（廣州市第十二人民醫(yī)院 血液科，廣東 廣州 510620）

再生障礙性貧血（以下簡(jiǎn)稱再障）是一種主要由T淋巴細(xì)胞免疫紊亂介導(dǎo)的獲得性骨髓造血功能衰竭癥，主要表現(xiàn)為全血細(xì)胞減少，可出現(xiàn)較嚴(yán)重的感染、貧血及出血。隨著免疫抑制劑治療及造血干細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展，該病的預(yù)后得到大大改善。盡管如此，仍有部分患者對(duì)免疫抑制劑治療不耐受、無(wú)效[1-2]。本課題組前期應(yīng)用白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）/粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）體外處理的自體外周血單個(gè)核細(xì)胞治療約200例再障患者，獲得約80%總有效率及30%完全緩解率，未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，為再障患者提供了開創(chuàng)性的可選擇的療法，但缺乏系統(tǒng)的機(jī)制探索[3-7]。T淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)及多種與造血有關(guān)的正負(fù)調(diào)控細(xì)胞因子分泌異常在再障的發(fā)生、發(fā)展及臨床轉(zhuǎn)歸中起著重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察IL-2/GM-CSF體外處理的外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)再障小鼠T淋巴細(xì)胞亞群比例及造血細(xì)胞因子水平的影響來(lái)探討再障細(xì)胞治療的機(jī)制，為臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠（H-2d，Mlsb）42只，8～10周齡，體重16～18 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。其中6只不做任何處理的小鼠作為對(duì)照組；24只小鼠復(fù)制免疫介導(dǎo)模型后作為模型組和干預(yù)組，模型組12只小鼠輸注生理鹽水，干預(yù)組12只小鼠輸注細(xì)胞。剩余12只小鼠采集外周血單個(gè)核細(xì)胞。清潔級(jí)DBA/2小鼠（H-2d，Mlsa）3只，雌雄兼用，6～14周齡，體重16～20 g，作為胸腺、淋巴結(jié)細(xì)胞供體，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002。

1.2 模型復(fù)制

依據(jù)參考文獻(xiàn)[8]和[9]，將3只DBA/2小鼠頸椎脫臼處死，常規(guī)消毒，無(wú)菌取出胸腺及頸部、頜下、腸系膜等處淋巴結(jié)，分別獲胸腺、淋巴結(jié)細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，按胸腺細(xì)胞與淋巴結(jié)細(xì)胞1∶2 混合，獲得胸腺淋巴結(jié)細(xì)胞懸液。用臺(tái)盼藍(lán)鑒定細(xì)胞活性，活性細(xì)胞＞95%。雌性BALB/c小鼠經(jīng)5.5 Gy（1.1 Gy/min，5 min）60Co γ-射線全身照射，照射后4 h 內(nèi)經(jīng)尾靜脈注入DBA/2小鼠胸腺淋巴結(jié)細(xì)胞（1×106個(gè)/只）。小鼠照射后立即移入SPF級(jí)無(wú)菌層流室內(nèi)，飲用加入慶大霉素（40萬(wàn)u/L）和二性霉素B（50 mg/L）的高壓滅菌水。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離、培養(yǎng)

參考課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法[10]，將12只健康BALB/c小鼠頸椎脫臼處死，常規(guī)消毒，無(wú)菌心臟采血，分離單個(gè)核細(xì)胞。加入含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Invitrogen公司），添加小鼠IL-2（2 ng/ml）、GM-CSF（1 ng/ml）、鈣離子載體（100 ng/ml）（美國(guó)Sigma公司）等刺激因子，置于37℃、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

1.4 細(xì)胞輸注

參考課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法[10]并優(yōu)化方案，收集上述培養(yǎng)后的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，干預(yù)組再障小鼠模型復(fù)制第1、2、4及6 天經(jīng)尾靜脈各輸注1次，每只小鼠輸注細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)（0.2 ml）/次。模型組小鼠每次輸注等體積無(wú)菌生理鹽水。對(duì)照組小鼠不做任何處理。

