（杭州市兒童醫(yī)院 感染科，浙江 杭州 310014）

Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus,EBV）屬于人類皰疹病毒γ 亞科嗜B淋巴細胞組群中的DNA病毒[1]，在學齡前兒童中較為常見，是引起兒童傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis,IM）最主要的病原體之一[2]。在感染潛伏期，EBV 主要是附著于B淋巴細胞中，但此時B細胞并不表達EBV 核蛋白，故不具備致病性[3]。但是當極少數(shù)記憶B細胞分化成漿細胞時，可釋放出病毒顆粒，激活細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte,CTL），導致炎癥因子大量釋放，包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和多種白細胞介素（Interleukin,IL）等[4]。此時EBV 從潛伏狀態(tài)變?yōu)樵鲋碃顟B(tài)，可引發(fā)一系列臨床癥狀。此外，在EBV感染早期，單核細胞、樹突狀細胞等抗原提呈細胞表面的Toll 樣受體（Toll like receptors,TLRs）可識別病毒蛋白，進而啟動宿主的抗病毒免疫應答[5]。炎癥反應和免疫破壞協(xié)同作用可能是導致IM 預后不良的重要原因[6]。本研究旨在分析EB 感染IM患兒外周血淋巴細胞亞群、細胞因子，以及TLR7、TLR9分子的表達情況，以揭示EBV感染對兒童免疫功能的影響及IM的發(fā)病機制，為臨床檢測和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2019年12月杭州市兒童醫(yī)院收治的98例感染EBV致IM急性期患兒作為研究對象。其中，男性58例，女性40例；年齡13個月～13歲，平均（52.39±28.35）個月。納入標準：①符合《兒童EB病毒相關疾病的診斷標準和治療原則》[7]中臨床診斷及實驗室診斷標準；②初診為感染EBV致IM，發(fā)病1～7 d；③EBV DNA＞1×103拷貝/ml，EBV-VCA IgM（+）或早期抗原IgG（+），且抗EBVEBNA1 IgG（-）；④1～13歲兒童；⑤配合完成治療及相關檢查，急性期與恢復期均未使用激素、免疫調節(jié)劑。排除標準：①先天性免疫缺陷或合并免疫系統(tǒng)疾病，既往有變態(tài)反應疾病史；②合并惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾?。虎廴虢M前3個月服用糖皮質激素、細胞毒性藥物或其他免疫抑制劑。另選取同期本院體檢的健康兒童50例作為對照組，血漿EBV-DNA檢查為陰性。對照組男性25例，女性25例；年齡1～13歲，平均（49.36±25.78）個月。兩組年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，患兒家屬或法定監(jiān)護人均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑

TG16臺式高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司），Cytomics FC500型流式細胞儀、流式試管及配套設備（美國Beckman Coulter公司），SpectraMax M3 多功能酶標儀（美國MD公司），F(xiàn)icoll 單個核細胞分離液（北京索萊寶生物科技有限公司）。EBV特異性抗體試劑盒（深圳賽爾生物技術有限公司），F(xiàn)ITC-CD3、RD1-CD4、ECD-CD8、PE-CD16+56+、APC-CD19 熒光標記單克隆抗體及同型對照抗體（美國Beckman Coulter公司），酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國R&D公司），Trizol 試劑和M-MLV 試劑盒（美國Invitrogen公司），SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒（大連寶生生物工程有限公司），核酸提取試劑盒（廣州中山大學達安基因股份有限公司）。

1.3 治療

IM患兒入院后首先完成血常規(guī)、生化指標、肝腎功能檢查。采用ELISA檢測EBV 特異性抗體，予以臥床、退熱、補充體液及維生素、保護臟器等綜合性支持治療，保持呼吸道暢通；必要時給予阿昔洛韋注射液（武漢普生制藥有限公司，規(guī)格0.25 g/支，批準文號：國藥準字H4202019）10 mg/（kg·d）抗病毒治療，靜脈注射，1次/8 h，連續(xù)治療7 d。伴有細菌感染的患兒則給予抗生素治療，并積極應對并發(fā)癥，必要時糾正血清電解質紊亂和酸堿平衡。

