汪 磊，王 怡，王佳慧，梁天堅，趙鐵建，鄭 洋

廣西中醫(yī)藥大學賽恩斯新醫(yī)藥學院(廣西 南寧 530222)

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一種受遺傳因素和環(huán)境因素共同作用影響的內(nèi)分泌代謝疾病，主要特征為血糖水平增高并伴有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物代謝紊亂。根據(jù)美國糖尿病協(xié)會(ADA)對DM典型癥狀的分類，將DM分為1型糖尿病、2型糖尿病、其它類型糖尿病、妊娠糖尿病。近年來，DM發(fā)病率逐年增加，已成為世界上繼心、腦血管疾病和癌癥后威脅人類健康的嚴重疾病[1]。全球DM患病率8.8%，中國患病率10.9%[2]。DM影響著機體各個器官系統(tǒng)的功能：高血糖可導致內(nèi)皮細胞受損，阻礙新生血管形成，增加高血壓、動脈粥樣硬化、腎功能不全等疾病的發(fā)生率；DM還可導致視力喪失、周圍神經(jīng)損傷、免疫功能障礙、中風等疾病[3]。因此對DM的治療具有十分重要的意義，目前臨床使用的降糖藥種類繁多，但大都價格高昂，不良反應多。有研究表明[4]中藥治療DM具有多靶點，多途徑，治療成本低，療效確切且不良反應少等特點。

竹瀝(Succusbambusae)為禾本科植物淡竹及同屬數(shù)種植物的莖經(jīng)火烤后流出的淡黃色液汁[5]。晉代葛洪《肘后備急方》中提到竹瀝水用開水兌服可治療消渴癥[6]；明代張介賓《景岳全書》記載竹瀝可治消渴等病癥[7]，但目前尚無竹瀝與DM之間的研究報道。

甲酸(formic acid，F(xiàn)MT)是竹瀝當中最主要的活性成分，化學式CH2O2，化學結(jié)構(gòu)見圖1。隨著網(wǎng)絡藥理學和生物信息學的發(fā)展，使得研究中藥活性成分及其作用的靶點基因有了可用的研究策略[8-9]，本研究通過對FMT作用靶點和DM相關(guān)靶點蛋白進行交互處理，得到FMT治療DM的重要靶點蛋白，并對這些靶點蛋白進行生物信息學分析，獲得竹瀝治療DM的分子生物學機制，希冀為基礎(chǔ)實驗提供科學參考。

圖1 FMT分子3D結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1FMT化學成分作用靶點篩選使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http:ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)收集FMT作用靶點蛋白信息，通過UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫將獲得的靶點蛋白轉(zhuǎn)換為靶點基因，并設置物種為“Homo sapiens”，剔除重復、非人源與不規(guī)范的靶點。結(jié)合文獻報道查找FMT已報道的靶點進行篩選補充。

1.2FMT作用靶點蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡的構(gòu)建將“1.1”項所得的FMT作用靶點信息上傳STRING 10.5在線軟件(http://string-db.org)[10]，限定研究物種為人類，獲得PPI網(wǎng)絡圖。將從STRING數(shù)據(jù)庫導出的tsv文件導入Cytoscape 3.6.1軟件進行可視化分析，并得到網(wǎng)絡分析結(jié)果。進一步設置節(jié)點大小與顏色反映度(degree)值大小，邊的粗細反映Combined score大小，最終獲得PPI網(wǎng)絡。

1.3FMT與DM交互靶點的篩選以diabetes mellitus為關(guān)鍵詞檢索NCBI數(shù)據(jù)庫，選擇物種為Homo sapiens，得到1 958個與DM相關(guān)的基因。與“1.2”項獲得的靶點進行交互比對，獲得FMT治療DM的潛在作用靶點。

1.4通路和基因的富集分析將Gene ID導入DAVID v6.8數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)和gProfiler(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)中，對重要靶點基因進行Pathway分析，然后勾選生物過程(BP)、分子功能(CC)、細胞成分(MF)對基因進行功能富集分析，篩選出來的核心通路用氣泡圖展現(xiàn)出來。

1.5網(wǎng)絡靶點特性分析運用Cytoscape 3.6.1軟件中插件Network Analyzer計算網(wǎng)絡的拓撲參數(shù)。網(wǎng)絡中節(jié)點之間如存在調(diào)控作用關(guān)系則以邊相連。本研究基于平均最短路徑、介數(shù)中心性、中心接近度、聚類系數(shù)、度值等參數(shù)評估節(jié)點在全網(wǎng)絡中的關(guān)鍵性。

