梁 群 程 漢黃華孫③

(1海南大學熱帶農(nóng)林學院 海南?？?70228;2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所 海南?？?71101)

巴西橡膠樹是大戟科橡膠樹屬植物，是天然 橡膠的最主要來源。橡膠樹樹皮組織中的乳管細胞作為橡膠樹中合成和貯存橡膠的重要組織，一直是研究的重點［1］。橡膠合成有賴于韌皮部中蔗糖等碳源的代謝和運輸及乳管細胞中各種酶的合成反應(yīng)；此外，橡膠樹寒害［2］、割面干涸（Tap‐ping panel dryness，TPD）［3］等生理綜合反應(yīng)都會涉及各種蛋白質(zhì)的表達和功能。樹皮蛋白的成功提取是研究其表達和功能的前提。然而迄今尚未見有較成熟的橡膠樹樹皮蛋白質(zhì)提取方法的報道。

在過去的幾十年里，已有多種植物蛋白樣品制備方法得到應(yīng)用，諸如丙酮沉淀法、TCA/丙酮沉淀法、苯酚提取法、TCA/丙酮-酚提取法、Trizol沉淀法、尿素-硫脲提取法等［4］。但是由于橡膠樹樹皮結(jié)構(gòu)復(fù)雜，木栓化嚴重，次生代謝產(chǎn)物豐富，蛋白含量低且雜質(zhì)含量高，使高質(zhì)量的蛋白樣品制備比較困難，至今尚未有橡膠樹樹皮中蛋白提取的標準方法。王斌等［5］使用改進酚抽法提取巴西橡膠樹木質(zhì)部的蛋白，過程復(fù)雜且步驟繁瑣；袁坤等［6］使用尿素提取液提取方法無法成功獲得高豐度蛋白；谷瑞升等［7］比較了4種木本植物蛋白的提取方法，發(fā)現(xiàn)改良丙酮沉降法對木本植物葉片、懸浮細胞以及花藥蛋白提取有效。本研究以橡膠樹成熟大樹的樹干樹皮，為材料，比較TCA/丙酮沉淀法（方法1）、TCA/丙酮—雙乙法（方法2）、TCA/丙酮-Tris-HCl法（方法3）3種橡膠樹樹皮中總蛋白質(zhì)的提取方法，并對其進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

所用材料為10年生未開割的巴西橡膠樹RRIM 600，采自海南省儋州國家橡膠樹種質(zhì)資源圃，以樹干木栓化的樹皮為材料，剝?nèi)『蟮臉淦そ?jīng)液氮速凍后，迅速置于–80℃冰箱備用。

1.1.2 主要試劑

丙酮、三氯乙酸、鹽酸、無水乙醇、乙醚、考馬斯亮藍G-250等，購自廣州化學試劑廠；尿素、硫脲、二硫蘇糖醇、苯甲基磺酰氟、三羥甲基氨基甲烷、聚乙烯吡咯烷酮、30%丙烯酰胺（29∶1）Acr/Bis、10% AP，購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白定量試劑盒Bradford Protein Assay Kit，購自康維世紀生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

研磨機為德國IKA分析研磨機-All basic，離心機為Thermo Scientific的HERAEUS Multifuge X1R，METTLER Toledo DELTA 320 pH計，真空干燥機CentriVap Concentrator LABCONCO，超聲波破碎機，MULTISCAN GO酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹樹皮總蛋白提取

TCA/丙酮沉淀法：參照Sarawanan等［8］的方法，在此方法基礎(chǔ)上稍作改進。稱取一定量的樹皮置于液氮預(yù)冷過的研缽中，加入0.5%（m/m）PVPP防止研磨過程中氧化，反復(fù)加入液氮研磨至粉末；在研磨后的樣品中加入等體積的10%的TCA-丙酮溶液懸浮、0.1 mol/L PMSF、1 mol/L DTT至其終濃度分別為1 mmol/L、10 mmol/L，于-20℃靜置6 h或過夜后，以4℃、20 000 g離心15 min，棄上清；沉淀用等體積的預(yù)冷的丙酮溶液重懸?。尤?0 mmol/L DTT），于-20℃靜置1 h后，以4℃、20 000 g離心15 min，棄上清，用丙酮再重復(fù)洗2次直至沒有顏色；取出沉淀真空干燥約5 min，除盡有機溶劑；按照10 mg干粉末加入200滋L尿素裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS）的比例，再加入1 mmol/L PMSF、10 mmol/L DTT，超聲5 min，充分溶解1 h后，以4℃，35 000 g離心30 min，上清為所需的蛋白溶液。

