劉暢 張欣玥 蔡汶妤 徐洪偉 周曉馥

摘要：為探究綠色木霉和哈茨木霉對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響，設(shè)置4種處理：以綠色木霉和哈茨木霉混合菌液灌根處理的黃瓜幼苗、綠色木霉灌根處理的黃瓜幼苗、哈茨木霉灌根處理的黃瓜幼苗、PD培養(yǎng)基灌根處理的黃瓜幼苗，對(duì)株高、莖粗、葉寬、葉綠素含量和熒光特性、丙二醛（MDA）含量、過(guò)氧化物酶（POD）活性等進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，施加混合木霉的黃瓜幼苗株高、葉寬、莖粗、葉綠素含量顯著增加，最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSⅡ潛在活性（Fv/Fo）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）、光合電子傳遞速率（ETR）、PSⅡ?qū)嶋H光量子產(chǎn)量[Y（Ⅱ）]以及POD活性顯著增加，同時(shí)非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）及MDA含量顯著降低，表明綠色木霉和哈茨木霉混合菌液能夠顯著促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)，效果優(yōu)于施加單種菌液。

關(guān)鍵詞：哈茨木霉;綠色木霉;黃瓜幼苗;促生效應(yīng)

中圖分類(lèi)號(hào)：S642.201

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）16-0156-04

黃瓜（Cucumis sativus L.）是葫蘆科一年生蔓生或攀援草本植物。黃瓜是我國(guó)最主要的食用蔬菜種類(lèi)之一，其種植面積逐年增長(zhǎng)，所以促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)在蔬菜生產(chǎn)中具有重要意義。

木霉菌（Trichodema spp.） 是生防真菌，在自然界中廣泛存在，通常分布于植物殘?bào)w、植物根以及土壤等環(huán)境中。目前，綠色木霉（Trichoderma aviride） 和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）是木霉菌中常用的2種木霉[1]。Gajera等以黑曲霉侵染的花生為試驗(yàn)材料，研究表明，木霉菌處理可以提高花生超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性[2]。Metwally等以洋蔥為試驗(yàn)材料，研究表明，綠色木霉和叢枝菌根真菌不僅能提高洋蔥的鮮干質(zhì)量、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)和葉面積等生長(zhǎng)參數(shù)，而且能提高洋蔥葉片的葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素和總色素含量[3]。李艷娟等研究表明，木霉可以促進(jìn)杉木種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)，且可以提高其抗逆性[4]。Poveda等研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉在十字花科植物根部定植和誘導(dǎo)系統(tǒng)防御中起著關(guān)鍵作用[5]。Elkelish等以番茄幼苗為試驗(yàn)材料，研究表明，哈茨木霉可通過(guò)調(diào)節(jié)生理生化及分子機(jī)制，減輕水澇后番茄幼苗的生長(zhǎng)變化[6]。Panitch等研究發(fā)現(xiàn)，生防劑、哈茨木霉和枯草芽孢桿菌共同處理可以提高木瓜愈傷組織中咔唑類(lèi)生物堿的積累量[7]。

綠色木霉和哈茨木霉能有效地促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)有著成本低廉、使用安全、持續(xù)效果好、增產(chǎn)穩(wěn)定等多種優(yōu)點(diǎn)。前人的研究多以單一木霉菌種處理的植物為試驗(yàn)材料，本研究采用綠色木霉和哈茨木霉菌液灌根處理的黃瓜幼苗為試驗(yàn)材料，觀察綠色木霉和哈茨木霉對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響，比較分析施加混合木霉與施加單種木霉的作用效果，以期為2種菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試黃瓜品種：津研四號(hào)。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養(yǎng)基;馬鈴薯葡萄糖（PD）液體培養(yǎng)基。

供試菌株：綠色木霉和哈茨木霉菌種由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

供試土壤：黑土，在高壓滅菌鍋中高溫滅菌2 h，放涼備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)于2019年10—12月在吉林省植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。盆栽使用的花盆直徑為28 cm、高為25 cm，每盆播種4穴，每穴 5～6粒種子。在黃瓜播種后 5 d 即真葉初展時(shí)，挑取長(zhǎng)勢(shì)較一致的黃瓜幼苗，利用木霉發(fā)酵液進(jìn)行灌根接種，每2 d澆1次處理后，35 d進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：①綠色木霉和哈茨木霉灌根處理，施10 mL混合木霉發(fā)酵液;②綠色木霉灌根處理，施10 mL綠色木霉發(fā)酵液;③哈茨木霉灌根處理，施10mL哈茨木霉發(fā)酵液;④PD培養(yǎng)基灌根處理（對(duì)照），施10 mL PD培養(yǎng)基。

