（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 血管外科，湖南 衡陽 421001）

放療所致頸動脈炎是頭頸惡性腫瘤放療患者卒中新的獨立危險因素。放療會造成照射野內(nèi)血管損傷，其動脈損傷導(dǎo)致動脈血管狹窄會引起患者出現(xiàn)一過性黑朦、輕癱、感覺障礙等癥狀，嚴(yán)重狹窄會增加發(fā)生腦血管事件的風(fēng)險[1-3]。因此，早期減輕放療性頸動脈炎，可減緩頸動脈狹窄發(fā)展進程，從而降低腦卒中發(fā)生率。放射線對血管內(nèi)皮損傷致巨噬細胞的活化是放療后動脈炎發(fā)生的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，輻射刺激可誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體活化，從而促進細胞分泌炎癥因子IL-1β、IL-18[4]。姜黃素?zé)熕狨ナ墙S素和煙酸兩者結(jié)合形成的新型化合物，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等諸多藥理作用。研究表明，姜黃素在炎癥疾病中能起到良好的抗炎作用[5-6]。因此，本實驗以巨噬細胞作為模型，通過射線照射巨噬細胞，以姜黃素?zé)熕狨ジ深A(yù)，觀察其對放療后炎癥介質(zhì)釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

姜黃素?zé)熕狨ビ珊现嗅t(yī)藥大學(xué)庹勤慧老師贈送，將其溶于二甲基亞砜 （DMSO） 中，儲液濃度為1.0 μmol/L。實驗所用一抗為多克隆兔抗人白細胞介素-1β （IL-1β） （ab2105） 、兔抗人白細胞介素-18 （IL-18） （ab71495） 、鼠抗人β-actin （ab8227） 購自美國Abcam公司，巨噬細胞 （RAW264.7） 由南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床實驗中心所有，高糖DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天有限公司，Western blotting 發(fā)光液購自北京英格恩生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自廣州七星生物科技有限公司，Siemens Primus 直線加速器購自德國西門子公司，參數(shù)設(shè)定為6 MVX，吸收劑量為200 Gy/min，源皮距為100 cm。

1.2 方法

1.2.1 照射劑量常規(guī)對RAW264.7 細胞進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。RAW264.7 細胞的照射劑量為200 Gy/min。將處于對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞給予不同劑量 （0、2、4和8 Gy） 的照射，照射完畢后，提取細胞總蛋白，應(yīng)用Western blotting 檢測IL-1β、IL-18的表達。

1.2.2 細胞分組分為空白對照組 （0.0 μmol/L） 、單純照射組 （Vector） 、姜黃素?zé)熕狨ゲ煌瑵舛冉M （1.0、3.0和9.0 μmol/L）?？瞻讓φ战M和單純照射組照射前不給予藥物干預(yù)，姜黃素?zé)熕狨ゲ煌瑵舛冉M照射前1 h 預(yù)先給予不同濃度的姜黃素?zé)熕狨?，照射?4 h提取細胞總蛋白行進一步檢測。

1.2.3 Westernblotting 檢測照射后24 h 收集各組細胞，提取細胞總蛋白，蛋白定量檢測按BCA 蛋白定量試劑盒說明書進行操作。取25 mg 蛋白上樣進行SDSPAGE 電泳，80 V 穩(wěn)壓轉(zhuǎn)膜，以含5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃孵育后，洗膜加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光 （ECL） 法檢測。以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.4 CCK-8實驗取對數(shù)生長期RAW264.7 細胞消化后進行稀釋，并計算濃度，按10 000個/孔細胞接種于64孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。貼壁過夜后去除培養(yǎng)基，加入根據(jù)實驗需要配置的梯度濃度姜黃素?zé)熕狨?，每?00 μl。24 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入新鮮培養(yǎng)基100 μl及CCK-8 試劑10 μl，注意不要留有氣泡。培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)30 min，然后立即取出置于酶標(biāo)儀，于波長450 nm處檢測吸光度值，以3個復(fù)孔平均值作為每個樣本最終結(jié)果，實驗重復(fù)3次，根據(jù)說明書計算生存分?jǐn)?shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 最適照射劑量

射線照射后內(nèi)IL-1β、IL-18的蛋白表達水平升高 （見圖1、2）。以0、2、4和8 Gy 劑量放射線照射RAW264.7 細胞后，各組IL-1β的蛋白表達水平分別為 （0.157±0.009） 、 （0.387±0.010） 、 （0.437±0.010）和 （0.396±0.010），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （F=436.534，P=0.000）。2、4和8 Gy組分別與0 Gy組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。各組IL-18的蛋白表達水平分別為 （0.899±0.004） 、 （1.074±0.044） 、 （1.375±0.038）和 （1.240±0.041），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （F=74.762，P=0.000）。2、4和8 Gy組分別與0 Gy組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。IL-1β、IL-18表達水平在0～4 Gy 照射劑量范圍隨照射劑量增加而升高，而8 Gy 照射后有所下降，因此4 Gy 是最適照射劑量。

