王婷，黃永漢，楊畫，黃娟華，徐杰偉，張清學(xué)

（1.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心 廣東 廣州 510030；2.佛山市第一人民醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心 廣東 佛山 528000；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥工程學(xué)院 廣東 佛山528225）

隱睪是最常見的男性生殖系統(tǒng)先天畸形之一，又稱睪丸下降不全。隱睪周圍溫度比陰囊內(nèi)高2～3℃，會(huì)導(dǎo)致生精細(xì)胞過度凋亡，從而影響生育。隱睪在足月男嬰中發(fā)病率達(dá)3%～4%[1]，隨著環(huán)境污染加劇，食物中各種性激素的濫用，隱睪發(fā)病率逐年上升[2]。研究顯示，隱睪是男性不育的重要原因之一[3]。在睪丸下降過程中，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可能導(dǎo)致隱睪，具體機(jī)制尚不清楚，目前有內(nèi)分泌學(xué)說、解剖學(xué)說、雄激素受體、遺傳因素及環(huán)境中的危險(xiǎn)因素等多種解釋[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，氟他胺（Flutamide,Flu）能影響睪丸發(fā)育，抑制睪丸下降，其機(jī)制可能與阻斷胚胎期雄性激素有關(guān)[3-5]。本研究采用Flu誘導(dǎo)SD大鼠，復(fù)制隱睪模型，探討視黃酸對(duì)隱睪生精細(xì)胞增殖分化及減數(shù)分裂的作用及其機(jī)制，為男性不育奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇210～230 g SPF級(jí)SD大鼠60只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004，單位許可證號(hào)：SYXK（翼）2014-0062。大鼠在佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度控制在22～25℃，相對(duì)濕度60%～70%，室內(nèi)每天通風(fēng)換氣1、2次。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將雌雄大鼠按1∶1 合籠，每日觀察雌鼠的陰栓。對(duì)陰栓脫落雌鼠分籠喂養(yǎng)并標(biāo)記為妊娠0 d（30只SD孕鼠均懷孕）。所有操作均按照3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將30只SD孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、干預(yù)組，每組10只。模型組大鼠孕12～20 d 皮下注射Flu 25 mg/（kg·d）（玉米油配制）。干預(yù)組在模型組基礎(chǔ)上，其子代雄鼠出生后第1～10 天及第28～30 天皮下注射視黃酸1 mg/（kg·d）（玉米油配制）。對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)不給任何藥物或試劑。每組取10只子代雄鼠進(jìn)行研究。

1.3 主要試劑與儀器

Stra8、Scp3、c-Kit、PLZF 兔多克隆抗體（美國BD公司，批號(hào)分別為orb131626、562530、555714和3032695），BCA試劑盒（北京諾博萊德科技有限公司，批號(hào)：P1511），DAB顯色試劑盒（福州中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZLI-9031），TUNEL System試劑盒（美國Promega公司，批號(hào)：230684），分析純Flu（美國Sigma公司，批號(hào)：20160225），RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司，批號(hào)：D6110A）。PCR引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，SP5 激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司），ABI9700RT-PCR 擴(kuò)增儀（美國ABI公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 睪丸標(biāo)本采集手術(shù)收集3組子代雄性大鼠睪丸，將睪丸用生理鹽水洗凈后切成數(shù)份，一份放置于液氮中保存；另一份在4%多聚甲醛中固定。

1.4.2 大鼠睪丸組織HE染色 將各組睪丸組織用4%多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋，切片行HE染色，觀察其組織學(xué)形態(tài)差異。

1.4.3 TUNEL法取相應(yīng)的睪丸組織玻片常規(guī)脫蠟水化，按照TUNEL System 試劑盒說明書進(jìn)行操作，在熒光顯微鏡下觀察攝像。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.4 免疫組織化學(xué)法取大鼠睪丸組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)SP 二步法進(jìn)行檢測(cè)。組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片、脫蠟、水化，加熱修復(fù)，H2O2封閉，滴加適量稀釋的大鼠c-Kit、Stra8、Scp3 抗體，4℃過夜，PBS 沖洗，加入生物素標(biāo)記二抗室溫孵育，DAB顯色，封片后顯微鏡下觀察。蛋白陽性反應(yīng)呈棕色。