菌液制備：將2種木霉接種于PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，5 d后產(chǎn)生大量綠色分生孢子，用無(wú)菌水沖洗分生孢子，收集分生孢子液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子濃度調(diào)整為1.5×108 CFU/mL。將分生孢子液以體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量接種到裝有100 mL PD液體培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中，在 28 ℃、180 r/min 搖床中培養(yǎng)3 d，制成木霉發(fā)酵液，備用。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 植株株高、葉寬、莖粗的測(cè)定 利用直尺測(cè)定植株株高與葉寬，利用游標(biāo)卡尺測(cè)定植株莖粗。

1.3.2 葉綠素含量的測(cè)定 分別在相同位置的葉片上選取6個(gè)測(cè)量點(diǎn)，采用葉綠素測(cè)定儀TYS-A測(cè)定葉片的SPAD值，最后計(jì)算記錄數(shù)據(jù)的平均值。

1.3.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 利用IMAGING-PAM調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)（Heinz Walz，德國(guó)）測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，葉片暗適應(yīng)30 min后，測(cè)量光下誘導(dǎo)產(chǎn)生的初始熒光（Fo）以及用飽和脈沖光激發(fā)產(chǎn)生的最大熒光（Fm）。熒光從最大值降至Fo時(shí)，利用光化光[1 600 μmol/（m2·s）]誘導(dǎo)測(cè)定熒光動(dòng)力學(xué)，每隔20 s 打開(kāi)飽和脈沖測(cè)定，當(dāng)PSⅡ反應(yīng)中心處于關(guān)閉狀態(tài)時(shí)的最大熒光產(chǎn)量（Fm′）和任何時(shí)間的實(shí)際熒光強(qiáng)度（F）。最后測(cè)出的參數(shù)包括光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、光化學(xué)熒光淬滅系數(shù)（qP）、非光化學(xué)熒光淬滅系數(shù)（NPQ）、PSⅡ潛在活性（Fv/Fo）等。

1.3.4 過(guò)氧化物酶活性及丙二醛含量的測(cè)定 過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[8]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究采用SPSS 22.0和SigmaPlot 12.5分別對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析及繪制作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色木霉與哈茨木霉對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

如表1所示，通過(guò)數(shù)據(jù)分析表明，施加混合木霉處理的黃瓜幼苗株高、莖粗以及葉寬都顯著高于對(duì)照。單獨(dú)施加綠色木霉和哈茨木霉處理的黃瓜幼苗的株高、莖粗、葉寬同樣比對(duì)照顯著增加。施加混合木霉處理與單獨(dú)施加木霉處理相比，株高和莖粗增加，但葉寬比單獨(dú)施加綠色木霉處理降低8%，比單獨(dú)施加哈茨木霉處理增加10%。結(jié)果表明，綠色木霉與哈茨木霉對(duì)黃瓜幼苗的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，使黃瓜幼苗長(zhǎng)勢(shì)更好、植株粗壯。

2.2 綠色木霉與哈茨木霉對(duì)黃瓜幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素能夠影響植物的光合能力和光合活性。通過(guò)測(cè)定植株葉片的SPAD 值，研究葉片葉綠素含量的變化。如圖1所示，4種處理的黃瓜幼苗葉綠素含量（SPAD值）分別為35.58、34.59、30.09和28.10，混合木霉和綠色木霉灌根處理的黃瓜幼苗比哈茨木霉灌根處理和對(duì)照顯著增加，但施加混合木霉的黃瓜幼苗與施加綠色木霉的黃瓜幼苗之間差異不顯著。表明綠色木霉和哈茨木霉可使黃瓜幼苗葉片中葉綠素含量增加，其中哈茨木霉作用更加明顯，利于植株進(jìn)行光合作用。

