楊宇馳，楊馨悅，周秀娟，薛桂新*

（1.延邊大學 農學院，吉林 延吉 133000；2.吉林省產品質量監(jiān)督檢驗院，吉林 長春 130000）

柑橘（Citrus reticulata）常溫貯藏期較短[1]，季節(jié)性收獲時易造成大量堆積腐爛現象，影響果農經濟收入以及當地的經濟發(fā)展[2]。柑橘含水量較高，適合加工成飲料[3]、果酒和果醋等液體產品。柑橘加工成果酒產品，檸檬苦素等會導致果酒味苦。若先加工成果酒再加工成果醋，在醋酸發(fā)酵過程中檸檬苦素等會逐漸減少或消失，果醋品質較好[4-5]。因此，柑橘加工成果醋更適合，既能增加農民收入，緩解滯銷，降低損失，還能增加果醋新品種，提高附加值，這對提高柑橘綜合利用，推動果醋產業(yè)化發(fā)展都具有重要意義。

果醋液態(tài)發(fā)酵法分一次發(fā)酵法和二次發(fā)酵法。一次發(fā)酵法是用新鮮的果汁與食用酒精相融合發(fā)酵制成果醋，而二次發(fā)酵法是果汁先釀成果酒然后再發(fā)酵成果醋[6]。一次發(fā)酵法與二次發(fā)酵發(fā)法相比制作工藝少了果酒釀造過程，節(jié)省了一定的成本，果醋品質也更柔和。近年來，從果醋品種看，國內外學者已對葡萄[7]、蘋果[8-9]、桑葚[10]、火龍果[11-12]、山棗果醋[13-14]及其果醋飲料進行了研究，但對柑橘果醋研究得較少[15-16]。從研究內容看，主要集中于果醋發(fā)酵條件[17]、發(fā)酵基質[18-19]及醋酸菌篩選，且果醋的發(fā)酵方式多偏向于二次發(fā)酵，對果醋的一次發(fā)酵法研究得較少。

本研究對一次發(fā)酵法制備柑橘果醋的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并對一次發(fā)酵和二次發(fā)酵柑橘果醋的品質特性進行對比，為一次發(fā)酵法柑橘果醋的釀造提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘：市售；柑橘果酒（酒精度為12%vol，總糖含量1.0 g/100 mL，pH值為3.4）：實驗室自釀；滬釀1.01醋酸菌：上海釀造科學研究所；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：意大利AEB公司；白砂糖（食品級）：廣東大華糖業(yè)有限公司；95%食用酒精：牡丹江白酒廠；氫氧化鈉、酚酞、葡萄糖（均為分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司。

醋酸菌活化培養(yǎng)基[20]：酵母浸膏1 g、葡萄糖0.1 g、食用酒精4 g、蒸餾水100 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

WY-055型手持糖度儀：長春市第四光學儀器廠；SW-CJ型凈化工作臺：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；CM-5型色差儀：北京柯尼卡美能達投資有限公司；UV1101型紫外分光光度計：上海新茂儀器有限公司；PEN3型電子鼻儀器：德國AIRSENSE公司；SA204B型味覺傳感系統(tǒng)：日本Insent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 兩種發(fā)酵方式制備柑橘果醋發(fā)酵工藝及操作要點

（1）柑橘果醋二次發(fā)酵法發(fā)酵工藝

操作要點：

柑橘：選擇無霉爛、成熟適度的果實。

去皮、榨汁、過濾：柑橘去皮后將果肉榨汁，待榨汁完全，用120目的濾布過濾。

調糖：在柑橘果汁中添加白砂糖，調整糖度為20°Bx。

活化酵母菌：35～38 ℃無菌蒸餾水中加入10%干酵母和0.2%白砂糖，充分攪拌，確保酵母完全溶解，蓋上保鮮膜在35～38 ℃條件下水浴活化20～30 min。

酒精發(fā)酵：在無菌條件下，柑橘果汁中加入0.02%活化后的酵母，然后室溫（20～24 ℃）條件下密封發(fā)酵至酒精度為12%vol。

醋母培養(yǎng)：無菌環(huán)境中將醋酸菌接入醋酸菌活化培養(yǎng)基，在30℃條件下進行恒溫培養(yǎng)至醋酸菌菌落數＞108CFU/mL。

醋酸發(fā)酵：按10%（V/V）的接種量將醋母接種至酒精度為6%vol的柑橘果酒中，32 ℃條件下進行發(fā)酵，每隔12 h取樣進行酸堿滴定，兩次測定醋酸含量不再增加時結束發(fā)酵。