1.4 檢測指標

1.4.1 血液標本采集患兒治療前（急性期）和病程滿1個月復查（恢復期）時，由兒科護士分別無菌抽取患兒清晨空腹靜脈血2、2和4 ml，置于肝素抗凝管、采血管、乙二胺四乙酸抗凝管中，分別用于檢測外周血淋巴細胞亞群比例、血清細胞因子水平，以及收集外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）。對照組兒童采用同樣的方法采集外周靜脈血，收集全血和血清，保存至-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 淋巴細胞亞群檢測采用全血免洗法檢測CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+56+。

1.4.3 細胞因子檢測采用ELISA 抗體雙夾心法檢測IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、α 干擾素（Interferon-α,IFN-α）、IFN-γ。取出試劑盒及血清標本，溫度平衡至室溫。使用前將所有試劑充分搖勻，嚴格按照操作說明書進行檢測。

1.4.4 TLR7和TLR9 mRNA檢測采用Ficoll 密度梯度離心法分離外周全血PBMC，采用Trizol 試劑提取PBMC的總RNA，并逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒進行qRT-PCR 反應，反應體系為20μl，反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，52℃退火10 s，72℃延伸2 min，共36個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對表達量。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.5 EBV DNA載量檢測采用qRT-PCR檢測全血標本EBV DNA載量。BamH1-W 正向引物：5'-GCCAGAGGTAAGTGGACTTT-3'，反向引物：5'-TACCACCTCCTCTTCTTGCT-3'，長度389 bp；熒光探針序列：5'-CACACCCAGGCACACACTACACAT-3'。根據(jù)標準曲線計算EBV-DNA載量。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差 （±s）或中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較用t檢驗或秩和檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman 法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血淋巴細胞亞群、細胞因子、TLRs mRNA比較

兩組外周血淋巴細胞亞群百分比（CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+56+）、細胞因子水平（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-α、IFN-γ）、TLR7和TLR9 mRNA相對表達量比較，經(jīng)t或秩和檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與對照組相比，IM組患兒急性期外周血CD3+、CD8+、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TLR7和TLR9 mRNA相對表達量升高，CD4+、CD19+、CD16+56+降低。兩組血清IFN-α 水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2～4。

2.2 IM患兒外周血淋巴細胞亞群、細胞因子、TLRs mRNA與EBV DNA載量的關系

經(jīng)Spearman相關性分析，IM患兒急性期EBV DNA載量與血清IL-1β和TLR9 mRNA呈正相關（r=0.247和0.348，P=0.017和0.000），與其他指標無關（P＞0.05）。見圖1。

2.3 急性期和恢復期患兒外周血淋巴細胞亞群、細胞因子、TLRs mRNA相對表達量比較

急性期與恢復期患兒外周血淋巴細胞亞群百分比（CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+56+）、細胞因子水平（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ）、TLR7和TLR9 mRNA相對表達量比較，經(jīng)t或秩和檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與急性期相比，恢復期外周血CD3+、CD8+、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TLR7和TLR9 mRNA相對表達量降低，CD4+、CD19+、CD16+56+升高。急性期與恢復期患兒血清IFN-α 水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表5～7。

表2 兩組外周血淋巴細胞亞群比較 （%，±s）

表2 兩組外周血淋巴細胞亞群比較 （%，±s）

組別 n CD3+ CD4+ CD8+ CD19+ CD16+56+對照組 50 67.27±5.91 36.82±5.74 27.65±6.17 19.74±3.59 17.81±5.27 IM組急性期 98 82.17±5.78 17.45±5.97 55.16±10.81 6.94±3.76 7.34±3.81 t值 14.721 18.910 16.647 19.885 13.834 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 兩組外周血清細胞因子水平比較 [pg/ml，M（P25，P75）]

