因表達水平一致，并能直接調(diào)控辣椒素合成相關(guān)基因參與辣椒素合成過程；此外，高辣品種中的MYB31啟動子中存在W-box元件能被WRKY9轉(zhuǎn)錄因子特異識別并使得MYB31被顯著激活，而低辣的品種中存在W-box的元件缺失或SNP突變，導(dǎo)致WRKY9無法激活MYB31的轉(zhuǎn)錄。該研究揭示了辣椒素類物質(zhì)生物合成的分子機制，解析了辣椒果實辣味品質(zhì)的形成機理，為極辣基因型辣椒的遺傳進化提供了新的見解。

二苯乙烯（STS）是葡萄樹中的重要營養(yǎng)物質(zhì)白藜蘆醇生物合成過程的關(guān)鍵酶，VviMYB14和VviMYB15是調(diào)控二苯乙烯合成的關(guān)鍵基因，VviWRKY24能夠特異激活VviSTS29的啟動子活性，而VviWRKY03通過與VviMYB14蛋白的互作來發(fā)揮作用[27]。在茶葉中，兒茶素（EGCG）是茶葉茶多酚的主要組成成分，是茶葉中最重要的功能成分之一，也是決定茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵因素。EGCG3“Me是一種兒茶素甲基化衍生物，被認(rèn)為比EGCG具有更強的抗過敏和抗高血壓功效，且比EGCG更容易被吸收。研究表明，CsWRKY48和CsWRKY57like可以通過抑制EGCG3”Me生 物 合 成 相 關(guān) 基 因CsLAR、CsDFR和CCoAOMT的轉(zhuǎn)錄水平來負(fù)調(diào)控茶葉中EGCG3"Me的生物合成。該研究解析了WRKY對EGCG3"Me生物合成的分子調(diào)控機制，為高EGCG3"Me茶樹品種的選育提供了理論依據(jù)[28]。

2.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子與園藝產(chǎn)品的品質(zhì)維持

園藝作物衰老是影響品質(zhì)維持的主要原因，園藝產(chǎn)品采收之后如何保持良好品質(zhì)，延長貨架期，減少經(jīng)濟損失也是采后生物學(xué)研究的核心問題。目前，WRKY轉(zhuǎn)錄因子與葉片衰老的研究多集中于模式植物擬南芥和水稻上，擬南芥中研究較為透徹的基因有AtWRKY75、AtWRKY6、AtWRKY54、AtWRKY70、AtWRKY53、AtWRKY57、AtWRKY22和AtWRKY2[29-30]。水稻研究中相關(guān)報道的基因有OsWRKY42、OsWRKY23、OsWRKY80和OsWRKY14[31]。相比于模式植物，WRKY與葉片衰老在園藝作物中的研究較少。菜心的BrWRKY65和BrWRKY75都受到菜心葉片衰老的誘導(dǎo)，BrWRKY65可綁定葉綠素降解相關(guān)基因BrSGR1和BrNYC1以及衰老相關(guān)基因BrDIN1啟動子上的W-box元件并激活它們的表達[32-33]。此外，另一菜心WRKY轉(zhuǎn)錄因子BrWRKY6能夠通過調(diào)控GA合成基因BrKAO2和BrGA20ox2的轉(zhuǎn)錄來參與植物激素GA延緩的菜心葉片衰老[34]?；ò晁ダ戏矫妫x用梔子花（Gardenia jasminoidesEllis）開花過程的前4天樣本進行從頭轉(zhuǎn)錄組測序分析，在花瓣衰老癥狀可見的第4天出現(xiàn)了大量的差異表達基因，進一步用qRT-PCR試驗驗證了有差異表達的WRKY、bHLH和乙烯信號途徑相關(guān)的共16個基因的表達情況，結(jié)果顯示：其中的兩個WRKY基因（CL7516.Contig2和Unigene25021）和一個bHLH基因（CL1446）確實受到花瓣衰老的顯著誘導(dǎo)，表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在梔子花花瓣衰老中也發(fā)揮著作用，而其具體調(diào)控機制還有待進一步研究[35]。

