邱佩佩，毋福海，白 研,賀錦燦

(廣東藥科大學 廣東省公共衛(wèi)生檢測與評價工程中心,廣東 廣州 510310)

食源性疾病是指食用了被細菌和或其毒素、寄生蟲、病毒、化學品或其他媒介污染的食物而引起的疾病[1]。雖然美國的食品供應是世界上最安全的，但聯(lián)邦政府估計，每年約有4800萬例食源性疾病患者(相當于六分之一的美國人)因食用受污染的食品而患病，并導致約12.8萬人住院和3000人死亡[2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的一份關于食源性疾病的報告，由食源性致病菌引起的疾病和死亡持續(xù)威脅著全球的公共衛(wèi)生安全[3]。因此，開發(fā)快速、準確且靈敏的食源性致病菌檢測方法是預防食源性疾病暴發(fā)和確保食品安全的關鍵。目前食源性致病菌的常規(guī)檢測方法包括培養(yǎng)和菌落計數(shù)法、酶聯(lián)免疫吸附試驗法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、聚合酶鏈反應法(Polymerase chain reaction，PCR)等[4-7]。然而，培養(yǎng)和菌落計數(shù)法費時費力，涉及細菌培養(yǎng)、重復富集、菌落分離以及各種生化和血清學鑒定試驗，不適用于食源性致病菌的現(xiàn)場快速檢測。盡管ELISA和PCR克服了耗時長的缺點，但需要昂貴的專用設備和復雜的樣品前處理，甚至缺乏抗干擾能力。因此，研究人員致力于開發(fā)新的檢測方法以降低檢測時間和成本，同時提高檢測技術的可靠性、靈敏度和特異性。

在過去的十幾年間，納米技術快速發(fā)展，特別是在生物醫(yī)學檢測領域[8-11]。由于納米材料存在粒徑小、比表面積大和表面反應活性高等特性，成為食源性致病菌檢測領域的研究熱點。此外，將抗體[12-14]、適配體[15-17]、抗菌肽[18-19]等識別元件修飾于納米粒子表面，并結合新穎的分析技術，可提高食源性致病菌檢測的特異性和靈敏度。本文主要總結了磁性納米粒子(Magnetic nanoparticles，MNPs)、金納米粒子(Gold nanoparticles，AuNPs)、銀納米粒子(Silver nanoparticles，AgNPs)、量子點(Quantum dots，QDs)、上轉換納米粒子(Upconversion nanoparticles，UCNPs)、二氧化硅納米粒子(Silica nanoparticles，SiNPs)與磁性分離樣品前處理技術或核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)、比色、表面增強拉曼散射(Surfaces enhance Raman scattering，SERS)、熒光等分析技術結合在食源性致病菌檢測中的應用，以期為日后的研究提供思路。

1 納米材料概述

納米材料是指三維空間中至少有一維尺寸范圍在1～100 nm之間的材料[20]。按結構可分為零維納米材料、一維納米材料、二維納米材料、三維納米材料，其中納米粒子屬于零維納米材料；按物理性質可分為磁性納米材料、光學納米材料、半導體納米材料等；按材質可分為金屬納米材料、無機納米材料、有機納米材料等。由于納米材料的尺寸處于介觀領域，其具有的表面效應、小尺寸效應、量子尺寸效應、宏觀量子隧道效應等特性，使之具有磁學、光學、化學等性能[21]。

這些優(yōu)異的性能使得納米材料在化工、生物、醫(yī)學等領域得到了廣泛的應用，尤其在食源性致病菌檢測應用中具有巨大優(yōu)勢。例如MNPs同時具有納米材料和磁性材料的特性，能在外部磁場下快速分離并在移除磁場時重新分散，從而可實現(xiàn)目標細菌的快速分離；AuNPs具有良好的光學性能，可以通過誘導粒子聚集或分散導致顏色變化實現(xiàn)比色分析，適用于現(xiàn)場快速檢測；QDs憑借其寬的激發(fā)光譜、窄的發(fā)射光譜和大的斯托克斯位移等特性而應用于食源性致病菌檢測中。

