張永萍 劉蘭 張艷君

單核細胞在丙型肝炎(Chronic hepatitis C)持續(xù)感染和纖維化的過程中起著重要作用,單核細胞分泌的細胞因子與HCV感染的慢性化、持續(xù)的肝損傷及肝硬化的發(fā)生關系逐漸引起重視。機體T淋巴細胞、B淋巴細胞及NK細胞等免疫細胞在HCV感染后釋放促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-12β和TGF-β及抗炎因子IL-10和IL-4[1-4],為了更清晰了解單核細胞促炎與抗炎細胞因子的分泌,排除外周血中其他單個核細胞釋放細胞因子的干擾,本研究收集和分離患者外周血單核細胞,培養(yǎng)并檢測其促炎因子和抗炎因子的表達,了解HCV相關肝硬化患者單核細胞促炎和抗炎細胞因子表達情況。

臨床資料與方法

一、一般資料

選取新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院2016年1月至2017年5月因慢性丙肝肝硬化入住感染科的35例患者為丙肝組,診斷標準依據(jù)丙型肝炎防治指南(2015年版)[5],納入標準(1)年齡18～60歲，男女不限。(2)HCV抗體陽性，HCV-RNA≥5.0×103IU/mL。(3)經(jīng)肝臟B超或肝臟CT或肝臟核磁檢查明確肝硬化。(4)Child評分A級。常規(guī)健康體檢者18例為對照組。排除標準:(1)HAV、HBV、HDV、HEV和HIV重疊感染。(2)肝癌、酒精性及自身免疫性等其他肝病患者。(3)合并其他嚴重心、腦、腎、肺部疾患的患者。病例資料：丙肝組35例，其中男性19例，女性16例；年齡30～70歲，平均(53.86±12.03)歲。對照組18例，其中男性8例，女性10例；年齡25～70歲，平均(38.72±14.05)歲。兩組年齡對比差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本研究經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,所有研究對象均知情同意。并簽署知情同意書。

就普通的小康家庭來說，其實大體就分為四塊：衣食住行、保險、儲蓄備用、投資創(chuàng)富。目前對中國的居民來說，主要有以下大類資產(chǎn)種類：股票、債券、貨幣、房地產(chǎn)、商品。每類資產(chǎn)又可以細分為很多子范疇，股票是股份有限公司在籌集資本時向出資人發(fā)行的股份憑證，是社會化大生產(chǎn)的產(chǎn)物。股票又可分為大盤股/小盤股；股票在交易市場上作為交易對象，同商品一樣，有自己的市場行情和市場價格。由于股票價格要受到諸如公司經(jīng)營狀況、供求關系、銀行利率、大眾心理等多種因素的影響，其波動有很大的不確定性。正是這種不確定性，有可能使股票投資者遭受損失。價格波動的不確定性越大，投資風險也越大。因此，股票是一種高風險的金融產(chǎn)品。

二、研究方法

(一)HCV-RNA、常規(guī)生化及血常規(guī)指標檢測

1.HCV-RNA的檢測:采用實時RT-PCR法檢測,試劑盒購自Liferiver公司,貨號Z-HR-0008-02EX,嚴格按說明書規(guī)范操作。

其一，管理控制性。該特征主要指的是會計管理、報告管理職能以及企業(yè)對各項規(guī)章制度的監(jiān)督與執(zhí)行。其中，會計管理職能涉及對總賬會計各項事務的記錄、結算以及合并等相關工作。報告管理職能則包括企業(yè)盈利能力報告制定以及預算標準化報告編制等；其二，基礎操作性。該特征主要包含賬單發(fā)票管理、應收與應付賬款管理職能等。其中，賬單發(fā)票管理職能涉及對供需雙方的賬單數(shù)據(jù)質(zhì)量予以檢查與制作，并發(fā)送稅務發(fā)票。應收與應付賬款管理職能則包含數(shù)據(jù)處理、收付款票據(jù)管理以及合規(guī)審核等相關職能。其三，戰(zhàn)略規(guī)劃性。這一特征主要由現(xiàn)金流規(guī)劃、戰(zhàn)略投資規(guī)劃、稅收整體籌劃以及投資預算等構成。

(二)單核細胞的分離及其細胞因子的表達測定

TNF-α:R:GTTGAGGGTGTCTGAAGGAG,F:AG GTCTACTTTGGGATCATTGC;IL-β:R:CGGAGATTC GTAGCTGGATG,F:GGATGACTTGTTCTTTGAAGCTG;IL-12β:R:CCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATT,F:GCAGAATGTCAGGGAGAAGTAG;IL-10:R:ATGCC CCAAGCTGAGAAC,F:GCCTTGCTCTTGTTTTCACAG;IL-4:R:CCTCTGTTCTTCCTGCTAGCA,F:GCCGTTT CAGGAATCGGATCA；TGF-β:R:GCCCTGGACAC CAACTATTGCF:GAAGTTGGCATGGTAGCCCTT。擴增條件:正反引物各0.5 μL,無RNA酶去離8 μL,cDNA 1 μL在RT-PCR儀上95 ℃,2 min；95 ℃,5 s,60 ℃,10 s,40個循環(huán)；熔解60～95 ℃,4 ℃延生。