表4 兩組外周血PMBCs 中TLR7和TLR9 mRNA相對表達量比較 （±s）

表4 兩組外周血PMBCs 中TLR7和TLR9 mRNA相對表達量比較 （±s）

組別 n TLR7 mRNA TLR9 mRNA對照組 50 1.12±0.33 1.04±0.25 IM組急性期 98 2.71±0.95 6.75±2.13 t值 11.471 18.859 P值 0.000 0.000

表5 急性期與恢復期患兒外周血淋巴細胞亞群比較 （n=98，%，±s）

表5 急性期與恢復期患兒外周血淋巴細胞亞群比較 （n=98，%，±s）

時間 CD3+ CD4+ CD8+ CD19+ CD16+56+急性期 82.17±5.78 17.45±5.97 55.16±10.81 6.94±3.76 7.34±3.81恢復期 73.53±7.56 27.57±7.31 40.34±8.65 12.69±4.10 12.75±5.02 t值 8.742 17.328 10.436 13.208 9.236 P值 0.000 0.000 0.002 0.000 0.000

圖1 IM患兒急性期EBV DNA載量與IL-1β、TLR9 mRNA的相關性

表6 急性期與恢復期患兒外周血清細胞因子水平比較 [n =98，pg/ml，M（P25，P75）]

表7 急性期與恢復期患兒外周血PMBCs 中TLRs mRNA相對表達量比較 （n=98，±s）

表7 急性期與恢復期患兒外周血PMBCs 中TLRs mRNA相對表達量比較 （n=98，±s）

時間 TLR7 mRNA TLR9 mRNA急性期 2.71±0.95 6.75±2.13恢復期 1.75±0.56 3.38±1.43 t值 5.688 8.923 P值 0.000 0.000

3 討論

EBV感染在學齡前兒童中較為常見，易引起多種急性傳染性疾病，其中IM 較為常見。藍仙娥等[8]對25 185例學齡前兒童的血液標本進行EBV-EBNA1 IgG和EBV-VCA IgG 抗體檢測，發(fā)現(xiàn)EBV 累積感染率為48.80%，其中IM患病率為7.90%。雖然IM 屬于自限性疾病，預后良好，但是由于兒童機體免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，極少數(shù)患兒可能會伴發(fā)周圍神經(jīng)炎、腦膜炎、肝損傷等疾病[9]，機體不同免疫狀態(tài)感染EBV 導致IM的轉歸和預后也存在較大差異。

