潘項捷，張水鋒，盛華棟，焦玉芬，施元旭，馮婷婷

(浙江方圓檢測集團股份有限公司，浙江 杭州 310018)

季銨鹽化合物(Quaternary ammonium compounds，QACs)是一類銨離子中的4個氫原子均被烴基取代而生成的化合物，其結構和性質根據(jù)與氮原子相連取代基性質的不同而不同[1]，具有廣譜抗菌活性，被作為消毒劑和清潔劑廣泛應用于醫(yī)藥衛(wèi)生和食品工業(yè)領域[2-4]。根據(jù)我國衛(wèi)生部印發(fā)的《食品用消毒劑原料(成份)名單(2009版)》，C12～C16烷基二甲基芐基氯化銨(C12-16-BAC)，雙癸基二甲基氯化銨(DDAC)等均可用于食品加工設備和容器的消毒[5]。在食品工業(yè)中，清潔消毒過程對于消除微生物必不可少，通常使用季銨鹽化學品[6]。但如果清潔操作不當，特別在用水沖洗不充分情況下，這些化合物的殘留物會持續(xù)存在于食品表面，從而成為食物污染的潛在來源。研究報道一些季銨鹽能影響人類的健康，刺激皮膚和眼睛[7]，具有生殖毒性[8]。歐洲食品安全局規(guī)定季銨鹽DDAC和BAC的最大殘留值為0.1 mg/kg。根據(jù)德國風險評估所數(shù)據(jù)顯示，季銨鹽在多種食品中被檢出，其中DDAC在冰淇淋中的含量最高[9]。我國尚未建立冷凍飲品中季銨鹽類消毒劑殘留的限量和國家檢測標準，因此建立冰淇淋、雪糕等冷凍飲品中季銨鹽類消毒劑殘留的準確、靈敏分析方法具有重要意義。

目前有關季銨鹽類的常見檢測方法主要有紫外-可見光分光光度法[10]、毛細管電泳法[11]、液相色譜法[12]、氣相色譜-質譜法[13-14]和高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)[15-17]等。近年來，質譜法被廣泛用于蔬菜、水果和奶粉等各類食品中季銨鹽殘留的檢測[18-19]，而HPLC-MS/MS則因其靈敏度高，選擇性好，抗干擾能力強，分析速度快，在各類化合物的檢測分析中得到廣泛應用[20]。本文建立了冷凍飲品中十二烷基二甲基芐基氯化銨(C12-BAC)、十四烷基二甲基芐基氯化銨(C14-BAC)、十六烷基二甲基芐基氯化銨(C16-BAC)、十二烷基三甲基氯化銨(DTAC)和DDAC 5種季銨鹽殘留的HPLC-MS/MS檢測方法，該方法前處理簡單，分析周期短，靈敏度高，為冷凍飲品中季銨鹽殘留的檢測提供了技術參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Sciex QTRAP 5500三重四極桿串聯(lián)質譜儀(美國 SCIEX公司)；Eyela N-1218BV旋轉蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會社)；ST16R高速冷凍離心機(美國賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司)；VG3 S025渦旋混合器(德國IKA儀器設備有限公司)；HY-2A調速振蕩器(江蘇金壇榮華有限公司)；BCD-218冷藏冷凍冰箱(中國海爾集團公司)；PM5-2000TD超聲波清洗器(英國普律瑪公司)。

C12-BAC(純度94.6%，德國Dr.Ehrenstorfer)；C14-BAC(≥98.0%，德國CNW Technologies)；C16-BAC(≥95.0%，德國CNW Technologies)；DTAC(98.0%，中國南京化學試劑股份有限公司)；DDAC(93.9%，德國Dr.Ehrenstorfer)；乙酸乙酯(色譜純，美國TEDIA公司)；乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)。

1.2 樣品前處理

冷凍飲品融化混勻后，稱取樣品2 g至50 mL離心管中，加入20 μL甲酸，渦旋混勻1 min，加入10 mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1)，2 g無水硫酸鎂，渦旋振蕩提取10 min，于8 000 r/min離心5 min，上清液移入旋轉蒸發(fā)瓶中，重復提取1次，合并提取液在45 ℃水浴中旋轉濃縮至約0.5 mL，于45 ℃下氮氣吹干，加入2 mL甲醇溶解，渦旋1 min，放入-20 ℃冷凍箱中，冷凍1 h，取甲醇層過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS測定。

