劉東旭,閆 滿,尹柏雙,苗麗娟,李國江

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，吉林 吉林 132101；2.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132101)

細(xì)環(huán)病毒(Transfusion transmitted virus或Torque teno virus,TTV)是一種無囊膜的閉合環(huán)狀DNA病毒，屬于指環(huán)病毒科細(xì)項(xiàng)環(huán)病毒屬。豬細(xì)環(huán)病毒(Torque teno sus virus，TTSuVs)廣泛的流行于多個(gè)國家?，F(xiàn)已證明，該病毒與仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的發(fā)生有關(guān)[1]。這使得關(guān)于TTSuVs在豬群中的感染情況及潛在的致病性成為研究的熱點(diǎn)。而目前對TTSuVs的了解還非常有限，ELISA法和PCR法是目前檢測該病毒的主要方法[2]。但由于TTSuVs的基因變異性高，且不同亞型之間存在交叉的抗體，使得這些方法敏感性低、精確定量差及假陽性率高[3]。國內(nèi)外學(xué)者也建立了TTSuV2和PCV2單項(xiàng)熒光定量 PCR 檢測方法，可以判定初始模板量，具有敏感度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，而且用時(shí)短，也可自動定量分析的優(yōu)點(diǎn)[4]。但目前針對TTSuV2和PCV2感染的雙重TaqMan熒光定量PCR檢測的方法尚未見報(bào)道。

為此，本試驗(yàn)建立一種能快速檢測TTSuV2，且可同時(shí)分析TTSuV2和PCV2的載量與相關(guān)疾病關(guān)系的檢測方法，為進(jìn)一步探究TTSuV2在豬群中的感染情況及其潛在致病性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 豬瘟病毒(Swine fever virus，SFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、I型豬細(xì)環(huán)病毒(Torque teno sus viru 1，TTSuV1)、I型豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus 1，PCV1)病料及鑒定病料由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院豬生態(tài)養(yǎng)殖及疫病防控中心保存。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，均購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；病毒基因組提取試劑盒、PCR酶、TaqMan酶、DNA Marker、pMD18-T Simple Vector，均購自TaKaRa公司。

1.1.3 引物和探針 根據(jù)GenBank中公布的PCV2(PCV2a：AY754017；PCV2b：HQ202978；PCV2c：AF109398；PCV2d：AY484407)和TTSuV2(TTSuV2a：MG799366；TTSuV2b：GU188046；TTSuV2c：JF694118)序列保守區(qū)，分別設(shè)計(jì)引物及探針(見表1)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 擴(kuò)增引物及探針Table 1 Primers and probes

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 按照病毒基因組提取試劑盒說明書提取PCV2和TTSuV2 基因組，應(yīng)用所設(shè)計(jì)的引物分別進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。其中PCV2擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性2 min，57 ℃退火55 s，72 ℃延伸3 min，共31個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min。TTSuV2擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性2 min，56 ℃退火55 s，72 ℃延伸3 min，共31個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min?；厥誔CR產(chǎn)物與載體連接進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落進(jìn)行鑒定及測序。并用分光光度計(jì)測量DNA濃度和純度。

1.2.2 雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化 按照矩陣法對雙重?zé)晒舛縋CR的退火溫度和引物及探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系及條件。雙重?zé)晒舛縋CR最佳反應(yīng)體系為：PremixExTaq(2×) 12.5 μL，P1 1.0 μmol/L，P2 1.0 μmol/L，T1 1.0 μmol/L，T2 1.0 μmol/L，P 1.0 μmol/L，T 1.0 μmol/L，DNA 模板3 μL，水補(bǔ)至20 μL。優(yōu)化后反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，55.8 ℃退火30 s，35個(gè)循環(huán)。

1.2.3 雙重?zé)晒舛縋CR不交叉反應(yīng) 將反應(yīng)分為2組，第1組以PCV2為模板；第2組以TTSuV2為模板，兩組體系中同時(shí)含有擴(kuò)增PCV2、TTSuV2的引物和探針。在已優(yōu)化好的雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.4 雙重?zé)晒舛縋CR特異性試驗(yàn) 使用本試驗(yàn)所優(yōu)化好的雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件及體系，對PEDV、PRRSV、PRV、SFV、PCV1、TTSuV1進(jìn)行檢測，并以2種病毒標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為陽性對照，以確定該方法的特異性。