2 磁性納米粒子

2.1 磁性分離

MNPs具有納米材料的小尺寸效應、比表面積效應和磁性材料的磁效應。當MNPs的粒徑小于其超順磁性臨界尺寸時，粒子進入超順磁性狀態(tài)，這種特殊的磁性使粒子可通過外部磁體實現(xiàn)快速分離，并在沒有磁場的情況下迅速重新分散[22]。因此，磁性分離技術能夠有效地從復雜介質中分離和濃縮目標分析物，避免了繁瑣的分離處理[23-24]。例如，Cheng等[25]提出了一種適配體和抗生素雙重識別與磁性富集和熒光檢測相結合的策略，方法對金黃色葡萄球菌的檢出限(Limit of detection，LOD)為10 CFU/mL，復雜樣品中的LOD為70 CFU/mL。Wang等[26]采用適配體修飾的鍍銀MNPs捕獲細菌，捕獲率達75%；基于該復合材料建立的SERS分析方法對金黃色葡萄球菌的LOD為10 CFU/mL。Yu等[27]將Fe3O4納米粒子磁性分離與雜交鏈反應結合，降低了背景信號，對沙門氏菌的LOD為74 CFU/mL。此外，MNPs表面修飾非選擇性識別元件后能同時捕獲多種細菌，與SERS等分析方法結合可實現(xiàn)多種細菌的同時檢測。如Yuan等[18]以抗菌肽修飾的Fe3O4納米粒子作為捕獲探針，4-巰基苯基硼酸修飾的鍍金的銀裝飾氧化石墨烯納米復合材料作為SERS標簽，開發(fā)了一種三明治結構的生物傳感器(圖1)。該方法成功分離并檢測了血樣中濃度僅為10 CFU/mL的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。Li等[28]將磁性分離與SERS分析方法結合，使用鍍銀的MNPs快速鑒別了水樣中的貝氏芽孢桿菌和大腸桿菌(<15 min)。盡管MNPs能夠有效地從復雜介質中分離和濃縮細菌，但是在目標細菌濃度極低或多種待檢物存在的情況下進行特異性捕獲仍然較為困難[29]。

圖1 基于MNPs的SERS分析示意圖[18]Fig.1 Schematic diagram of SERS assay based on MNPs[18]

2.2 核磁共振檢測

單個MNPs可以影響周圍數(shù)十億的水分子，其聚集會使水中質子的橫向弛豫時間(T2)發(fā)生變化，從而可通過NMR技術來檢測MNPs標記的目標細菌，提高檢測靈敏度[30]。Zhao等[31]將單核細胞增生李斯特菌與MNPs上抗體的特異性結合，誘導MNPs的聚集，引起MNPs周圍水分子的T2變化，并通過NMR檢測ΔT2信號間接檢測細菌，LOD為3 MPN(最大可能數(shù))。Luo等[32]采用抗體修飾的MNPs對細菌進行磁分離，通過測量其T2信號反映目標細菌的含量，該方法可在30 min左右完成細菌的檢測。除抗體外，適配體也常被用做識別元件。例如，Jia等[33]基于適配體修飾的MNPs，建立了磁弛豫開關傳感器用于銅綠假單胞菌的檢測,LOD為50 CFU/mL。但NMR測量無法區(qū)分哪個特定目標導致T2值變化，因此不能用于多種細菌的同時檢測。此外，NMR儀器的成本較高、體積較大也限制了其在食源性致病菌檢測中的應用。