果實的成熟和衰老是復(fù)雜的，也是有序的。轉(zhuǎn)錄因子參與果實成熟和衰老的最早證據(jù)是番茄突變體rin、cnr和nor的發(fā)現(xiàn)，這些突變體的果實不能正常成熟，同時果實在成熟過程中既不能產(chǎn)生大量乙烯也不能響應(yīng)外源乙烯信號[36]。除番茄外，從草莓、葡萄、桃、香蕉和龍眼等果實中也相繼分離和鑒定出多種與成熟衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，包括EIN3/EIL、AP2/ERF、MADS-box和NAC等[18]，而WRKY轉(zhuǎn)錄因子對果實成熟衰老調(diào)控的報道相對較少。范中奇等[37]報道了香蕉果實中的MaWRKY31轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控乙烯合成相關(guān)基因（MaACS1和MaACO1）和成熟衰老相關(guān)基因（MaSAG1）的表達而加速香蕉果實成熟衰老。冷敏型果實如香蕉、芒果、龍眼等在低溫貯藏時易導(dǎo)致果實發(fā)生冷害甚至病害，嚴(yán)重影響果實品質(zhì)，縮短貨架期。有研究報道，外源茉莉酸甲酯（MeJA）處理能夠提高芒果、桃、櫻桃番茄、石榴、檸檬等多種果實的耐冷性。Ye等[16]發(fā)現(xiàn)，外源MeJA處理香蕉可以減輕果實的冷害癥狀，進一步找到一個受冷脅迫和外源MeJA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子MaWRKY26，MaWRKY26通過調(diào)控JA合成基因MaLOX2、MaAOS3和MaOPR3來參與JA介導(dǎo)的香蕉果實耐冷性，而MaVQ5蛋白在此過程中起拮抗作用。除JA外，脫落酸（ABA）也是常見的能夠減輕果實冷害的植物激素，同樣是在香蕉果實中，受冷脅迫和ABA誘導(dǎo)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子MaWRKY31/33/60/71能夠通過激活A(yù)BA合成基因MaNCED1和MaNCED2的啟動子活性來調(diào)控ABA的合成，進而參與調(diào)控ABA誘導(dǎo)的香蕉果實的耐冷性，減輕果實冷害癥狀，維持果實品質(zhì)[38]。

3 討論與展望

近年來，隨著園藝作物基因組的破解以及遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)手段的快速發(fā)展，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在園藝作物中的研究取得了一定的進展。研究表明，WRKY在園藝作物中也廣泛地參與著果實、蔬菜、茶葉以及觀賞植物等產(chǎn)品的品質(zhì)形成與維持等生物學(xué)過程。然而，從當(dāng)前的研究進展來看，對植物激素調(diào)控以及果實品質(zhì)形成方面的研究較多，而在果蔬自然衰老、逆境衰老以及在衰老相關(guān)激素信號通路方面的研究相對較少；對單一基因、單一路徑調(diào)控的研究較多，對構(gòu)建多個WRKY基因以及WRKY與其他基因交互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究較少；對描述WRKY轉(zhuǎn)錄因子在某一進程中轉(zhuǎn)錄水平變化的研究較多，對關(guān)鍵WRKY基因進行功能驗證的研究較少。

近年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，CRISPRCas9基因編輯技術(shù)于2014年在番茄中開啟之后，現(xiàn)已成功應(yīng)用于柑橘、黃瓜、蘋果、葡萄、西瓜、獼猴桃、香蕉等果實[39]。構(gòu)建完善的園藝作物轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并借助基因編輯技術(shù)改良關(guān)鍵的WRKY以及其他轉(zhuǎn)錄因子和重要基因，提升園藝產(chǎn)品品質(zhì)，延緩園藝產(chǎn)品采后成熟衰老進程等已成為未來研究的熱點。