1.3 標準溶液的配制

標準溶液的配制：稱取適量5種季銨鹽標準品，用甲醇配制成1 000 mg/L的單標儲備液?；旌蠘藴蕛湟?1.0 mg/L)的配制：準確移取5種季銨鹽單標儲備液100 μL于100 mL容量瓶，甲醇定容，4 ℃保存。基質匹配標準溶液的配制：按照“1.2”方法獲得空白基質溶液，因冰淇淋、雪糕等冷凍飲品的主要配料是牛奶，因此選取牛奶作為基質。將混合標準儲備液用牛奶空白基質配制成0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的系列基質匹配標準工作溶液，過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 高效液相色譜-串聯(lián)質譜條件

色譜條件：色譜分析柱選擇資生堂CAPCELL PAK CR(1∶20)(2.0 mm×150 mm，3 μm)。流動相A為乙腈，B為5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL；梯度洗脫程序：0～1 min，60%A；1～3 min，60%～80%A；3～7 min，80%A；7～8 min，80%～60%A；8～10 min，60%A。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI);掃描模式：正離子掃描；離子源溫度(TEM)：550 ℃；霧化氣壓力(GS1)：413 kPa；輔助氣壓力(GS2)：413 kPa；氣簾氣壓力(CUR)：241 kPa；多反應監(jiān)測(MRM)模式。5種季銨鹽的質譜條件見表1。

表1 5種季銨鹽的質譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 5 QACs

圖1 5種季銨鹽的分子結構式Fig.1 Structural formulas of 5 QACs

2 結果與討論

2.1 質譜與色譜條件的優(yōu)化

5種季銨鹽在水溶液中存在高峰度的[M-Cl]+母離子，3種含有芐基的季銨鹽(C12-BAC，C14-BAC和C16-BAC)易在芐基和季胺間發(fā)生鍵斷裂，產(chǎn)生芐基片段m/z91和對應的[NR3]+片段(m/z212.0、m/z240.0和m/z268.0)，而DDAC和DTAC容易去除烷基，產(chǎn)生高響應的[NR3]+片段(m/z186.0和m/z60.0)。根據(jù)歐盟(EU)的2002/657/EC指令，選擇1個母離子和2個主要特征碎片離子作為定性和定量離子對，優(yōu)化質譜參數(shù)(見表1)，5種季銨鹽的分子結構式見圖1。

圖2 5種季銨鹽標準溶液的提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of 5 QACs standard solution

實驗嘗試采用Agilent ZORBAX C18和Waters ACQUITY BEH C18柱對待測物進行分離，發(fā)現(xiàn)5種季銨鹽的峰形拖尾嚴重，這可能是由于5種季銨鹽均含有較長的碳鏈，容易被C18色譜柱的填料吸附，較難洗脫。文獻報道使用具有親水作用的Hilic正相色譜柱，以乙腈-乙酸銨為流動相時能獲得合適的保留時間和對稱的峰形。但Hilic柱的平衡時間長，重復性較差。本實驗采用混合了C18填料和強陽離子交換(SCX)填料的CAPCELL PAK CR(1∶20)色譜柱，基于陽離子交換和反相雙重作用機理[21]，可獲得分離效果好，保留時間合適，峰形對稱的5種季銨鹽標準溶液的色譜圖(如圖2)。

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

2.2.1 提取劑的選擇文獻報道食品中季銨鹽的提取常采用QuEChERS方法[22]，常見的提取劑為乙腈。考慮到冷凍飲品中常含有巧克力等脂肪含量高的物質，結合季銨鹽類化合物含有長鏈烷烴，且具親脂性，本實驗選擇乙腈和乙酸乙酯作為提取溶劑，在牛奶基質中添加10 μg/kg 5種季銨鹽，比較了乙腈、乙腈-乙酸乙酯(2∶1)、乙腈-乙酸乙酯(1∶1)、乙腈-乙酸乙酯(1∶2)和乙酸乙酯5種溶劑的提取效果。結果顯示，乙腈中加入一定量乙酸乙酯時，DDAC的回收率更好。當乙酸乙酯含量超過50%時，5種季銨鹽的相對強度均明顯下降，回收率降低(見圖3)，這可能是乙酸乙酯提取較多的脂溶性物質所致。考慮到冷凍飲品基質，實驗最終選擇乙腈-乙酸乙酯(1∶1)為提取溶劑，重復提取2次。