3 貴金屬納米粒子

3.1 金納米粒子

AuNPs具有易于合成和表面修飾、理化性質穩(wěn)定、生物相容性好等優(yōu)點，是食源性致病菌檢測中較為常用的納米粒子[34]。將識別元件修飾在AuNPs表面，構建功能化金納米探針，能用于食源性致病菌的特異性檢測。粒徑較小的AuNPs存在強烈的局部表面等離子體共振(Local surface plasmon resonance，LSPR)，在水溶液中通常呈紅色，當AuNPs聚集時溶液顏色由紅色變?yōu)樗{色，為比色分析提供了可能[35]。比色分析不需借助復雜儀器，可以用肉眼直接觀察，因此適用于現(xiàn)場快速檢測。例如，Verdoodt等[36]提出了一種基于抗體修飾的AuNPs檢測乳酸桿菌屬和金黃色葡萄球菌的比色方法，AuNPs通過抗體-抗原相互作用特異性識別目標細菌，在聚集時發(fā)生顏色變化。整個檢測過程僅需1 min，乳酸桿菌和金黃色葡萄球菌的LOD分別為105 CFU/mL和120 CFU/mL。Ma等[37]也報道了一種類似的方法，將適配體修飾到AuNPs表面，通過適配體與細菌特異性結合使AuNPs發(fā)生聚集，顏色先由紅色轉變?yōu)樽仙?，再轉變?yōu)樗{色。該方法對鼠傷寒沙門氏菌的LOD低至56 CFU/mL。最近，Zheng等[38]將AuNPs比色與智能手機成像結合，建立了一種快速檢測大腸桿菌的方法，LOD為50 CFU/mL。為了提高比色方法的靈敏度，Thiramanas等[39]基于帶正電的AuNPs與帶負電的細菌細胞壁及酶之間的競爭性靜電相互作用，提出了一種簡單快速的細菌比色分析方法(圖2)。該法對大腸桿菌的LOD低至10 CFU/mL。盡管AuNPs比色法簡單、快速，但如何控制納米粒子的聚集程度仍是難題[40]，因此，基于聚集的比色方法可能很難發(fā)展為日常生活中食源性致病菌的定量檢測方法。

圖2 基于AuNPs的酶放大比色分析示意圖[39]Fig.2 Schematic diagram of enzyme amplified colorimetric assay based on AuNPs[39]

除比色分析外，AuNPs還常與免疫層析技術結合，不需借助任何大型復雜儀器，無需專業(yè)操作人員，快速、高效、低成本地檢測食源性致病菌，適用于現(xiàn)場檢測。Song等[41]采用基于雙單克隆抗體的AuNPs免疫層析試紙條快速同時檢測了志賀氏菌和大腸桿菌O157：H7，LOD均為106CFU/mL。雖然免疫層析技術優(yōu)點眾多，但是由于AuNPs本身不發(fā)光，需要大量粒子聚集方能變色，導致檢測靈敏度較低。Bu等[42]利用金增強方法提高了傳統(tǒng)AuNPs層析試紙條的靈敏度，用于對腸炎沙門氏菌的檢測，增強后靈敏度提高2個數(shù)量級，LOD為104CFU/mL。Fu等[43]結合金增強和酶催化的兩步級聯(lián)信號放大策略提高靈敏度，用于大腸桿菌O157：H7的檢測，LOD為1.25×101CFU/mL，比傳統(tǒng)AuNPs免疫層析法(5.0×103CFU/mL)低約400倍。

圖3 基于AuNPs的SERS分析示意圖[46]Fig.3 Schematic diagram of SERS assay based on AuNPs[46]

此外，AuNPs表面電子的集體振蕩還被用于金屬納米表面拉曼散射的高度放大[44]。由于拉曼光譜上的振動或旋轉躍遷對應于細菌細胞表面的特定分子結構，從而提供了一組化學“指紋”，這些“指紋”圖譜有助于區(qū)分不同種類的細菌細胞，從而實現(xiàn)多種細菌的同時檢測[45]。為了提高方法的特異性，研究者將拉曼標記分子與目標細菌結合，開發(fā)了一種SERS標記策略。例如，Zhang等[46]分別將兩種不同的拉曼標記分子和適配體修飾在AuNPs上(適配體能特異性識別鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌)，結合磁性分離，同時檢測了鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，不同的拉曼標記分子信號反映不同細菌的含量(圖3)。該方法可在3 h內完成檢測，對鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的LOD分別為15 CFU/mL和35 CFU/mL。SERS標記策略的不足在于不能直接獲得目標細菌的固有“指紋”，且標簽的非特異性結合可能導致假陽性信號[47]。盡管基于AuNPs的SERS分析方法較為靈敏，但是在實際的食源性致病菌SERS檢測中還需要克服兩個障礙：來自納米材料的光譜干擾及繁瑣的樣品預處理。