2.3 綠色木霉與哈茨木霉對(duì)黃瓜幼苗葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/p>

葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以指示光合機(jī)構(gòu)的性能。圖2為不同處理下黃瓜幼苗PSⅡ模式中的初始熒光（Fo）與最大熒光（Fm）圖像。通過(guò)Fv/Fm能夠較好地判斷植物光合性能，由表2可知，施加混合木霉的黃瓜幼苗的最大光化學(xué)效率值最大，與施加哈茨木霉和對(duì)照間差異顯著，但施加混合木霉與施加綠色木霉間差異不顯著;施加混合木霉的黃瓜幼苗與施加哈茨木霉和對(duì)照組間相比，有效光化學(xué)效率（Fv′/Fm′）增加，說(shuō)明綠色木霉和哈茨木霉混合可使最大光化學(xué)效率和有效光化學(xué)效率增加。施加混合木霉的黃瓜幼苗葉片F(xiàn)v/Fo與施加綠色木霉、哈茨木霉和對(duì)照間差異顯著，施加綠色木霉與施加哈茨木霉和對(duì)照間同樣差異顯著，所以施加混合木霉可促進(jìn)光化學(xué)電子進(jìn)入碳還原過(guò)程。與對(duì)照相比，施加木霉的黃瓜幼苗葉片qP增加，其中施加混合木霉與施加綠色木霉相比顯著增加，施加混合木霉、綠色木霉與施加哈茨木霉相比顯著增加，施加哈茨木霉與對(duì)照相比增加，但差異不顯著。說(shuō)明混合木霉中綠色木霉作用明顯，是使黃瓜幼苗 PSⅡ光化學(xué)電子傳遞活性增高的主要原因。NPQ反映植物耗散過(guò)剩光能為熱的能力，經(jīng)過(guò)混合木霉灌根后的黃瓜幼苗的NPQ比另外3組顯著減少。表明黃瓜幼苗經(jīng)過(guò)綠色木霉和哈茨木霉灌根后未能利用的光能減少。施加混合木霉處理與另外3個(gè)處理的光合電子傳遞效率（ETR）差異顯著。葉綠色熒光數(shù)據(jù)總體表明，混合木霉中綠色木霉促進(jìn)植株生長(zhǎng)的作用明顯。

2.4 綠色木霉與哈茨木霉對(duì)黃瓜幼苗POD活性與MDA含量的影響

由圖3可知，施加混合木霉、綠色木霉和哈茨木霉后，黃瓜幼苗中POD活性升高，與對(duì)照組相比分別顯著增加30%、29%、28%，施加混合木霉對(duì)比施加綠色木霉與哈茨木霉增加，說(shuō)明綠色木霉與哈茨木霉混合后對(duì)黃瓜幼苗POD活性的提高有明顯的促進(jìn)作用。經(jīng)木霉處理后，3種黃瓜幼苗中MDA含量有所降低，施加混合木霉的黃瓜幼苗MDA含量明顯低于對(duì)照組，且與施加綠色木霉和哈茨木霉都差異顯著，說(shuō)明綠色木霉與哈茨木霉都對(duì)黃瓜幼苗的生長(zhǎng)起到了促進(jìn)作用。

3 討論與結(jié)論

目前，對(duì)木霉的研究主要集中于生物防治方面，本研究以黃瓜幼苗為試驗(yàn)材料，研究了綠色木霉與哈茨木霉對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，綠色木霉與哈茨木霉能顯著提高黃瓜幼苗的株高、莖粗、葉寬等生長(zhǎng)因素，這與陸寧海等以番茄幼苗為試驗(yàn)材料的研究結(jié)果[9]一致。株高是衡量作物生長(zhǎng)量的基本標(biāo)志之一，在栽培與耕作實(shí)踐中，通常以株高動(dòng)態(tài)來(lái)衡量各種技術(shù)措施的效果，尤其在相對(duì)值比較中更具有重要的參考價(jià)值[10]。莖是植株主要支撐系統(tǒng)，其高度、粗度和節(jié)間長(zhǎng)度影響植株的株型，從而影響植株生長(zhǎng)[11]。施加綠色木霉與哈茨木霉的混合木霉可增加黃瓜幼苗的株高、莖粗、葉寬等，且效果優(yōu)于對(duì)黃瓜幼苗施加單一菌種。

SPAD值是反映葉綠素含量的指標(biāo)[12]。施加綠色木霉與哈茨木霉的混合木霉可以顯著增加黃瓜幼苗葉片的葉綠素含量，使最大光化學(xué)效率、有效光化學(xué)效率、PSⅡ潛在活性、光化學(xué)淬滅系數(shù)、光合電子傳遞速率、PSⅡ?qū)嶋H光量子產(chǎn)量等葉綠素?zé)晒鈪?shù)顯著增加，其中，施加混合木霉的黃瓜幼苗PSⅡ潛在活性、光化學(xué)淬滅系數(shù)、光合電子傳遞速率與單獨(dú)施加綠色木霉和哈茨木霉的差異顯著，施加混合木霉的黃瓜幼苗最大光化學(xué)效率與單獨(dú)施加哈茨木霉差異顯著，施加混合木霉的黃瓜幼苗有效光化學(xué)效率與施加綠色木霉差異顯著。與楊雄等以濕地松為試驗(yàn)材料結(jié)果一致[13]。NPQ反映的是耗散掉的光能部分，表示PSⅡ的一種自我保護(hù)能力[14]。在本試驗(yàn)中，采用綠色木霉與哈茨木霉的混合木霉灌根的幼苗NPQ值顯著降低，說(shuō)明綠色木霉與哈茨木霉的混合木霉可提高黃瓜幼苗的光合能力，促進(jìn)植株生長(zhǎng)，效果優(yōu)于單一菌種。