柑橘果醋殺菌：70 ℃條件下殺菌30 min，常溫下貯存。

貯存：在無菌的條件下進行灌裝貯存。

（2）柑橘果醋一次發(fā)酵法發(fā)酵工藝

操作要點：

柑橘果汁殺菌：90 ℃條件下恒溫殺菌30 min。

醋酸發(fā)酵：按10%（V/V）的接種量將醋母接種至初始酒精度為6%vol、柑橘果汁含量為50%（蒸餾水稀釋柑橘原果汁至50%）的發(fā)酵基質中，32 ℃條件下恒溫發(fā)酵。每隔12 h取樣進行酸堿滴定，兩次測定醋酸含量不再增加時結束發(fā)酵。

其他操作要點同二次發(fā)酵工藝。

1.3.2 柑橘果醋一次發(fā)酵法發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

采用單因素輪換法依次考察初始酒精度（4%vol、5%vol、6%vol、7%vol）、柑橘果汁含量（25%、50%、75%）及發(fā)酵溫度（30 ℃、32 ℃、34 ℃）3個因素對柑橘果醋中總酸含量及酒精轉化率的影響。酒精轉化率計算公式[21]如下：

式中：W1為柑橘果醋發(fā)酵過程中最高總酸含量，%；W2為柑橘果酒中的酒精含量，%；1.304為轉換系數。

（2）正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以總酸含量（Y1）及酒精轉化率（Y2）為評價指標，選擇酒精度（A）、柑橘果汁含量（B）、發(fā)酵溫度（C）進行3因素3水平的正交試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 柑橘果醋一次發(fā)酵法發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for Citrus fruit vinegar fermentation process optimization by primary fermentation method

1.3.3 一次發(fā)酵和二次發(fā)酵柑橘果醋品質特性的比較

（1）總酸含量的比較

采用最優(yōu)一次發(fā)酵法和二次發(fā)酵法制備柑橘果醋，發(fā)酵過程中每隔12 h取樣測定總酸含量，對兩種發(fā)酵工藝柑橘果醋中總酸含量的變化進行比較。

（2）感官特性的比較

以柑橘果汁為參比，參照SCHREYER S K等[22]的方法測定其L*值（明亮度）、a*值（紅色度）、b*值（黃色度）；參照李明澤等[23]的方法測定其透光率；參考董畫等[24]的方法進行電子鼻嗅覺成分分析；參考李騰宇[25]的方法進行電子舌味覺成分的分析。

1.3.4 數據分析

采用Excel 2013和SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數據和繪圖。

2 結果與分析

2.1 柑橘果醋一次發(fā)酵法發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 酒精度對柑橘果醋中總酸含量的影響

酒精度對柑橘果醋中總酸含量的影響見圖1。

圖1 酒精度對一次發(fā)酵法柑橘果醋中總酸含量的影響Fig.1 Effect of alcohol content on total acid contents in Citrus fruit vinegar prepared by primary fermentation method

由圖1可知，發(fā)酵基質中酒精度不同，發(fā)酵啟動時間和結束時間、總酸含量均不同。隨著酒精度的增加，發(fā)酵啟動時間和結束時間延遲，這可能由于較高酒精度對醋酸菌活性具有抑制作用[26]。隨著酒精度的增加，最高總酸含量呈增加的趨勢，這是因為酒精是醋酸發(fā)酵的底物，在一定范圍內底物充足，醋酸含量高。當酒精度為4%vol、5%vol、6%vol、7%vol時，最高總酸含量分別為3.98%、4.98%、5.73%、6.07%，且均具有顯著性差異（P＜0.05），酒精轉化率分別為95.30%、95.15%、91.07%、83.22%?；诳偹岷亢途凭D化率兩方面考慮，確定最優(yōu)的酒精度為6%vol。

2.1.2 柑橘果汁含量對柑橘果醋中總酸含量的影響

柑橘果汁含量對柑橘果醋中總酸含量的影響見圖2。

圖2 柑橘汁含量對一次發(fā)酵法柑橘果醋中總酸含量的影響Fig.2 Effect of Citrus juice content on total acid contents in Citrus fruit vinegar prepared byprimary fermentation method