3.2 銀納米粒子

AgNPs由于具有易于修飾、摩爾消光系數(shù)大等優(yōu)點而受到研究者的關注。例如，Zhou等[48]在細菌細胞壁上原位合成AgNPs，用于SERS無標記檢測飲用水中的細菌。這些表面存在AgNPs的細菌的拉曼信號比細菌混懸液的拉曼信號高約30倍，檢測時間僅需10 min。通過SERS映射技術可以在疏水性載玻片上檢測到低至2.5×102CFU/mL的細菌。為了提高AgNPs的穩(wěn)定性，Wang等[49]在AgNPs的表面修飾一層金，與磁性分離結合，10 min內即可檢測到大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。由于AgNPs對某些生物具有毒性作用[50]，因此在食源性致病菌檢測領域的應用較少。

4 熒光納米粒子

4.1 量子點

QDs具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、斯托克斯位移大、光穩(wěn)定性好、熒光效率高及摩爾消光系數(shù)大等優(yōu)點，被廣泛應用于食源性致病菌的檢測。此外，單個光源可以同時激發(fā)多種不同顏色的熒光QDs，從而使QDs成為同時檢測多種致病菌的理想探針。例如，Duan等[51]用不同適配體修飾的多色熒光QDs做熒光探針，建立了雙重熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)檢測平臺。該法對副溶血性弧菌的LOD為25 CFU/mL，對鼠傷寒沙門氏菌的LOD為35 CFU/mL。Wang等[52]開發(fā)了一種使用不同抗體修飾的多色QDs作為熒光探針的熒光免疫測定方法，可同時檢測腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。研究人員將MNPs磁性分離和QDs熒光檢測結合，降低了基體干擾，可快速分離細菌。例如，Dogan等[53]結合抗體修飾的MNPs和殼聚糖包被的CdTe QDs，開發(fā)了一種快速測定大腸桿菌的熒光方法，該方法的LOD為30 CFU/mL。Yin等[54]基于免疫磁珠分離和QDs反向測定策略開發(fā)了一種多通道免疫傳感器，在1 h內一步即可同時檢測大腸桿菌O157：H7和沙門氏菌，兩者的LOD分別為30 CFU/mL和60 CFU/mL。Xue等[55]將免疫MNPs和QDs結合，定量檢測大腸桿菌O157：H7，方法能在2 h內檢測到低至14 CFU/mL的大腸桿菌O157：H7。QDs的熒光強度強且光穩(wěn)定性好，能同時檢測多種致病菌，未來的主要挑戰(zhàn)是降低生產(chǎn)成本以及大規(guī)模生產(chǎn)尺寸均一、性能穩(wěn)定的QDs。