過(guò)氧化物酶是果蔬中存在的一種重要的氧化還原酶，它與果蔬的許多生理過(guò)程和生化代謝過(guò)程都有密切關(guān)系[15]。本試驗(yàn)研究綠色木霉和哈茨木霉對(duì)黃瓜幼苗的影響，結(jié)果表明，2種木霉的施加可使黃瓜幼苗的POD活性顯著增加，使黃瓜幼苗抗病性增強(qiáng)，且施加混合木霉的效果優(yōu)于施加單種木霉。遇文婧等研究表明，經(jīng)木霉處理的山新楊的SOD、POD、過(guò)氧化氫酶（CAT）、L-苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性明顯升高[16]。丙二醛的積累會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜等造成傷害，所以試驗(yàn)中通常利用丙二醛的含量作為膜脂過(guò)氧化指標(biāo)[17]。本試驗(yàn)表明，綠色木霉和哈茨木霉處理的黃瓜幼苗丙二醛含量顯著降低，說(shuō)明綠色木霉和哈茨木霉處理后黃瓜幼苗細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度降低，因此可促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Prisana W，Shin-Ichi I，Anurag S. Volatile organic compounds emitted from endophytic fungus Trichoderma asperellum T1 mediate antifungal activity，defense response and promote plant growth in lettuce （Lactuca sativa）[J]. Fungal Ecology，2020，43：100867.

[2]Gajera H P，Katakpara Z A，Patel S V，et al. Antioxidant defense response induced by Trichoderma viride against Aspergillus niger van Tieghem causing collar rot in groundnut （Arachis hypogaea L.）[J]. Microbial Pathogenesis，2016，91：26-34.

[3]Metwally R A，Al-amri S M. Individual and interactive role of Trichoderma viride and arbuscular mycorrhizal fungi on growth and pigment content of onion plants[J]. Letters in Applied Microbiology，2020，70（2）：79-86.

[4]李艷娟，劉 博，莊 正，等. 哈茨木霉與綠色木霉對(duì)杉木種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2017，28（9）：2961-2966.

[5]Poveda J，Hermosa R，Monte E，et al. The Trichoderma harzianum kelch protein ThKEL1 plays a key role in root colonization and the induction of systemic defense in brassicaceae plants[J]. Frontiers in Plant Science，2019，10：3389.

[6]Elkelish A A，Alhaithloul H A S，Qari S H，et al. Pretreatment with Trichoderma harzianum alleviates waterlogging-induced growth alterations in tomato seedlings by modulating physiological，biochemical，and molecular mechanisms[J]. Environmental and Experimental Botany，2020，171：103946.

[7]Panitch B，Supawadee D，Tharita K，et al. Increased carbazole alkaloid accumulation in clausena harmandiana callus culture by treatments of biocontrol agent，Trichoderma harzianum and bacillus subtilis[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2019，189（3）：871-883.

[8]曹建康，姜微波，趙玉梅. 果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2007.

[9]陸寧海，吳利民，徐瑞富. 哈茨木霉RT-12對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)的影響[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（6）：53-54.

[10]何坤輝，常立國(guó)，崔婷婷，等. 多環(huán)境下玉米株高和穗位高的QTL定位[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，49（8）：1443-1452.

[11]吳洋洋，徐婷婷，遲天華，等. 切花菊莖稈性狀的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)與遺傳分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2020，34（1）：55-61.

[12]侯紅乾，林洪鑫，劉秀梅，等. 長(zhǎng)期施肥處理對(duì)雙季晚稻葉綠素?zé)晒馓卣骷白蚜．a(chǎn)量的影響[J]. 作物學(xué)報(bào)，2020，46（2）：280-289.

[13]楊 雄，劉樂(lè)平，李興山，等. 哈茨木霉對(duì)濕地松幼苗光合作用和生物量累積的影響[J]. 湖北林業(yè)科技，2018，47（6）：27-30.

[14]Wittenberghe S V，Alonso L，Malenovs Z，et al. In vivo photoprotection mechanisms observed from leaf spectral absorbance changes showing VIS-NIR slow-induced conformational pigment bed changes[J]. Photosynthesis Research，2019，142（3）：283-305.

[15]劉建新，歐曉彬，王金成，等. 鎘脅迫下裸燕麥幼苗對(duì)外源H2O2的生理響應(yīng)[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2020，29（1）：125-134.

[16]遇文婧，楊 帥，刁桂萍. 深綠木霉對(duì)山新楊生長(zhǎng)及抗葉枯病能力的影響[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，47（1）：71-75.

[17]張 慶，魏樹(shù)和，代惠萍，等. 硒對(duì)茶樹(shù)鎘毒害的緩解作用研究[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，44（1）：200-204.