2.2 姜黃素?zé)熕狨φ丈浜驲AW264.7 細胞IL-1β、IL-18蛋白表達的影響

行CCK-8 實驗檢測姜黃素?zé)熕狨ゲ煌瑵舛冉M生存率，結(jié)果顯示各組生存率＞80%。見圖3。

圖1 不同劑量放射線照射后RAW264.7 細胞的IL-1β 蛋白表達

圖2 不同劑量放射線照射后RAW264.7 細胞的IL-18蛋白表達

圖3 不同濃度姜黃素?zé)熕狨AW264.7 細胞毒性的影響 （±s）

照射前1 h分別給予1.0、3.0和9.0 μmol/L 姜黃素?zé)熕狨?，再?jīng)最適照射劑量4 Gy 照射，24 h后提取蛋白，空白對照組 （0.0 μmol/L） 、單純照射組 （Vector） 、姜黃素?zé)熕狨ゲ煌瑵舛冉M （1.0、3.0和9.0 μmol/L） IL-1β的蛋白表達水平分別為 （0.244±0.008） 、 （0.580±0.012） 、 （0.419±0.012） 、 （0.333±0.025）和 （0.439±0.003），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （F=235.134，P=0.000），各組IL-1β的蛋白表達水平分別與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），各組IL-1β的蛋白表達水平分別與單純照射組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。見圖4。

由圖5示：空白對照組 （0.0 μmol/L） 、單純照射組 （Vector） 、姜黃素?zé)熕狨ゲ煌瑵舛冉M （1.0、3.0和9.0 μmol/L） IL-18的蛋白表達的水平分別為 （0.454±0.006） 、 （0.711±0.010） 、 （0.463±0.016） 、 （0.385±0.018） 及 （0.361±0.023），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （F=182.243，P=0.000）。各組IL-18的蛋白表達水平分別與空白對照組比較，除1.0 μmol/L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），其余組差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05） ；各組IL-18的蛋白表達水平分別與單純照射組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。

圖4 各組RAW264.7 細胞IL-1β 蛋白的表達

圖5 各組RAW264.7 細胞IL-18蛋白的表達

3 討論

放療引起的血管損傷機制是放射線導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)，釋放炎癥介質(zhì)導(dǎo)致動脈炎性損傷。抑制巨噬細胞的活化、減少炎癥因子釋放，可減輕放射性動脈損傷，延緩頸動脈狹窄的發(fā)生。研究表明抗炎、抗氧化、抗免疫調(diào)節(jié)是姜黃素諸多藥理作用之一[7]。JAIN 等[8]研究表明，在姜黃素干預(yù)后糖尿病大鼠的炎癥因子TNF-α、IL-6表達水平下降。姜黃素的缺點是其體內(nèi)代謝消除快、生物利用度低，臨床應(yīng)用受到限制。調(diào)節(jié)炎癥因子藥物煙酸單用有皮膚潮紅、瘙癢、肝功能損害等副作用。因此，將姜黃素和煙酸兩者結(jié)合形成新型化合物姜黃素?zé)熕狨?，可充分發(fā)揮煙酸的調(diào)節(jié)炎癥因子以及姜黃素的抗炎作用，可提高其生物利用度，減輕副反應(yīng)。因此，本實驗從細胞層面探討姜黃素?zé)熕狨ρ装Y因子IL-1β、IL-18的抑制作用，證明其可作為輻射防護藥物。

本研究結(jié)果顯示，巨噬細胞在受到射線照射后，隨著照射劑量的增大，細胞IL-1β、IL-18蛋白的表達升高，于4 Gy 照射劑量時達到峰值，但是當(dāng)照射劑量達8 Gy時，IL-1β、IL-18的蛋白表達反而下降，究其原因可能為大劑量射線照射時細胞損傷增加，從而影響細胞的活性進而導(dǎo)致IL-1β、IL-18的蛋白表達降低，因此4 Gy 是其最適照射劑量。在4 Gy 射線照射前預(yù)先給予不同濃度的姜黃素?zé)熕狨?，隨著姜黃素?zé)熕狨┝吭黾?，IL-1β、IL-18的蛋白表達水平降低，提示姜黃素?zé)熕狨タ蓽p少輻射誘導(dǎo)的IL-1β、IL-18的表達，減輕細胞的炎癥反應(yīng)，對細胞具有保護作用。

本研究中未涉及細胞培養(yǎng)基中分泌型IL-1β、IL-18表達的檢測，這也正是本課題組進一步研究的內(nèi)容。包括放療前后及姜黃素?zé)熕狨ジ深A(yù)處理后培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18表達的變化；同時，可以收集臨床患者接受放療前后的血清，檢測IL-1β、IL-18的表達變化。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)4 Gy 照射巨噬細胞可誘導(dǎo)細胞IL-1β、IL-18的蛋白表達，一定劑量的姜黃素?zé)熕狨タ山档洼椛浜缶奘杉毎鸌L-1β、IL-18的蛋白表達水平，抑制炎癥反應(yīng)，具有較好的輻射防護作用。