郭元元，張 力，蔣月喜，陳振東，黃如葵，宋煥忠，車江旅，吳永升，陳 琴，零 活，張云蕓

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 南寧 530007； 2.廣西壯族自治區(qū)蔬菜育種與新技術(shù)研究重點實驗室南寧 530007； 3.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 南寧 530007）

細香蔥（Allium schoenoprasum）又名香蔥、小蔥，是百合科（Liliaceae）蔥屬多年生簇生草本植物，以嫩葉和假莖供食，味辛香、性溫，具有殺菌、解熱、通便、助消化、預(yù)防感冒等功效，是一種鮮食加工兼用的調(diào)味香料蔬菜[1-2]。廣西壯族自治區(qū)地處熱帶亞熱帶，熱量豐富、雨水豐沛，適宜香蔥生長。廣西細香蔥規(guī)模化種植歷史悠久。目前年均區(qū)內(nèi)種植面積約2 萬hm2（集中于南寧市、柳江市、百色市、桂林市、玉林市等地），產(chǎn)值超過100 億元，產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)優(yōu)勢突出，在廣西蔬菜周年生產(chǎn)供應(yīng)中占一席之地，也成為廣西“南菜北運”和“西菜東運”的特色蔬菜種類之一[3-4]。以地方種質(zhì)資源為基礎(chǔ)而形成的‘柳江細蔥’‘鐘山撒子蔥’‘桂林矮婆娘’‘玉林紅蔥’‘靈川靈香1 號’‘靈川靈香2 號’等[5-6]品種的品質(zhì)優(yōu)異、葉綠油韌、蔥白緊實，氣味濃郁，深受群眾歡迎，為當(dāng)?shù)剞r(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展、農(nóng)民增收做出了重大貢獻。生產(chǎn)上細香蔥多為無性繁殖，長期栽培過程中種質(zhì)不斷退化。在眾多育種方法中，雜交育種是最基本最常用也是最有成效的方法，對蔥屬作物原始材料創(chuàng)新的作用巨大[7-8]?；ǚ凼侵参锏男叟渥芋w，在植物的有性繁育過程中發(fā)揮著重要作用。父本具有良好的花粉活力是成功進行雜交育種的重要條件[9]。在授粉之前檢驗花粉的生活力，以確定花粉發(fā)芽的可靠程度，這對繁殖效率提高及有效實施雜交育種具有重要意義。為了合理利用細香蔥種質(zhì)資源，挖掘與創(chuàng)新香蔥品種，開展細香蔥育種研究勢在必行。在蔥屬花粉活力測定方面，曾有采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法、聯(lián)苯胺染色法、四甲基偶氮唑（MTT）法、碘－碘化鉀法、花粉離體萌發(fā)法等對蔥屬韭蔥、高葶韭、韭菜及百合等其他作物的花粉活力進行測定報道[10-13]，而細香蔥花粉萌發(fā)方面鮮見報道。筆者以細香蔥花粉為材料，采用蔥屬其他作物中花粉活力測定最常用的TTC 染色法、聯(lián)苯胺染色法、花粉離體萌發(fā)法進行不同花粉活力測定方法比較，以期篩選出適宜的簡單快速測定方法，并采用該方法對不同細香蔥種質(zhì)資源的花粉活力進行測定，為香蔥種質(zhì)的有效利用和育種工作提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗設(shè)計

試驗于2019 年3 月在廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所中試基地香蔥資源圃及廣西蔬菜育種與新技術(shù)研究重點實驗室開展。

選取從各地收集的香蔥地方種質(zhì)資源為試驗對象（表1），于設(shè)施大棚中栽培，畦寬1.5 m 包溝，溝寬30 cm，高25～30 cm。田間小區(qū)采用隨機區(qū)組設(shè)計，每份種質(zhì)3 次重復(fù)，每重復(fù)小區(qū)面積12 m2。所有細香蔥種質(zhì)同時移栽定植，株行距20 cm×15 cm，每穴5 個分蘗，期間統(tǒng)一正常水肥管理，定期觀察記錄田間數(shù)據(jù)并整理。開花期間，于晴天10：00 采集細香蔥花序，將花序放在培養(yǎng)皿內(nèi)收集新鮮花粉，測定花粉活力。