2.常規(guī)生化及血常規(guī)指標檢測:受試者晨起空腹采靜脈血3 mL并于2 h內(nèi)完成血常規(guī)、生化常規(guī)(ALT、AST、白蛋白、球蛋白、TG和總膽固醇)等指標檢測。采用貝克曼AV5800全自動生化分析儀檢測。

在HCV感染后,IL-10可以通過單核細胞產(chǎn)生[6],通過多靶點參與HCV的清除,首先介入調(diào)節(jié)HCV特異性的 CD8+ T細胞,主要是減少CD8+T細胞數(shù)量和損傷CD8+T細胞的分化[7]。同時,IL-10優(yōu)先靶向TLR4信號通路[8],對來源于慢性丙型肝炎患者的單核細胞通過脂多糖(LPS)-TLR4信號路徑生產(chǎn)更低的 TNF-α和IL-12[8]。IL-10抑制DC和巨噬細胞的功能,另外持續(xù)限制 Th1和Th2的效應反應。來自于巨噬細胞或DC的IL-10通過nTreg產(chǎn)生,這種情況下,使得免疫控制下的病原可處于長期的免疫逃逸和持續(xù)的感染[9]。在本次實驗中丙肝組均為丙肝肝硬化患者,其單核細胞高表達IL-10,使得單核細胞HCV的清除能力下降甚至表現(xiàn)為耐受。因此難以清除HCV,導致HCV持續(xù)復制。也有文獻報道在早期HCV感染的患者血清IL-10的高水平,與HCV感染的慢性化關系密切,且與HCV-RNA載量呈正相關[10]。高水平抗炎因子IL-10也減少促炎因子TNF-α的水平,TNF-α的水平的下降也預示著單核細胞功能的受損[11]。

2.單核細胞mRNA提取及細胞因子轉(zhuǎn)錄水平的測定:首先收集凍存單核細胞RNA、測定RNA濃度、凍存RNA備用。并反轉(zhuǎn)錄cDNA。目的基因及引物序列如下:

本文對生態(tài)視角下，我國村鎮(zhèn)規(guī)劃與發(fā)展的現(xiàn)狀及其存在的問題進行了簡要的分析，并提出了幾點建議。增強我國村鎮(zhèn)的生態(tài)性、傳統(tǒng)性、特色性是我國存儲規(guī)劃發(fā)展的主要方向，既要注重經(jīng)濟發(fā)展也要實現(xiàn)環(huán)境保護，建設具有現(xiàn)代化特色的社會主義村鎮(zhèn)，形成獨有的發(fā)展特色。

實驗組總清掃淋巴數(shù)量較對照組多，兩組對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組Ⅰ～Ⅱ期清掃淋巴結數(shù)與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；實驗組Ⅲ期清掃淋巴結數(shù)、淋巴結陽性數(shù)量較對照組多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

三、統(tǒng)計學分析

在控制年齡、性別、甘油三酯及總膽固醇等因素后,HCV-RNA載量與TNF-α、IL-1β、IL-12β、IL-10、IL-4及TGF-β行偏相關分析,HCV-RNA載量與TNF-α呈正相關(r=0.452,P=0.027);與IL-12β呈正相關(r=0.442,P=0.031),與IL-10呈負相關(r=-0.431,P=0.035),與TGF-β呈負相關(r=0.437,P=0.033),與IL-1β、IL-4不相關。見表3。

結 果

一、兩組基本臨床資料比較

ALT、AST、甘油三脂、總膽固醇、白細胞和血小板計數(shù)比較,其中ALT、AST、TG均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),白蛋白、白細胞和血小板兩組比較均低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組基本臨床資料比較

二、兩組單核細胞細胞因子表達情況

TNF-ɑ、IL-1β、IL-12β均高于對照組,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),IL-4低于對照組,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),IL-10、TGF-β高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

忽然有人對周暄說：“我們朝敏原來在單位里特別受歡迎，瞧她現(xiàn)在比以前還要年輕，周暄你可要好好珍惜啊，不然小心被別人拐跑啦！”

表2 兩組細胞因子表達比較

三、HCV-RNA載量與細胞因子的相關分析

表3 HCV-RNA載量與細胞因子的偏相關分析

四、丙肝組中細胞因子間相關分析

在控制年齡、性別、甘油三酯及總膽固醇等因素后,TNF-α與IL-1β、IL-12β、IL-10、IL-4及TGF-β間偏相關分析:TNF-α與IL-1β呈正相關(r=0.530,P=0.008),與IL-12β呈正相關(r=0.760,P=0.000),與IL-10呈負相關(r=-0.730,P=0.000),與TGF-β呈負相關(r=-0.740,P=0.000),IL-1β與IL-12β呈正相關(r=0.450,P=0.030),IL-10與TGF-β呈正相關(r=-0.999,P=0.000)。見表4。