2 結(jié)果

2.1FMT作用的靶點信息根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫以及經(jīng)過文獻檢索查找得到552個FMT作用靶點，通過剔除重復、非人源與不規(guī)范的靶點，最終得到FMT的作用靶點232個，其中包括前列腺素環(huán)氧化物酶1(PTGS1)、一氧化氮合酶1(NOS1)、次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1(HPRT1)、前膠原賴氨酸雙加合酶2(PLOD2)、腺苷甲硫氨酸脫羧酶1(AMD1)等。FMT的靶點相互作用見圖2。關(guān)系網(wǎng)絡中節(jié)點詳細信息見表1(僅列度值最高的前20個靶點)。

圖2 FMT作用靶點互作網(wǎng)絡

2.2DM相關(guān)靶點及交互處理結(jié)果在NCBI中檢索DM相關(guān)靶點基因，共篩選出1 958個基因，用篩選出來的基因構(gòu)建了DM靶點數(shù)據(jù)庫，將FMT作用靶點與DM靶點進行比對，得出FMT與DM相關(guān)發(fā)病機制的58個作用靶點，包括PTGS1、NOS1、花生四烯酸5-脂氧合酶(ALOX5)、前列腺素環(huán)氧化物酶2(PTGS2)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、谷氨酸脫羧酶2(GAD2)、環(huán)氧水解酶2(EPHX2)等。其中56個重疊靶點[其中碳酸酐酶1(CA1)與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(ABO)不在網(wǎng)絡中]是FMT與DM作用的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)，并在關(guān)系網(wǎng)絡中體現(xiàn)了較好的連通特性，見表2，圖3，圖4。

表1 FMT作用靶點互作網(wǎng)絡拓撲學分析(度值排名前20)

圖3 FMT靶點與DM發(fā)病相關(guān)靶點韋恩圖

圖4 FTM與DM交互靶點的互作網(wǎng)絡

表2 FMT與DM交互靶點的拓撲學分析

續(xù)表2：

2.3FMT對DM作用靶點的生物信息學分析經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫和gProfiler數(shù)據(jù)庫GO分析得出236個BP，包括小分子代謝過程、藥物代謝過程、有機酸代謝過程等；39個CC，包括細胞外間隙、細胞外小體、細胞外囊泡；35個MF，包括氧化還原酶活性、輔酶結(jié)合、輔因子結(jié)合等，見表3，圖5。經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫分析，共分析出44條信號轉(zhuǎn)導通路，結(jié)果得到與DM相關(guān)度最高的16條相關(guān)通路，其中包括代謝途徑信號通路、氨基酸生物合成信號通路、碳代謝信號通路、抗生素合成信號通路、酪氨酸代謝信號通路、糖酵解/糖異生信號通路、藥物代謝-細胞色素P450信號通路、精氨酸生物合成信號通路、精氨酸與脯氨酸代謝信號通路等，見圖6。

注：紅色：MF(35)；黃色：BP(236)，綠色：CC(39)。圖5 交互靶點蛋白GO功能分析圖

表3 FMT對DM作用靶點的GO分析

圖6 FMT對DM作用靶點的KEGG分析氣泡圖(前16條)

3 討論

DM發(fā)病率正在快速增長，給人們的身心健康帶來極大的危害。DM如果不及時控制，會對全身各種組織器官產(chǎn)生影響，造成各種危及生命的并發(fā)癥。雖然新的降糖藥物不斷研發(fā)并應用于臨床，但經(jīng)濟成本高昂，臨床迫切需要尋找多靶點且安全價廉的降糖藥。近年來中醫(yī)藥在防治DM上取得了較大的進步[11]。根據(jù)DM的病機和臨床特點,其屬于中醫(yī)“消渴”“脾癉”“鬲消”等范圍，古代醫(yī)家多認為,過食肥甘為其病因,“陰虛燥熱”為其病機特點[12]。《黃帝內(nèi)經(jīng)》認為“心移熱于肺，傳為鬲消，火盛灼金，不能生水，故令燥渴?！敝駷r歸心、肺經(jīng)，可泄心火和肺火，竹瀝治療DM具有中醫(yī)理論依據(jù)。