TCA/丙酮—雙乙法：與TCA/丙酮沉淀法相比，在用TCA/丙酮清洗樹皮粉末3次并離心后，加入雙乙試劑（V乙醇∶V乙醚＝1∶1），于-20℃靜置1 h后，以4℃，20 000 g離心15 min，棄上清；再加入丙酮重復(fù)洗2次直至沒有顏色。后續(xù)操作均與TCA/丙酮沉淀法相同。

TCA/丙酮-Tris-HCl法：按TCA/丙酮沉淀法的操作進行至真空干燥獲得樹皮干粉后，用Tris-HCl（120 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、4% SDS）溶液代替尿素裂解液溶解樹皮粉末，其他操作均與TCA/丙酮沉淀法相同。

1.2.2 蛋白定量

使用康為世紀生物科技有限公司的Bradford Protein Assay Kit測量蛋白質(zhì)濃度，以試劑盒中的牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白質(zhì)制作標準曲線；取待測樣品1滋L于試劑盒中的考馬斯亮藍G-250顯色液中，使用MULTISCAN GO酶標儀測其OD595值，蛋白質(zhì)濃度表示為mg/mL，重復(fù)3次以評估蛋白質(zhì)提取效率。

1.2.3 SDS-PAGE與Western blot

制作2塊SDS-PAGE膠，分離膠和濃縮膠的濃度分別是10%和5%；將上述3種方法提取的蛋白母液用SDS-PAGE上樣緩沖液稀釋，在100℃下煮沸5 min后迅速置于冰上，待其冷卻后加入孔中，50 V起始電壓，待樣品進入分離膠后將電壓升到100 V；電泳完畢后將其中一塊膠進行考馬斯亮藍R-250染色，另一塊膠進行western blot實驗，具體實驗步驟參考abcam官網(wǎng)［9］的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種橡膠樹樹皮總蛋白提取方法比較

采用的3種橡膠樹樹皮蛋白提取方法，在傳統(tǒng)的丙酮/TCA法的基礎(chǔ)上稍加改進。橡膠樹樹皮經(jīng)過液氮研磨后，加入TCA/丙酮勻漿，經(jīng)過離心、真空干燥等步驟得到樹皮干粉；隨后加入尿素裂解液、雙乙試劑和Tris-HCl提取液溶解，經(jīng)過超聲波助溶破碎離心，得到樹皮總蛋白的粗提液（圖1）。由于傳統(tǒng)的提取方法最后的蛋白溶解時間過長，容易造成蛋白質(zhì)降解，因此改進方法中主要優(yōu)化了提取液配方，以防止蛋白質(zhì)降解。TCA/丙酮-雙乙法是先使用雙乙試劑（V乙醇∶V乙醚＝1∶1）清洗殘留丙酮，用尿素裂解液溶解提?。籘CA/丙酮-Tris-HCl法采用Tris-HCl提取液（120 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、4%SDS）。

圖1三種蛋白質(zhì)提取方案的示意圖

2.2 三種總蛋白提取方法的提取效率比較

使用3種提取方案對蛋白質(zhì)提取物進行定量比較，發(fā)現(xiàn)不同提取方法獲得的蛋白質(zhì)質(zhì)量有所差異。TCA/丙酮沉淀法耗時最少，且Western blot結(jié)果清晰，無雜帶，但總蛋白電泳可見的條帶數(shù)目最少，蛋白濃度偏低。TCA/丙酮—雙乙法耗時最多，可見條帶數(shù)目比TCA/丙酮要多，蛋白濃度相差不大。TCA/丙酮-Tris-HCl法耗時較少，提取蛋白的濃度最高達到3.21 mg/mL，SDS-PAGE電泳的條帶清晰，上樣孔干凈，泳道無拖尾，條帶數(shù)量最多。綜合來看，TCA/丙酮-Tris-HCl提取的蛋白質(zhì)量較好（表1）。