1.2 方法

1.2.1 不同檢測方法對花粉活力測定的比較 采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法[9]：隨機選取AF13、AF14、AF93 少量花粉放在載玻片上，加1～2 滴TTC 溶液，蓋上蓋玻片后將制完的片子放入培養(yǎng)皿內(nèi)，置于35 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，20 min后進行鏡檢觀察花粉染色情況。染成紅色的花粉活力較強，無色為不具有活力的花粉。

表1 香蔥地方種質(zhì)資源及來源

聯(lián)苯胺染色法[14]：隨機選取AF13、AF14、AF93少量花粉放在載玻片上，花粉上滴1 滴混合液（0.20%聯(lián)苯胺溶于50%酒精溶液、0.15%α-萘酚溶于50%酒精溶液、0.25%碳酸鈉溶液為1∶1∶1 混合）和1 滴0.3%過氧化氫溶液，充分混合，經(jīng)過3～4 min后，在顯微鏡下檢查被染色和未染色的花粉粒數(shù)。生活力愈強的花粉染色紅色愈深，不具生活力的花粉則呈黃色和無色。

花粉離體萌發(fā)法[12]：配置培養(yǎng)基（含10%蔗糖、0.1%硼酸、0.1 g·L-1瓊脂），用玻棒將冷卻前（約50 ℃）的培養(yǎng)基滴入凹玻片的凹孔中（1～2 滴），隨機選取AF13、AF14、AF93 少量花粉，將花粉置于培養(yǎng)液中，在25 ℃條件下光照培養(yǎng)4 h，顯微鏡下檢測花粉萌發(fā)情況。

1.2.2 不同香蔥種質(zhì)資源花粉活力的比較 采用篩選出的快速檢測方法，對29 份細香蔥種質(zhì)資源進行花粉活力鑒定。

1.2.3 鏡檢結(jié)果統(tǒng)計方法 以上每份種質(zhì)（處理）設(shè)3 次重復(fù)，每個重復(fù)觀察5 個視野，每個視野不少于100 粒花粉，統(tǒng)計花粉活力?；ǚ刍盍?%=花粉染色或萌發(fā)總數(shù)/觀察花粉總數(shù)×100。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2009 軟件對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，采用SPSS 19.0 以及GraphPad Prism 6 對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同檢測方法對花粉活力測定的比較

采用TTC 染色法、聯(lián)苯胺染色法和花粉離體萌發(fā)法對3 個品種的細香蔥花粉活力進行測定（圖1），結(jié)果顯示同一種質(zhì)花粉的活力（萌發(fā)率）或是平均花粉活力（萌發(fā)率）從高到低依次為聯(lián)苯胺染色法＞TTC 染色法＞花粉離體萌發(fā)法（表2）。采用TTC 染色法和離體萌發(fā)法測定花粉活力的結(jié)果不穩(wěn)定。采用離體萌發(fā)法耗時較長，且萌發(fā)結(jié)果不明顯。采用聯(lián)苯胺染色法操作簡便，耗時較少，反應(yīng)3～4 min 后即可觀察，顯色較好，大部分花粉活力顯示均達到60%以上（圖1）。

表2 不同檢測方法對3 個香蔥種質(zhì)的花粉活力測定結(jié)果

圖1 不同檢測方法對花粉活力測定的比較

2.2 不同細香蔥種質(zhì)的花粉活力比較情況

采用聯(lián)苯胺染色法測定基地中29 個細香蔥種質(zhì)的花粉活力（表3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，29 個細香蔥種質(zhì)中AF14‘四季香蔥’測定的花粉活力最高，為80.20%；其次為AF93‘扶照蔥’78.35%，再次為‘老口蔥’76.41%。測定花粉活力最低的為AF57‘香蔥’16.62%。