1.5 觀察指標(biāo)及結(jié)果分析

每日觀察并記錄小鼠活力、形態(tài)、飲食、體重等一般情況。于模型復(fù)制第7、14、21及28天斷尾采血檢測(cè)外周血WBC、Hb及PLT。于模型復(fù)制第28天或?yàn)l死時(shí)處死小鼠，對(duì)照組小鼠也同步處死。取股骨沖洗，收集骨髓計(jì)數(shù)有核細(xì)胞（粒系、紅系和淋巴細(xì)胞比例及巨核細(xì)胞數(shù)），摘眼球采血用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD3+CD4+（T 輔助細(xì)胞、Th 細(xì)胞）、CD3+CD8+（T 抑制細(xì)胞、Ts細(xì)胞）及CD4+CD25+CD127-（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、T-regs）細(xì)胞比例（小鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司），采用ELISA 法檢測(cè)血清中TNF-α、γ 干擾素（IFN-γ）水平，ELISA試劑盒購(gòu)自?shī)W地利Bender Medsystems公司。

通過(guò)比較各組小鼠一般情況及外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)了解再障模型復(fù)制是否成功，了解干預(yù)組小鼠骨髓造血是否改善。通過(guò)比較各組小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例及造血細(xì)胞因子水平，尋找規(guī)律，探索機(jī)制。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞輸注對(duì)再障小鼠一般情況的影響

對(duì)照組、模型組、干預(yù)組小鼠模型復(fù)制前體重分別為（17.1±0.8）、（17.2±0.7）和（17.1±0.6）g，經(jīng)方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.068，P=0.934）。模型組和干預(yù)組模型復(fù)制后較對(duì)照組一般情況差，且行動(dòng)遲緩、弓背、豎毛及食量減少。模型復(fù)制第7天，模型組和干預(yù)組飲食、飲水明顯減少，體重減少。模型復(fù)制第14天，干預(yù)組一般情況逐漸好轉(zhuǎn)，活動(dòng)增多，弓背、豎毛逐漸好轉(zhuǎn)，飲食、飲水量增加，體重增加；模型組小鼠一般情況無(wú)改善，且開始出現(xiàn)死亡。對(duì)照組、模型組、干預(yù)組小鼠模型復(fù)制第28天體重分別為（22.1±0.8）、（18.9±0.8）和（21.5±0.7）g，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.844，P=0.000）；模型組較對(duì)照組和干預(yù)組輕（P＜0.05），干預(yù)組接近對(duì)照組（P＞0.05）。模型組共死亡4只，干預(yù)組無(wú)死亡。

2.2 細(xì)胞輸注對(duì)再障小鼠外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血WBC比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組和干預(yù)組較對(duì)照組低（P＜0.05），干預(yù)組在第21和28天較模型組高（P＜0.05）。見表1。

各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血PLT比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組和干預(yù)組較對(duì)照組低（P＜0.05），干預(yù)組在第21和28天較模型組高（P＜0.05）。見表2。

各組小鼠第7天外周血Hb比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組小鼠第14、21和28天外周血Hb水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組和干預(yù)組較對(duì)照組低（P＜0.05），干預(yù)組在第28天較模型組高（P＜0.05）。見表3。

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血WBC比較 （×109/L，±s）

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血WBC比較 （×109/L，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別 第7天 第14天 第21天 第28天對(duì)照組 8.4±1.4 7.6±0.8 8.2±1.3 8.2±1.3模型組 3.6±0.9① 2.9±1.1① 2.5±0.8① 2.4±0.6①干預(yù)組 3.6±0.8① 2.9±1.0① 4.6±1.0①② 5.6±1.3①②F值 57.041 52.060 64.959 46.743 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血PLT比較 （×109/L，±s）

表2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血PLT比較 （×109/L，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別 第7天 第14天 第21天 第28天對(duì)照組 529.8±47.0 583.2±55.4 555.0±47.6 571.5±73.8模型組 122.7±22.8① 103.7±21.7① 100.2±20.3① 96.7±22.5①干預(yù)組 128.3±20.8① 118.0±20.0① 285.4±38.5①② 397.6±40.0①②F值 493.196 580.010 310.146 198.409 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血Hb比較 （g/L，±s）

表3 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血Hb比較 （g/L，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別 第7天 第14天 第21天 第28天對(duì)照組 150.7±16.1 157.4±15.3 158.7±16.7 154.0±14.6模型組 147.2±14.0 122.5±18.7① 110.7±15.3① 109.0±16.7①干預(yù)組 145.7±15.7 126.6±16.9① 116.1±18.7① 134.6±18.7①②F值 0.224 8.690 16.520 12.058 P值 0.800 0.001 0.000 0.000