表1三種橡膠樹樹皮總蛋白提取方法的提取效果比較

2.3 三種總蛋白提取方法的電泳結(jié)果

將3種方法提取的蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，上樣量均為100滋g。電泳結(jié)束后進行考馬斯亮藍染色與脫色，結(jié)果如圖2所示。TCA/丙酮法（泳道1）和TCA/丙酮—雙乙法（泳道2）提取的蛋白經(jīng)過電泳后，泳道背景較深，加樣孔中有殘留雜質(zhì)，泳道拖尾嚴重，主帶難以區(qū)分，說明這2種方法提取的總蛋白中含有較多的雜質(zhì)。TCA/丙酮-Tris-HCl法（泳道3）提取的蛋白經(jīng)過電泳后，泳道背景最淡，加樣孔干凈無殘留，蛋白條帶清晰可見。使用Gel Image Analysis軟件分析膠圖可知，方法1檢測條帶數(shù)目為8條，方法2檢測條帶數(shù)目為11條，方法3檢測條帶數(shù)目為22條。表明TCA/丙酮-Tris-HCl法提取的橡膠樹樹皮總蛋白凝膠電泳效果最好。

圖2不同提取方法提取橡膠樹樹皮總蛋白的單向電泳圖

2.4 三種蛋白提取方法的Western blot分析

將提取的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，經(jīng)過Western blot分析后的結(jié)果如圖3所示。使用Western blot對橡膠樹樹皮中微管蛋白tubulin進行定量分析可知，圖譜背景清晰，蛋白條帶清晰且位置大小正確。在使用相同上樣量的情況下，TCA/丙酮-Tris-HCl法的條帶更亮，常規(guī)TCA/丙酮沉淀法和TCA/丙酮—雙乙法的條帶較弱。推測原因可能是樣品雜質(zhì)較高導致這2種方法提取的蛋白量偏高。

圖3 3種蛋白提取方法提取橡膠樹樹皮tubulin蛋白定量

3 討論

橡膠樹樹皮蛋白提取過程復(fù)雜，且研磨困難。本研究為了得到充分研磨好的樹皮粉末，首先使用剪刀剪碎樹皮，然后使用研磨機研磨樹皮，操作時間過長，因此可能會導致蛋白質(zhì)降解。因此，后續(xù)的提取方法中，在抑制蛋白降解方面要有所改進。

常規(guī)TCA/丙酮提取法耗時少且容易操作，一般作為植物蛋白提取的初始方案，是目前提取植物蛋白的常用方法之一，具有降低次生代謝物質(zhì)干擾、減少蛋白降解等優(yōu)點，但該方法常用于幼嫩組織中蛋白的提取，不適用于更為復(fù)雜的植物組織［10］；該方法的一個最大缺點是蛋白質(zhì)很難重新溶解，而且樣品中的非蛋白成分很難除去，可能會丟失膜蛋白和疏水性蛋白［11］。用乙醇—乙醚洗滌以除去水溶性雜質(zhì)（包括高濃度的鹽離子），比傳統(tǒng)的TCA/丙酮法方法能更有效地排除雜質(zhì)干擾；TCA丙酮-Tris-HCl法的提取效果明顯比前2個方法更好，主要表現(xiàn)在蛋白條帶的數(shù)目以及條帶的清晰度，而且Tris-HC1法操作簡便，時間較短，成本適中，提取步驟簡單，減少了因處理步驟繁多而造成的蛋白質(zhì)損失，大大提高了試驗結(jié)果的重復(fù)性［10］。

巴西橡膠樹作為一種重要的產(chǎn)膠作物，其主要經(jīng)濟價值均存在于樹皮中的乳管細胞。開展乳管及樹皮內(nèi)重要蛋白質(zhì)功能研究對于后續(xù)進行橡膠合成及代謝調(diào)控研究至關(guān)重要。本研究通過比較3種橡膠樹樹皮蛋白質(zhì)提取方法，提出了一種簡單高效的橡膠樹樹皮蛋白提取方法，為進一步開展橡膠樹樹皮內(nèi)重要蛋白功能研究提供了參考。