圖3 提取劑種類對5種季銨鹽提取效率的影響Fig.3 Effect of extraction type on extraction efficiencies of 5 QACs

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化QuEChERS法提取季銨鹽已有較多的報道，常見的凈化吸附劑有N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)和十八烷基鍵合硅膠(C18)。有學者比較上述幾種凈化劑對奶粉中季銨鹽的吸附效果，發(fā)現(xiàn)單獨使用PSA時的回收率最高，而C18和GCB會吸附季銨鹽，導致回收率降低[23]。另有文獻比較了3種固相萃取柱HLB、MCX和WCX的凈化效果，發(fā)現(xiàn)使用WCX柱時，BAC和DDAC的回收率較高[24]。本實驗考察了一種簡單的凈化方式—冷凍脫脂法[25]：提取后的物質用甲醇定容后，直接于-20 ℃冷凍1 h。此低溫條件下，脂類物質在甲醇中的溶解度因降低而析出，取上層清液，過0.22 μm濾膜除去產(chǎn)生的絮狀漂浮物和沉淀物，上機測試，同時與采用Oasis WCX柱的凈化結果進行比較，以牛奶基質加標20.0 μg/kg為例，發(fā)現(xiàn)5種季銨鹽在2種凈化方式下得到的回收率均在86%～96%之間，滿足檢測及定量需求。本實采用簡單的冷凍脫脂方法對樣品進行凈化。

2.3 方法學評價

2.3.1 基質效應本文采用基質配制校準曲線斜率與純溶劑標準校準曲線斜率的比值，對5種季銨鹽在2種典型樣品(牛奶和雪糕)中的基質效應進行考察，其比值越接近1，則基質效應越小[26]。由表2可知5種季銨鹽的基質效應(斜率比值)為0.99～1.11，表明基質效應小，但考慮到冷凍飲品的種類繁多，且多數(shù)添加了牛奶奶粉，因此選擇牛奶基質配制標準溶液。

表2 5種季銨鹽的基質效應、線性方程、相關系數(shù)(r)、檢出限及定量下限Table 2 Matrix effects，solvent calibration curves,matrix-matched calibrations,correlation coefficients(r),LODs and LOQs of 5 QACs

2.3.2 線性范圍、檢出限及定量下限配制5種季銨鹽的基質標準溶液，在優(yōu)化條件下，通過HPLC-MS/MS測定后，以季銨鹽的質量濃度(x，μg/L)為橫坐標，各化合物定量離子對的峰面積(y)為縱坐標，制作標準曲線，結果見表2。結果顯示，5種季銨鹽均在0.5～50.0 μg/L 范圍內線性關系良好，相關系數(shù)(r)均大于0.995，分別以信噪比(S/N)為3和10時計算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，測得檢出限為0.3～1.5 μg/kg，定量下限為1.0～5.0 μg/kg。

2.3.3 準確度與精密度在2種空白牛奶和雪糕基質中進行5種季銨鹽混合標準溶液的加標回收實驗，加標水平為5.0、10.0、50.0 μg/kg，每個濃度平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。結果顯示，在3個加標水平下5種季銨鹽的回收率為80.3%～114%，相對標準偏差(RSD)<10%(見表3)，符合檢測要求。

表3 樣品中5種季銨鹽的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 5 QACs in sample(n=6)

圖4 典型陽性樣品的提取離子色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatogram of a typical positive sample

2.3.4 實際樣品的檢測采用本文建立的方法對本地區(qū)流通市場上抽檢的39批次冷凍飲品(主要包括冰淇淋、雪糕和棒冰等)進行測定。結果顯示：有25批次樣品檢出C12-BAC和C14-BAC，含量為1.5～15.0 μg/kg。3批次樣品檢出DDAC，含量為2.5～20.5 μg/kg，說明冷凍飲品中存在季銨鹽殘留污染。某典型陽性樣品的提取離子色譜圖如圖4所示。

3 結 論

本文建立了一種冷凍飲品中5種季銨鹽的HPLC-MS/MS分析方法。通過優(yōu)化提取試劑，選擇乙腈-乙酸乙酯(1∶1)為提取溶劑，采用冷凍脫脂凈化后，使用CAPCELL PAK CR(1∶20)柱實現(xiàn)了5種季銨鹽的分離，并采用基質匹配外標法進行定量分析。該方法操作簡便，靈敏度高，精密度良好，適用于冷凍飲品中5種季銨鹽殘留的定量分析。