由圖2可知，當柑橘果汁含量為25%時，發(fā)酵結束時柑橘果醋中總酸含量顯著低于柑橘果汁含量為50%和75%的柑橘果醋（P＜0.05），而柑橘果汁含量為50%和75%時，柑橘果醋中總酸含量無顯著差異（P＞0.05），說明發(fā)酵基質中柑橘果汁含量增高到一定范圍對柑橘果醋總酸含量影響不大。柑橘果汁含量為25%、50%、75%時，柑橘果醋中酒精轉化率分別為90.23%、94.45%、94.51%，50%和75%的酒精轉化率無顯著性差異（P＞0.05），但均與果汁含量25%的酒精轉化率存在顯著性差異（P＜0.05）。由此可知，確定最優(yōu)的柑橘果汁含量為50%。

2.1.3 發(fā)酵溫度對柑橘果醋中總酸含量的影響

發(fā)酵溫度對柑橘果醋中總酸含量的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對一次發(fā)酵法柑橘果醋總酸含量變化Fig.3 Effect of fermentation temperature on total acid contents of Citrus fruit vinegar prepared by primary fermentation method

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，總酸含量無顯著差異（P＞0.05），發(fā)酵溫度為30 ℃、32 ℃、34 ℃時，柑橘果醋中酒精轉化率分別為95%、93.9%、92.58%，也無顯著差異（P＞0.05），但發(fā)酵結束時間有差異，32 ℃時發(fā)酵時間最短，30 ℃時發(fā)酵時間最長。由此可知，確定最優(yōu)發(fā)酵溫度為32 ℃。

2.2 柑橘果醋一次發(fā)酵法發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以總酸含量（Y1）及酒精轉化率（Y2）為評價指標，其中總酸含量為主要評價指標，選擇酒精度（A）、柑橘果汁含量（B）、發(fā)酵溫度（C）進行3因素3水平的正交試驗，試驗設計與結果見表2，以總酸含量為評價指標正交試驗的方差分析見表3。

由表2可知，9號試驗組柑橘果醋總酸含量最高為6.6%，柑橘果醋的總酸含量的最佳優(yōu)化組合為A3B3C2，即酒精度為7%vol、柑橘果汁含量為75%、發(fā)酵溫度為32 ℃，與極差分析結果一致。但是，總酸含量＞6.0%的試驗號為5、7、9號，酒精轉化率＞96%的試驗號為1、3、4、5號，從總酸含量和轉化率考慮，確定5號試驗組即A2B2C3為優(yōu)化組合，即酒精度6%vol、柑橘果汁含量為50%、發(fā)酵溫度34 ℃，在此最優(yōu)條件下，柑橘果醋中總酸含量為6.0%，酒精轉化率為96.31%。

表2 柑橘果醋一次發(fā)酵法發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for Citrus fruit vinegar fermentation process optimization by primary fermentation method

表3 以總酸含量為評價指標的正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results using total acid content as evaluation index

由表3可知，3個因素對一次發(fā)酵法制備的柑橘果醋的總酸含量影響均為極顯著（P＜0.01），其中酒精度影響最大，其次是發(fā)酵溫度，最后是柑橘果汁含量，這與表2極差分析結果一致。

2.3 兩種發(fā)酵方式柑橘果醋品質特性比較

2.3.1 兩種發(fā)酵方式柑橘果醋發(fā)酵過程中總酸含量變化的比較

兩種發(fā)酵方式制備的柑橘果醋發(fā)酵過程中總酸含量的變化見圖4。

由圖4可知，一次發(fā)酵法和二次發(fā)酵法對柑橘果醋最高總酸含量無顯著影響（P＞0.05），但對發(fā)酵啟動時間和整個發(fā)酵時間有影響，一次發(fā)酵法的啟動時間比二次發(fā)酵法延遲了48 h、整個發(fā)酵時間延遲了24 h，這是因為一次發(fā)酵法是酒精直接加入果汁中，酒精和果汁需要一段融合適應過程[23]。一次發(fā)酵法發(fā)酵一旦啟動，總酸增加很快，達到最高值后下降趨勢也較快，出現醋酸過氧化現象比二次發(fā)酵法快，其結束時間需要人為及時控制。