本次研究通過TCMSP和NCBI數(shù)據(jù)庫篩出FMT和DM的相關(guān)靶點分別為232和1958個，交互處理后得出FMT作用于DM靶點58個，這些靶點與DM發(fā)病密切相關(guān)，也是FMT治療DM的重要作用靶點。PTGS是人體內(nèi)合成前列腺素類物質(zhì)的關(guān)鍵酶，有兩個異構(gòu)體PTGS1和PTGS2，PTGS及其產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)人體血藥、炎癥等多種生理和病理的過程[13]。研究表明[14]DM患者血清腫瘤壞死因子(TNF)含量明顯高于正常人，說明TNF與DM發(fā)病關(guān)系密切。外源性TNF對胰島素的敏感性進行有效調(diào)節(jié)，且微血管病變患者的TNF水平相比無微血管病變患者明顯升高，說明在DM的發(fā)生發(fā)展中，TNF可以誘導血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子，對炎癥細胞進行黏附，將內(nèi)皮細胞促凝血因子的水平增加，同時將纖溶酶原激活抑制因子的表達增加，從而逐漸形成血管血栓，對內(nèi)皮細胞的血管平滑肌細胞進行刺激，促進細胞增殖導致血管病變[15-16]?；|(zhì)金屬肽酶(MMP)可以調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的降解，研究表明[17-19]DM慢性潰瘍中MMP及其活性酶顯著升高，即使在未發(fā)生潰瘍的DM皮膚中也檢測到MMP呈高表達,MMP和DM并發(fā)癥的發(fā)生關(guān)系十分密切。乙醇脫氫酶1C(ADH1C)和乙醇脫氫酶1B(ADH1B)可以調(diào)控乙醇的代謝過程[20-21]，研究報道[22]ADH1C與乳腺癌的發(fā)生關(guān)系密切。在糖尿病腎病發(fā)生時，Ras家族成員A(RHOA)含量明顯升高，RHOA信號系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)肌球蛋白磷酸酶活性，使細胞漿內(nèi)磷酸化肌球蛋白輕鏈水平提高，肌動和肌球蛋白交聯(lián)增加，進而促進肌動蛋白微絲骨架聚合，對足細胞骨架結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生重要的影響，從而導致一系列糖尿病腎病的癥狀[23-25]。

網(wǎng)絡節(jié)點的重要性往往通過網(wǎng)絡中心性進行衡量，度中心性反映網(wǎng)絡節(jié)點直接相鄰節(jié)點的數(shù)目，是衡量節(jié)點重要性最簡單直觀的體現(xiàn)；緊密度中心性代表著信號傳遞在節(jié)點之間的速度；介度中心性認為網(wǎng)絡中經(jīng)過某一節(jié)點的最短路徑數(shù)越多，則該節(jié)點影響力越大[26]。

在本次研究中，對FMT作用靶點和FMT作用于DM靶點分別構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡圖，在前者PPI中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、過氧化氫酶(CAT)、磷酸三糖異構(gòu)酶1(TPI1)、2，4-二烯酰輔酶A還原酶1(DECR1)、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2(SHMT2)、乳酸脫氫酶A(LDHA)、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶1(SHMT1)、精氨酸琥珀酸合酶1(ASS1)、谷氨酸草酰轉(zhuǎn)氨酶2(GOT2)是度值排名前幾位的靶點基因，說明FMT發(fā)揮藥理作用與這些基因關(guān)系密切。在后者的PPI網(wǎng)絡中GAPDH、CAT、TNF、PTGS2、TPI1、酪氨酸激酶(SRC)、丙酮酸激酶(PKM)、精氨酸酶1(ARG1)、HMOX1是度值排名前幾位的靶點基因，說明FMT對DM發(fā)揮治療作用于這些基因關(guān)系密切。通過對交互靶點的生物學過程、分子功能、細胞組分GO分析表明，F(xiàn)MT治療DM的機制可能與藥物代謝過程、有機酸代謝過程等生物過程密切相關(guān)，其作用靶點主要位于細胞外間隙、細胞外小體、細胞外囊泡等，這些靶點的功能主要包括氧化還原酶活性、輔酶結(jié)合、輔因子結(jié)合等。KEGG通路GO分析結(jié)果表明FMT治療DM的效應通路主要富集在代謝途徑信號通路、氨基酸生物合成信號通路、碳代謝信號通路、抗生素合成信號通路、酪氨酸代謝信號通路、糖酵解/糖異生信號通路、藥物代謝-細胞色素P450信號通路、精氨酸生物合成信號通路、精氨酸與脯氨酸代謝信號通路等。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學技術(shù)，分析了竹瀝活性成分FMT治療DM的分子生物學機制，得出了FMT治療DM可能的潛在靶點，為進一步理解藥物有效成分-靶點-疾病相互作用機制提供重要理論依據(jù)，也為中醫(yī)藥治療DM提供了新的思路。但是本研究僅限于網(wǎng)絡藥理學層面對治療DM進行了初步研究，由于網(wǎng)絡信息技術(shù)尚不全面、數(shù)據(jù)庫資料準確性及實時更新等方面有待進一步提高等原因，具有一定的局限性。此外竹瀝可能通過藥物中的其它小分子等多種原因?qū)M間接起到調(diào)控作用。因此對竹瀝中其它成分對DM的調(diào)控作用的研究和網(wǎng)絡藥理學結(jié)果的實驗驗證，將成為下一步研究的重要內(nèi)容。