2.3 細(xì)胞輸注對(duì)再障小鼠骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

各組小鼠骨髓粒系比例、紅系比例、淋巴細(xì)胞比例及巨核細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組和干預(yù)組粒系比例、紅系比例及巨核細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組低，淋巴細(xì)胞比例較對(duì)照組高（P＜0.05），結(jié)合上述模型組一般情況差和外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，提示再障模型復(fù)制成功。干預(yù)組骨髓粒系比例、紅系比例及巨核細(xì)胞數(shù)較模型組高，淋巴細(xì)胞比例較模型組低（P＜0.05），結(jié)合上述干預(yù)組小鼠一般情況改善和外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)升高，提示干預(yù)組小鼠骨髓造血改善。見表4。

2.4 細(xì)胞輸注對(duì)再障小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例的影響

各組小鼠外周血Th 細(xì)胞比例、T-regs細(xì)胞比例及Ts細(xì)胞比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組Th 細(xì)胞比例、T-regs細(xì)胞比例較對(duì)照組低（P＜0.05），Ts細(xì)胞比例較對(duì)照組高（P＜0.05）；干預(yù)組Th 細(xì)胞比例、T-regs細(xì)胞比例較模型組高，Ts細(xì)胞比例較模型組低（P＜0.05）；干預(yù)組與對(duì)照組小鼠外周血Th 細(xì)胞比例、T-regs細(xì)胞比例及Ts細(xì)胞比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

2.5 細(xì)胞輸注對(duì)再障小鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平的影響

各組小鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組較對(duì)照組高（P＜0.05），干預(yù)組較模型組低（P＜0.05）；干預(yù)組與對(duì)照組小鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表4 各組小鼠骨髓粒系比例、紅系比例、淋巴細(xì)胞比例及巨核細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

表4 各組小鼠骨髓粒系比例、紅系比例、淋巴細(xì)胞比例及巨核細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別 n 骨髓粒系比例/% 紅系比例/% 淋巴細(xì)胞比例/% 巨核細(xì)胞數(shù)/個(gè)對(duì)照組 6 56.5±2.2 20.3±2.4 22.1±1.6 40.2±2.9模型組 8 18.7±1.6① 9.4±1.4① 69.7±4.3① 5.9±2.0①干預(yù)組 12 38.7±2.7①② 15.1±1.7①② 43.9±3.4①② 28.7±3.5①②F值 475.755 64.919 338.065 255.692 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表5 各組小鼠外周血Th 細(xì)胞比例、T-regs細(xì)胞比例及Ts細(xì)胞比例和TNF-α、IFN-γ水平比較 （±s）

表5 各組小鼠外周血Th 細(xì)胞比例、T-regs細(xì)胞比例及Ts細(xì)胞比例和TNF-α、IFN-γ水平比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別 n Th 細(xì)胞比例/% T-regs細(xì)胞比例/% Ts細(xì)胞比例/% TNF-α/（ng/L）IFN-γ/（ng/L）對(duì)照組 6 37.1±2.8 8.5±1.6 13.6±2.7 330.4±45.7 267.7±43.9模型組 8 23.3±2.5① 3.7±1.1① 25.5±2.5① 543.3±97.2① 355.5±58.7①干預(yù)組 12 34.3±3.4② 7.2±1.3② 15.9±3.8② 351.8±47.1② 282.1±32.4②F值 44.419 26.065 29.839 25.088 8.826 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001

3 討論

再障發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，主要涉及免疫功能紊亂、造血微環(huán)境異常和造血干/祖細(xì)胞缺陷，其中T淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂導(dǎo)致造血干/祖細(xì)胞損傷是發(fā)病的主要環(huán)節(jié)[11-12]。目前認(rèn)為T細(xì)胞可通過(guò)以下3種重要途徑導(dǎo)致骨髓衰竭：①直接損傷造血干/祖細(xì)胞，抑制其增殖；②造成細(xì)胞因子分泌紊亂，正負(fù)調(diào)控造血細(xì)胞因子失調(diào)，尤其是IFN-γ、TNF-α 等造血抑制因子明顯升高，參與抑制造血；③直接或通過(guò)造血細(xì)胞因子間接誘導(dǎo)造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞發(fā)生凋亡[11-12]。T淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)及多種與造血有關(guān)的正負(fù)調(diào)控細(xì)胞因子分泌異常在再障的發(fā)生、發(fā)展及臨床轉(zhuǎn)歸中起著重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察IL-2/GM-CSF體外處理的外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)再障小鼠T淋巴細(xì)胞亞群比例及造血細(xì)胞因子水平的影響，來(lái)探討再障細(xì)胞治療的機(jī)制。