EBV屬于嗜B淋巴細胞DNA病毒，由于B淋巴細胞表面存在EBV受體，因此EBV 進入宿主體內后，主要附著于B淋巴細胞中。在感染潛伏期，EBVEBNA2可驅動B細胞大量增殖并分化成為記憶B細胞，但此時B淋巴細胞并不表達EBV 核蛋白，故EBV無自我復制能力。隨著EBV感染的進展，攜帶EBV的B淋巴細胞在外周血中大量增殖，可誘導機體固有免疫應答清除大部分EBV 陽性B淋巴細胞，但是仍有極少部分B淋巴細胞逃避機體免疫系統(tǒng)的攻擊，分化成漿細胞，釋放出病毒顆粒，此時EBV感染進入急性期，逐漸表現(xiàn)出頸部淋巴結腫大、咽痛、扁桃體腫大、發(fā)熱、皮疹等臨床癥狀[10]。CD19是B淋巴細胞表面的特異性糖基化跨膜蛋白標志分子[11]。本研究結果表明，IM急性期患兒CD19+較對照組降低，但是與EBV-DNA載量無直接關系,說明B淋巴細胞在EBV急性期并不能直接反映EBV的復制情況。這主要是由于絕大多數(shù)EBV 陽性B細胞被CTL 殺傷破壞，只有極少數(shù)B細胞被激活，進而刺激T淋巴細胞的活化和增殖，刺激機體發(fā)生獲得性免疫應答。因此，在本研究中，IM急性期患兒CD3+和CD8+升高，同時CD4+降低。有研究提出，CD4+細胞不僅可以協(xié)助B細胞產生抗體，中和抗原，還能夠誘導和維持CD8+細胞發(fā)揮細胞毒作用，進而影響EBV 陽性B細胞增殖，例如在CD4+細胞缺失時，CD8+細胞對EBV 陽性B細胞增殖的抑制作用不明顯[12]。IM急性期患兒體內EBV 特異性CD4+細胞占血液循環(huán)CD4+細胞的1%左右，EBV特異性CD4+細胞可產生功能性細胞因子，進而抑制EBV誘導的B細胞轉化；此外還可誘導特異性CD8+細胞識別EBV 裂解期抗原，進而殺傷EBV 陽性B細胞。與潛伏期相比，EBV 特異性CD8+細胞顯著增殖，通過分泌穿孔素/顆粒酶直接殺傷感染EBV的B淋巴細胞，或通過腫瘤壞死因子途徑誘導EBV感染的B淋巴細胞凋亡。當IM患兒進入恢復期后，CD4+升高，CD8+降低，說明機體免疫功能逐漸恢復正常，同時可避免效應T細胞的過度增殖，以及細胞因子大量分泌對機體造成的過度免疫損傷[13]。

此外，EBV在B淋巴細胞中建立潛伏感染后，樹突狀細胞、自然殺傷細胞均被激活，其表面TLRs可識別EBV 膜蛋白，并將信號傳遞給細胞內的各類接頭分子，進而激活下游炎癥因子，例如漿細胞樣樹突狀細胞通過TLR9分子識別EBV 顆粒中的線性病毒DNA，而髓樣樹突狀細胞則可通過TLR7 識別EBV 衍生的單鏈RNA，向初始T淋巴細胞傳遞EBV 抗原，并刺激初始T淋巴細胞分化為CTL、輔助性T細胞、調節(jié)性T細胞等，進而啟動獲得性免疫應答[14]。炎癥反應與免疫破壞協(xié)同作用，可能是導致IM 預后不良的重要原因。本研究結果表明，IM急性期患兒外周血PBMC 中TLR7和TLR9 mRNA相對表達量顯著升高，說明EBV感染可通過激活TLR7或TLR9 mRNA表達，使宿主B細胞存活，并借助細胞因子逃避宿主的免疫殺傷作用。EBV 除了通過影響TLRs的表達及信號傳遞影響B(tài)細胞增殖以外，還可以通過影響下游細胞因子的分泌，干擾機體抗病毒能力。在本研究中，IM急性期患兒血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平升高，也進一步證實EBV感染可通過TLRs信號通路誘發(fā)機體炎癥反應，并且協(xié)助EBV的免疫逃逸。而患兒進入恢復期后，TLR7和TLR9 mRNA相對表達量降低，外周血淋巴細胞亞群逐漸恢復正常。VALENTE 等[15]研究證實，上調TLR7和TLR9 可促進干擾素調節(jié)因子IRF7的產生，進而激活EBVLMP1基因的表達。而IRF7與EBV 陽性B淋巴細胞的分化和增殖密切相關，因而干擾TLR7或TLR9 mRNA的表達有望成為治療EBV感染的重要方法。

綜上所述，IM患兒機體免疫系統(tǒng)、炎癥反應及TLRs信號通路都與疾病的發(fā)生和轉歸有關，監(jiān)測IM患兒不同時期外周血淋巴細胞亞群、細胞因子、TLR7和TLR9 mRNA變化，尤其是血清IL-1β和TLR9 mRNA的表達，有助于及時了解IM患兒的免疫狀態(tài)及病情發(fā)展，為臨床治療提供一定的參考。