2.2 東、西坡不同坡位捕食線蟲真菌的多樣性差異將高黎貢山研究區(qū)域分為5個坡位，分別為下坡位（1 400～1 800 m）、中下坡位（1 800～2 200 m）、中坡位（2 200～2 600 m）、中上坡位（2 600～3 000 m）、上坡位（3 000～3 400 m）。對高黎貢山東、西兩坡相同坡位的捕食線蟲真菌物種豐富度和檢出率進行比較。結果表明東、西坡捕食線蟲真菌的物種豐富度和檢出率隨著坡位的升高均呈先上升后下降的趨勢，其中東坡各指數(shù)均在中下坡位處呈現(xiàn)最大值，西坡物種豐富度在中下坡位處呈現(xiàn)最大值，檢出率在中坡位處呈現(xiàn)最大值。見圖2～3。

表4 丙肝組中細胞因子間相關分析

討 論

本組實驗檢測了HCV感染的肝硬化患者單核細胞促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-12β及抗炎因子IL-10、IL-4、TGF-β mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,結果顯示抗炎因子IL-10和TGF-β表達明顯升高。

1.外周血單核細胞分離、培養(yǎng)及DNA的提取:人外周血單核細胞提取采用天津灝洋公司提供的人外周血單核細胞分離液試劑盒,產(chǎn)品編號:TBD2011H.Size:2×200 mL/kit。無菌,無支原體,內(nèi)毒素<0.05 EU?？崭钩槿∈茉囌哐? mL,試驗方法嚴格按說明書,以0.5 mL單核細胞完全培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號:HCTBD2011)重懸細胞,差異貼壁法純化、收集細胞,加入0.5 mL的RNA保護液,存-80℃?zhèn)溆谩?/p>

在本實驗中肝硬化患者單核細胞還高表達TGF-β,TGF-β通過兩個方面影響疾病的進展。首先TGF-β是最重要的肝星狀細胞的激活因子[12],誘導纖維化基因的轉(zhuǎn)錄及上調(diào)膠原蛋白的表達[13-14],促進肝纖維化和肝硬化的形成。另外，TGF-β還可通過影響免疫細胞的分化、發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和誘導免疫耐受來調(diào)節(jié)免疫反應。TGF-β能夠促進Treg 細胞發(fā)育和誘導介導多種慢性炎癥反應的Th17細胞的產(chǎn)生[15]。

單核細胞IL-10和TGF-β的高表達,抑制了促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-12β的表達,導致了單核細胞清除HCV的能力,同時激活HSC,促進了肝纖維化的持續(xù)進展[16]。

本實驗的相關分析中,單核細胞TNF-α、IL-12β與HCV-RNA的載量正相關,IL-10和TGF-β與HCV-RNA的載量呈負相關,該結果與多數(shù)文獻報道相符。在病例組中, HCV-RNA高載的患者未高水平表達TNF-α、IL-12β,可能高載的HCV-RNA未刺激單核細胞高表達促炎因子而高表達抗炎細胞因子,進一步說明，持續(xù)HCV感染可能導致單核細胞免疫功能的損害,導致持續(xù)的HCV感染。也可能體內(nèi)的抗炎機制為防止過度的炎性反應損害機體,高表達并分泌抗炎因子如IL-10、TGF-β,減少組織的損傷并促進組織的修復。也有文獻報道HCV-RNA的高復制促進了IL-10的產(chǎn)生,其機制尚不明確,可能由于HCV特異性的效應T細胞被抑制的結果[10]。也可能與患者處于肝硬化期,各種影響因素如ALT、血脂等較多有關,其次可能納入的樣本量偏少,還需要更大的樣本量進一步證實。

此次實驗中患者HCV-RNA的載量與單核細胞的促炎因子呈正相關,與抑炎因子的表達呈負相關。而僅有抑炎因子的高表達差異有統(tǒng)計學意義?？赡苡捎诟斡不A段單核細胞清除HCV的能力下降,其處于持續(xù)修復受損的肝細胞,因此高表達IL-10和TGF-β。

另外此次實驗中IL-4在兩組受試者中沒有差異,其與HCV-RNA載量并未表現(xiàn)出相關性,與促炎及抑因子也不相關。IL-4在本實驗中的“沉默”表現(xiàn),可能與的其多效性、復雜性、雙向性[17-24]的生物學特性有關,單核細胞IL-4的表達是否與丙肝肝硬化的發(fā)生發(fā)展目前相關研究較少。

丙型肝炎肝硬化患者單核細胞IL-10和TGF-β的高表達,與HCV-RNA呈負相關,同時與細胞因子IL-10和TGF-β呈現(xiàn)高度正相關,IL-10和TGF-β可能與丙型肝炎肝硬化發(fā)生發(fā)展密切相關,也可能丙肝肝硬化患者單核細胞的免疫耐受是肝硬化進展的主要動力。對其機制的進一步探索可能為肝硬化的逆轉(zhuǎn)提供線索。