1.4.5 qRT-PCR采用Trizol 法提取大鼠睪丸組織總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 模板，反應(yīng)體系配制及反應(yīng)條件嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2－ΔΔCt法計(jì)算Stra8、c-Kit、Scp3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4.6 Western blotting提取大鼠睪丸組織總蛋白，經(jīng)BCA 法蛋白定量后上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，取出聚偏二氟乙烯膜，麗春紅染液，封閉2 h。分別加入一抗稀釋液，漂洗，加入二抗孵育2 h后，Tris-HCl 緩沖鹽溶液漂洗，最后顯影。用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin 內(nèi)參條帶灰度值的比值表示Stra8、c-Kit、Scp3、PLZF 蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隱睪和合并畸形情況

模型組和干預(yù)組隱睪大鼠模型復(fù)制成功，睪丸均位于腹股溝區(qū)。模型組單側(cè)隱睪6例，雙側(cè)隱睪4例，均合并尿道下裂。干預(yù)組單側(cè)隱睪5例，雙側(cè)隱睪5例，8例合并尿道下裂。

2.2 大鼠睪丸組織學(xué)形態(tài)差異

與對(duì)照組相比，模型組睪丸各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)目減少、排列紊亂；管腔中央無絮狀精子形成，且曲細(xì)精管管腔間隙變大，管腔明顯縮窄。對(duì)照組和干預(yù)組中發(fā)現(xiàn)大量精子細(xì)胞及絮狀精子，且各層生精細(xì)胞排列整齊。見圖1。

圖1 3組子代大鼠睪丸組織學(xué)形態(tài) （HE染色×400）

2.3 生精細(xì)胞凋亡情況

TUNEL 法檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組可見大量生精細(xì)胞凋亡，而對(duì)照組和干預(yù)組生精細(xì)胞凋亡數(shù)較少（見圖2）。對(duì)照組、模型組、干預(yù)組凋亡指數(shù)分別為（0.10±0.09）、（0.25±0.11）和（0.11±0.08），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.678，P=0.000）；對(duì)照組和干預(yù)組低于模型組（P＜0.05）。

2.4 睪丸組織中c-Kit、Stra8、Scp3 蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組相比，模型組c-Kit、Stra8、Scp3 蛋白表達(dá)水平下降，而干預(yù)組視黃酸干預(yù)后c-Kit、Stra8、Scp3 蛋白表達(dá)較模型組上升，趨于正常。見圖3。

2.5 3組大鼠睪丸組織中Stra8、c-Kit、Scp3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3組大鼠睪丸組織中Stra8、c-Kit、Scp3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組和干預(yù)組高于模型組（P＜0.05）。見表1。

2.6 3組大鼠睪丸組織中Stra8、c-Kit、Scp3、PLZF 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3組大鼠睪丸組織中Stra8、c-Kit、Scp3、PLZF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組和干預(yù)組高于模型組（P＜0.05）。見表2和圖4。

圖2 3組大鼠出生后30 d 睪丸內(nèi)生精細(xì)胞凋亡情況 （TUNEL×400）

圖3 3組大鼠睪丸組織中c-Kit、Stra8、Scp3 蛋白的表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色×400）

表1 3組大鼠睪丸組織中Stra8、c-Kit、Scp3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，x±s）

表2 3組大鼠睪丸組織中Stra8、c-Kit、Scp3、PLZF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，x±s）

圖4 3組大鼠睪丸組織中Stra8、Scp3、c-Kit、PLZF蛋白的表達(dá)

3 討論

隱睪常見并發(fā)癥包括不育及生育力下降。研究隱睪的病理學(xué)變化及隱睪中生精細(xì)胞的增殖分化，對(duì)治療男性不育有重要意義。許多隱睪的研究來自于臨床活檢[6]，但來源的限制使研究并不能夠完整地反映睪丸組織病變情況。所以本研究采用Flu 孕期給藥，成功復(fù)制子代隱睪大鼠。視黃酸在生精過程中發(fā)揮重要作用，其作為維生素A的活性代謝產(chǎn)物，參與精子形成的各個(gè)階段調(diào)控。因此，本研究采用視黃酸作為干預(yù)劑，明確視黃酸是否能夠調(diào)控隱睪生精細(xì)胞增殖分化及減數(shù)分裂。