3 討 論

3.1 花粉活力測定方法的比較

雖然前人研究大多認為離體萌發(fā)法測定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、結(jié)果真實，但是由于花粉萌發(fā)過程中的培養(yǎng)條件（蔗糖、硼酸及溫度）對花粉萌發(fā)有一定影響，因此需要根據(jù)不同的植物進行培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和溫度等條件的前期摸索，時間消耗相對過長。筆者采用的是高葶韭的離體萌發(fā)法配方，發(fā)現(xiàn)采用該方法的細香蔥花粉萌發(fā)率不高，并且操作起來較繁瑣，結(jié)果與郝瑞娟等[15]相同。相對于離體萌發(fā)法，染色法測定花粉活力具有簡單和快捷的優(yōu)點，但由于受花粉特性影響，不同植物花粉適宜的染色方法不同，如高葶韭的花粉活力適宜聯(lián)苯胺和離體萌發(fā)法[12]、柳樹適宜藍墨水染色法[16]、茶樹花粉適宜離體萌發(fā)法和TTC 染色法[17]。在本試驗中，TTC 法測定的細香蔥花粉活力較低，可能由于花粉外壁太厚或花粉內(nèi)含物中支鏈淀粉含量太少等原因，染色結(jié)果不佳，這與汪妮等[18]結(jié)果相似。聯(lián)苯胺染色法結(jié)果操作簡單，是測定細香蔥花粉活力最適宜的方法。

3.2 花粉活力與花粉萌發(fā)

在試驗之后，筆者進行了種子收獲情況、質(zhì)量的調(diào)查。發(fā)現(xiàn)大部分細香蔥可以收到種子，小部分種質(zhì)自交沒有種子。出現(xiàn)了部分花粉活力較高的細香蔥種質(zhì)未收獲種子，部分活力較低的細香蔥種質(zhì)也可以收到種子，但是收種數(shù)量不多的情況。這可能與花粉受精過程復(fù)雜、花粉活力只是花粉萌發(fā)的必備條件之一有關(guān)?；ǚ勖劝l(fā)除與本身內(nèi)在因素有關(guān)，還受許多外在環(huán)境及條件影響，柱頭可授性、花朵的開放期、柱頭分泌物，以及外界環(huán)境、溫度、營養(yǎng)條件等均能影響授粉成功率。傳粉是種子植物受精的必經(jīng)階段，其過程始于花藥開裂和成熟花粉的散出，攜帶著雄配子或其前體的花粉粒被暴露在干燥條件下，必須在具有活力時到達適宜的接受柱頭。因此，花粉的活力與壽命、柱頭的可授性便成為傳粉生態(tài)學(xué)所必須研究的內(nèi)容。前人研究表明野生蔥屬植物在高溫、多風(fēng)及干燥等氣候特征的荒漠草原上生長時，8 h 后花粉基本失去活力，并且柱頭只在開花后2 d 內(nèi)具有較強可授性，可授性能持續(xù)5 d[11]。下一步可將針對細香蔥柱頭的可授性、細香蔥花粉保存等內(nèi)容繼續(xù)開展香蔥種質(zhì)創(chuàng)制的基礎(chǔ)工作。

表3 不同細香蔥種質(zhì)的花粉活力測定結(jié)果

4 結(jié) 論

在TTC 染色法、聯(lián)苯胺染色法、離體萌發(fā)法中，采用聯(lián)苯胺染色法對細香蔥花粉活力進行測定快速準(zhǔn)確，可作為細香蔥花粉活力快速測定的最佳方法。29 份細香蔥種質(zhì)中AF14 花粉活力最高，其次為AF93 和AF94，種質(zhì)間花粉活力存在顯著差異，可參考用于種質(zhì)配組及創(chuàng)制工作。