4.2 上轉換納米粒子

UCNPs在近紅外激發(fā)下能發(fā)出可見光，具有優(yōu)良的光穩(wěn)定性、窄的發(fā)射光譜、多色可調性、低背景熒光及毒性較小等優(yōu)點，在基于熒光標記的食源性致病菌檢測方面具有廣闊的前景。Wu等[56]使用適配體修飾的多色UCNPs作為熒光標記，開發(fā)了一種同時檢測3種病原菌的多重檢測方法。該法對金黃色葡萄球菌、副溶血球菌、鼠傷寒沙門氏菌的LOD分別為25、10、15 CFU/mL。此外，Kurt等[57]使用適配體功能化的UCNPs和QDs開發(fā)了一種雙波長激發(fā)熒光法，能同時檢測金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌(圖4)。該方法對金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的LOD分別為16 CFU/mL和28 CFU/mL。Jin等[58]基于UCNPs熒光發(fā)射和AuNPs吸收之間的光譜重疊，開發(fā)了一種FRET檢測平臺。該方法可以快速、靈敏、選擇性地檢測3 CFU/mL的大腸桿菌。盡管基于UCNPs的熒光方法具有靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點，但UCNPs的制備方法不夠成熟、生產(chǎn)成本較高、大規(guī)模生產(chǎn)困難，從而限制了其在食源性致病菌檢測領域中的應用。

5 二氧化硅納米粒子

SiNPs能將數(shù)千個具有熒光響應或拉曼響應的染料分子包裹在保護性硅膠基質中，具有良好的光穩(wěn)定性，為基于熒光/拉曼的生物分析提供了高度放大和可再現(xiàn)的信號。Chen等[59]建立了一種基于SiNPs的間接免疫熒光測定方法，結合熒光顯微鏡或流式細胞術快速檢測了大腸桿菌O157：H7。Shangguan等[60]將正介電電泳驅動在線富集技術與適配體和熒光分子修飾的SiNPs結合，能在微流體通道中檢測金黃色葡萄球菌，該方法的LOD為93 CFU/mL。Hu等[61]將熒光素標記的空心二氧化硅納米球與磁性分離結合，在75 min內實現(xiàn)了大腸桿菌O157：H7的檢測，LOD為3 CFU/mL。Zhu等[62]分別在AuNPs表面修飾拉曼標記分子(4,4’-聯(lián)吡啶)和二氧化硅殼層，制成一種SERS探針，該探針對大腸桿菌O157：H7的LOD低至10 CFU/mL。然而，SiNPs在食源性致病菌檢測應用中仍存在染料易泄漏、包裹步驟復雜等問題。

圖4 基于UCNPs的熒光分析示意圖[57]Fig.4 Schematic diagram of fluorescence assay based on UCNPs[57]

在食源性致病菌檢測中，磁性納米粒子基于其磁效應主要用于NMR分析，但在細菌濃度極低或多種待檢物存在的情況下難以進行特異性捕獲。貴金屬納米粒子憑借其獨特的光學性質主要用于比色分析和SERS分析，但AuNPs聚集過程復雜且難以控制；而AgNPs則有生物毒性作用。熒光納米粒子主要用于熒光分析，但QDs生產(chǎn)成本較高、批次間質量不一；UCNPs制備方法不夠成熟、大規(guī)模生產(chǎn)困難。SiNPs在食源性致病菌檢測應用中存在染料易泄漏、包裹步驟復雜等問題。各納米粒子在食源性致病菌檢測中的應用詳見表1。

表1 不同納米粒子用于食源性致病菌檢測的總結Table 1 Summary of different nanoparticles used for foodborne pathogenic bacteria detection

6 總結與展望

納米技術的迅速發(fā)展為食源性致病菌檢測提供了新的方向，滿足了快速、靈敏、特異性檢測的要求，彌補了常規(guī)檢測方法的不足。用納米粒子構建的生物傳感器，能有效地提高對目標細菌的識別能力，加速信號轉導，實現(xiàn)信號放大，從而縮短檢測時間，提高檢測的特異性和靈敏度。但是，基于納米粒子的檢測方法尚有一些問題待解決。因此，未來的研究應集中在研究低成本、工業(yè)化、高質量的納米粒子制備方法；研究控制納米粒子大小、形狀和聚集的策略；研究簡單易行的納米粒子表面修飾方法；提高生物識別元件選擇性識別目標細菌的能力；以及提高磁性分離技術特異性分離和富集目標細菌的能力等方面。相信未來將研究出更多的快速、簡便、靈敏的食源性致病菌檢測方法來預防和控制食源性疾病并確保人們的食品安全。