本研究中，模型組大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)改變明顯。HE染色結(jié)果顯示，模型組睪丸各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)目減少、排列紊亂；管腔中央無絮狀精子形成，且曲細(xì)精管管腔間隙變大、管腔明顯縮窄，與既往報(bào)道相符[7]。而對(duì)照組和干預(yù)組中發(fā)現(xiàn)大量精子細(xì)胞及絮狀精子，且各層生精細(xì)胞排列整齊。TUNEL 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組中可見大量生精細(xì)胞凋亡。與模型組相比，干預(yù)組生精細(xì)胞凋亡指數(shù)大幅下降，與HE染色結(jié)果基本一致，證實(shí)隱睪睪丸出現(xiàn)明顯病理改變，生精細(xì)胞凋亡增多，支持細(xì)胞間的緊密結(jié)構(gòu)被破壞，精子數(shù)量下降，這可能是產(chǎn)生生育障礙的重要原因，而視黃酸能夠恢復(fù)隱睪睪丸的生精環(huán)境，抑制生精細(xì)胞凋亡。

精原干細(xì)胞的分裂具有不對(duì)稱性，在分化同時(shí)自我復(fù)制，這樣的增殖和分化是生精過程不斷持續(xù)的基礎(chǔ)，但這個(gè)過程受到很多因子的調(diào)控。目前研究比較多的是Stra8、Scp3、c-Kit和PLZF，其中Stra8、Scp3是減數(shù)分裂的關(guān)鍵因子，c-Kit、PLZF與增殖分化關(guān)系密切。Stra8是視黃酸的目標(biāo)基因，被認(rèn)為是減數(shù)分裂的啟動(dòng)基因，其在生精細(xì)胞從有絲分裂向減數(shù)分裂轉(zhuǎn)換過程中表達(dá)上調(diào)[8-9]。有報(bào)道指出，精母細(xì)胞在Stra8 缺失情況下將停留在DNA 復(fù)制階段，減數(shù)分裂無法啟動(dòng)，導(dǎo)致精子形成障礙[10]。Scp3是生精細(xì)胞減數(shù)分裂的標(biāo)志基因，參與染色體聯(lián)會(huì)復(fù)合體的組成[11]。據(jù)研究報(bào)道，Scp3基因變異可能導(dǎo)致無精癥[12]。PLZF在精原干細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用[13-15]，參與精原干細(xì)胞的自我復(fù)制，維持其數(shù)量。c-Kit 在精原細(xì)胞分化過程中與其配體SCF 一起發(fā)揮重要作用[16-18]，其表達(dá)水平反映精原細(xì)胞分化活動(dòng)的強(qiáng)弱。本研究中免疫組織化學(xué)和qRT-PCR 反應(yīng)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠睪丸組織中c-Kit、Stra8、Scp3 蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，而視黃酸干預(yù)后大鼠睪丸組織中c-Kit、Stra8、Scp3 蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，趨于正常水平；Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組Stra8、Scp3、c-Kit及PLZF 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組和干預(yù)組，與免疫組織化學(xué)和qRT-PCR反應(yīng)結(jié)果基本一致。隱睪組織中Stra8、Scp3 蛋白和mRNA表達(dá)減少，提示隱睪減數(shù)分裂被終止，無法繼續(xù)進(jìn)行；在補(bǔ)充視黃酸后Stra8、Scp3表達(dá)上升，提示視黃酸能恢復(fù)隱睪減數(shù)分裂。隱睪組織中PLZF 蛋白、c-Kit 蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào)，表明隱睪精原細(xì)胞的增殖、分化出現(xiàn)問題，而視黃酸干預(yù)后其蛋白表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組差異不大，說明視黃酸能促進(jìn)精原細(xì)胞增殖、分化。

綜上所述，本研究通過隱睪大鼠模型，證實(shí)睪丸病理結(jié)構(gòu)的改變可能是其生殖障礙的重要原因。模型組睪丸生精細(xì)胞的增殖分化和減數(shù)分裂能力較對(duì)照組明顯下降，而視黃酸干預(yù)后Stra8、Scp3、c-Kit、PLZF 蛋白及Stra8、Scp3、c-Kit mRNA表達(dá)水平上升，提示視黃酸能促進(jìn)生精細(xì)胞發(fā)育，為隱睪生精障礙的預(yù)防、治療帶來希望。