本研究成功復(fù)制了再障小鼠模型，再障小鼠模型復(fù)制后一般情況較差，行動(dòng)遲緩、弓背及豎毛，飲食、飲水減少，體重減輕，外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，骨髓粒系比例、紅系比例及巨核細(xì)胞數(shù)下降，淋巴細(xì)胞比例升高。其中接受細(xì)胞輸注的干預(yù)組小鼠，模型復(fù)制第14天一般情況開始好轉(zhuǎn)，第21天外周血細(xì)胞水平開始改善，第28天體重及外周血細(xì)胞水平、骨髓有核細(xì)胞比例均升高，而模型組小鼠一般情況無(wú)改善，外周血細(xì)胞水平及骨髓有核細(xì)胞比例均無(wú)改善。結(jié)果表明，輸注IL-2/GM-CSF體外處理的外周血單個(gè)核細(xì)胞后再障小鼠骨髓造血功能得到顯著改善。

有研究表明，再障患者體內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞（Ts細(xì)胞）數(shù)量增加、功能增強(qiáng)，是骨髓造血衰竭的直接原因；活化的Ts細(xì)胞通過(guò)釋放穿孔素、顆粒酶B 等直接殺傷造血細(xì)胞，同時(shí)還分泌IFN-γ、TNF-α 等造血負(fù)調(diào)控細(xì)胞因子，表達(dá)上調(diào)的負(fù)調(diào)控因子一方面直接抑制造血細(xì)胞的增殖、分化，另一方面誘導(dǎo)造血細(xì)胞發(fā)生凋亡；活化的Ts細(xì)胞還通過(guò)Fas/FasL 通路的異常活化介導(dǎo)骨髓單個(gè)核細(xì)胞凋亡，直接損傷造血干細(xì)胞或組細(xì)胞[13-16]。

有研究也證實(shí)，CD4+T淋巴細(xì)胞平衡紊亂也是再障骨髓造血衰竭的重要原因，包括Th 細(xì)胞（Th1 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞）、T-regs細(xì)胞比例失衡等；T-regs細(xì)胞通過(guò)抑制自身反應(yīng)性效應(yīng)T細(xì)胞來(lái)控制自身免疫的發(fā)生、發(fā)展，再障患者體內(nèi)Thl 比例明顯增高，T-regs細(xì)胞數(shù)量降低、功能減弱，免疫抑制功能缺陷導(dǎo)致對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的免疫監(jiān)控能力下降，從而介導(dǎo)骨髓造血功能損傷[17-20]。淋巴細(xì)胞亞群紊亂導(dǎo)致再障患者血液中造血負(fù)調(diào)控細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α 等顯著上調(diào)，加重免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)再障的發(fā)生、發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠外周血Th 細(xì)胞、T-regs細(xì)胞比例較對(duì)照組降低，Ts細(xì)胞比例較對(duì)照組升高，TNF-α、IFN-γ水平較對(duì)照組升高，而干預(yù)組Th 細(xì)胞、T-regs細(xì)胞比例較模型組升高，Ts細(xì)胞比例較模型組降低，TNF-α、IFN-γ水平較模型組降低。該結(jié)果提示，T淋巴細(xì)胞亞群紊亂、T細(xì)胞異?；罨霸煅?fù)調(diào)控細(xì)胞因子水平升高參與模型復(fù)制后再障小鼠疾病的發(fā)生、發(fā)展，而細(xì)胞輸注有助于上調(diào)Th 細(xì)胞比例、Ts細(xì)胞比例，下調(diào)T-regs細(xì)胞比例及造血負(fù)調(diào)控細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ，從而發(fā)揮其促造血作用。

綜上所述，本研究提示輸注IL-2/GM-CSF體外處理的外周血單個(gè)核細(xì)胞有助于調(diào)節(jié)再障小鼠T淋巴細(xì)胞亞群紊亂、下調(diào)造血負(fù)調(diào)控細(xì)胞因子，從而改善骨髓造血功能，為自體外周血單個(gè)核細(xì)胞治療再障患者的臨床研究提供了理論依據(jù)。