1.2.5 雙重?zé)晒舛縋CR敏感性試驗(yàn) 將2種病毒標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別調(diào)整濃度至1×106拷貝/μL，進(jìn)行連續(xù)的10倍梯度稀釋，確定所建立檢測方法的靈敏性。

1.2.6 雙重?zé)晒舛縋CR重復(fù)性試驗(yàn) 對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行批內(nèi)和批間實(shí)時(shí)熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn)，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，對所得的Ct值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)進(jìn)行分析。

1.2.7 雙重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行連續(xù)5個(gè)梯度的100倍倍比稀釋，分別用優(yōu)化后的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 臨床樣品的檢測 以本試驗(yàn)建立的雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法與普通PCR檢測方法同步對收集的300份臨床樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以PCV2、TTSuV2特異性引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增結(jié)果與克隆載體連接，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選及序列測定(見圖1)。測序結(jié)果顯示，本試驗(yàn)建立的PCV2重組質(zhì)粒與PCV2(PCV2a：AY754017；PCV2b：HQ202978；PCV2c：AF109398；PCV2d：AY484407)同源性為95%～100%，探針P與各亞型的PCV2同源性為100%。PCV2重組質(zhì)粒與TTSuV2(TTSuV2a：MG799366；TTSuV2b：GU188046；TTSuV2c：JF694118)同源性為95.9%～7.3%，探針T與各亞型的TTSuV2同源性為100%。

圖1 PCV2 與 TTSuV2重組質(zhì)粒PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of PCV2 and TTSuV2 recombinant plasmidsM:Marker DL-2 000;1:TTSuV2;2:PCV2

2.2 雙重?zé)晒舛縋CR不交叉反應(yīng) 分別以PCV2和TTSuV2重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR。結(jié)果顯示，PCV2重組質(zhì)粒在含有TTSuV2引物探針的體系中反應(yīng)，沒有任何擴(kuò)增曲線；TTSuV2重組質(zhì)粒在含有PCV2引物探針的體系中反應(yīng)，沒有任何擴(kuò)增曲線。說明這2套引物探針特異性較好，沒有交叉反應(yīng)。

2.3 雙重?zé)晒舛縋CR特異性試驗(yàn) 分別以PEDV、PRRSV、PRV、SFV、PCV1、TTSuV1基因組為模板，對雙重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行特異性鑒定，結(jié)果如圖2、3所示。結(jié)果表明,本試驗(yàn)所建立的雙重?zé)晒舛縋CR對PCV2及TTSuV2有很好的特異性，與其他豬病毒無交叉反應(yīng)。

圖2 PCV2的特異性擴(kuò)增曲線Fig.2 Specific amplification curve of PCV2

圖3 TTSuV2的特異性擴(kuò)增曲線Fig.3 Specific amplification curve of TTSuV2

2.4 雙重?zé)晒舛縋CR敏感性試驗(yàn) 以連續(xù)稀釋的2種病毒標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板(1×106～1×101拷貝/μL)，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果如圖4、5所示。結(jié)果表明，建立的雙重?zé)晒舛縋CR對2種病毒的最低檢測拷貝數(shù)均為1×102拷貝/μL。

圖4 PCV2的敏感度擴(kuò)增曲線Fig.4 Sensitivity amplification curve of PCV21:1×106拷貝/μL;2:1×105拷貝/μL;3:1×104拷貝/μL;4:1×103拷貝/μL;5:1×102拷貝/μL1:1×106copies/μL;2:1×105 copies/μL3:1×104 copies/μL;4:1×103 copies/μL5:1×102 copies/μL

圖5 TTSuV2的敏感度擴(kuò)增曲線Fig.5 Sensitivity amplification curve of TTSuV21:1×106拷貝/μL;2:1×105拷貝/μL;3:1×104拷貝/μL;4:1×103拷貝/μL;5:1×102拷貝/μL1:1×106 copies/μL;2:1×105 copies/μL;3:1×104 copies/μL;4:1×103 copies/μL;5:1×102 copies/μL

2.5 雙重?zé)晒舛縋CR重復(fù)性試驗(yàn) 對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行批內(nèi)和批間的重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。本試驗(yàn)所建立的雙重?zé)晒舛縋CR批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2%，具有良好的重復(fù)性。

表2 雙重?zé)晒舛縋CR重復(fù)性試驗(yàn)Table 2 Repetitive and stability verification of duplex real-time PCR