圖4 兩種發(fā)酵方式柑橘果醋總酸含量變化Fig.4 Changes of total acid contents of Citrus fruit vinegar prepared by two fermentation methods

2.3.2 兩種發(fā)酵方式柑橘果醋色度和透光率的比較

以柑橘果汁為參比，兩種發(fā)酵方式制備的柑橘果醋的色度及透光率見表4。

表4 兩種發(fā)酵方式柑橘果醋、果汁的L＊值、a＊值、b＊值和透光率Table 4 L＊, a＊, b＊ value and light transmittance of Citrus fruit vinegar prepared by two fermentation methods and juice

由表4可知，一次發(fā)酵法和二次發(fā)酵法制備的柑橘果醋的L*值、a*值、b*值和透光率均存在顯著差異（P＜0.05），L*值及透光率均顯著高于柑橘果汁（P＜0.05），a*值、b*值均顯著低于柑橘果汁（P＜0.05）。以柑橘果汁為參比，一次發(fā)酵法制備的柑橘果醋的黃色度（b*值）和透光率與柑橘果汁更相近。

2.3.3 兩種發(fā)酵方式柑橘果醋嗅覺成分的比較

柑橘果汁、兩種發(fā)酵方式柑橘果醋的電子鼻主成分分析（principal component analysis，PCA）結果見圖5。

圖5 柑橘果汁及兩種發(fā)酵方式制備的柑橘果醋的電子鼻主成分分析結果Fig.5 Principal component analysis results of Citrus juice and Citrus fruit vinegar prepared by two fermentation methods using electronic nose

由圖5可知，PC1和PC2累計方差貢獻率為99.69%，保留了幾乎所有的原始信息。一次發(fā)酵法和二次發(fā)酵法制備的柑橘果醋、柑橘果汁樣品在PC1軸距離較遠，能很好區(qū)分開，在PC2軸距離較近，差異不大，可見樣品嗅覺成分有差異，并且差異主要體現在第一主成分上。由圖5亦可知，一次發(fā)酵法制備的柑橘果醋在PC1軸與果汁的距離較近，說明一次發(fā)酵法制備的柑橘果醋比二次發(fā)酵法果醋更接近于柑橘果汁的氣味。

2.3.4 兩種發(fā)酵方式柑橘果醋味覺成分的比較

電子舌有五個傳感器，可檢測出咸味、酸味、苦味、鮮味、澀味五種基本味覺感官指標及鮮味（豐富度）、苦味（回味-A）、澀味（回味-B）三種回味。兩種發(fā)酵方式柑橘果醋、柑橘果汁味覺分析的雷達圖見圖6。

圖6 柑橘果汁及兩種發(fā)酵方式制備的柑橘果醋的味覺雷達圖Fig.6 Tasteradar chart of Citrus juice and Citrus fruit vinegar prepared by two fermentation methods

由圖6可知，一次發(fā)酵法、二次發(fā)酵法制備的柑橘果醋與柑橘果汁相比，苦味、澀味、咸味、苦味（回味-A）、澀味（回味-B）5個味覺指標幾乎都相同，只有酸味、鮮味、豐富度三者之間存在差異。二次發(fā)酵法制備的柑橘果醋酸味遠大于一次發(fā)酵法制備的柑橘果醋和柑橘果汁；一次發(fā)酵法制備的柑橘果醋鮮味、豐富度均大于二次發(fā)酵法制備的柑橘果醋。即一次發(fā)酵法制備的柑橘果醋刺激性沒二次發(fā)酵法果醋那么強烈，味道更接近于柑橘果汁。

3 結論

一次發(fā)酵法制備柑橘果醋的最優(yōu)發(fā)酵條件為酒精度6%vol，柑橘果汁含量50%，發(fā)酵溫度34 ℃，在此優(yōu)化條件下，總酸含量為6.00%，酒精轉化率為96.31%，比優(yōu)化前分別提高0.27%、5.24%。一次發(fā)酵法制備的柑橘果醋與二次發(fā)酵法果醋相比，最高總酸含量無明顯差異（P＞0.05），但啟動時間延遲了48 h，整個發(fā)酵時間延遲了24 h。一次發(fā)酵法制備的柑橘果醋黃色度、透光率、嗅覺成分和味覺中的鮮味及豐富度與柑橘果汁更相近。