2.6 雙重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以1×1011～1×103拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，繪制雙重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖6所示，PCV2和TTSuV2標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999 6、0.998 5，表明所建立的雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法具有良好的線性關(guān)系。

圖6 雙重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of duplex real-time PCR

2.7 PCV2、TTSuV2雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的初步應(yīng)用 以本試驗(yàn)建立的TTSuV2與PCV2雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法與普通PCR檢測方法，同時(shí)對收集的300份臨床樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果如表3所示，在雙重?zé)晒舛縋CR中，PCV2單獨(dú)感染檢出率為36.0%，TTSuV2單獨(dú)感染檢出率為60.0%，2種病毒混合感染檢出率為14.8%。而普通PCR對PCV2單獨(dú)感染檢出率僅為11.3%，TTSuV2單獨(dú)感染檢出率僅為37.3%，2種病毒混合感染檢出率僅為3.7%。

表3 雙重?zé)晒舛縋CR和普通PCR檢測臨床樣品的結(jié)果Table 3 Results of clinical samples detected by duplex real-time PCR and common PCR

3 討論

臨床研究表明，豬群單一感染TTSuV2或PCV2均不會引起明顯的臨床癥狀，但豬群混合感染2種病原體時(shí)，會促進(jìn)PMWS的發(fā)生。這使得關(guān)于TTSuVs在豬群中的感染情況及潛在的致病性成為研究的熱點(diǎn)[5]。且TTSuV2的載量與疾病嚴(yán)重程度存在相關(guān)性，故對TTSuV2和PCV2進(jìn)行定量檢測具有較高的臨床價(jià)值。

鄭敏等建立的PCV2和PRV雙重TaqMan熒光定量PCR方法，對PCV2的檢測靈敏度是4.5×102拷貝/μL；Lester J.Pérez 等建立的PCV2、PPV、PRV、TTSuV1、TTSuV2多重SYBR Green I 熒光定量PCR方法，對PCV2和TTSuV2的檢測靈敏度是每個(gè)反應(yīng)體系3.65×103～5.05×103拷貝[6]。而本試驗(yàn)建立的方法能檢測到的PCV2和TTSuV2基因組最低濃度均為1×102拷貝/μL，比常規(guī)PCR和基于SYBR Green I的多重?zé)晒舛縋CR更加靈敏。影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的靈敏度涉及許多因素，如樣品來源的復(fù)雜程度，引物和探針特異性，體系及擴(kuò)增條件等，其中引物和探針的設(shè)計(jì)是最重要的關(guān)鍵點(diǎn)。引物的長度，GC含量，退火溫度等應(yīng)盡量一致且避免交叉互補(bǔ)，避免探針和引物間的相互消耗和非特異性擴(kuò)增[7]。為此本試驗(yàn)分別設(shè)計(jì)的PCV2、TTSuV2雙重?zé)晒舛縋CR引物和探針，通過DNASTAR軟件分析，確定2個(gè)探針，4個(gè)引物相互之間不會形成引物二聚體，且探針的退火溫度比引物高出10 ℃左右，為構(gòu)建此方法的準(zhǔn)確性在理論上奠定了基礎(chǔ)。且在引物和探針設(shè)計(jì)上，本試驗(yàn)同時(shí)分析病毒的多種亞型序列，確保能夠檢測PCV2及TTSuV2的所有亞型，為臨床診斷提供了可靠的檢測工具。

目前國內(nèi)未見有關(guān)于運(yùn)用TaqMan雙重探針技術(shù)同時(shí)檢測PCV2及TTSuV2的報(bào)道，而本試驗(yàn)建立的TTSuV2與PCV2雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法，具有良好的特異性和敏感性，在多種病原體的干擾下，可準(zhǔn)確的檢測出2種病毒的存在。且在同一體系中，該方法對2種病毒的熒光信號檢測不存在相互干擾的現(xiàn)象。應(yīng)用本試驗(yàn)建立的方法對300份臨床樣品進(jìn)行檢測，其檢出率明顯的高于普通PCR方法。但由于實(shí)驗(yàn)室仍在進(jìn)行PMWS病料的收集，不能對TTSuV2與PCV2的載量與相關(guān)疾病的關(guān)系進(jìn)行完整的分析，在后續(xù)試驗(yàn)中，將加大特定病料的收集，為進(jìn)一步認(rèn)識TTSuV2在豬群中的感染情況及其潛在致病性提供科學(xué)依據(jù)。