佟 樂，張崇唯，曹 鈺，葉 磊△

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院急診科，四川成都 610041；2.四川大學(xué)華西護(hù)理學(xué)院,四川成都 610041;3.四川大學(xué)災(zāi)難醫(yī)學(xué)中心，四川成都，610041；4.四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川成都,610041)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)屬于β屬冠狀病毒,有包膜,顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm。新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)目前已納入乙類傳染病，并按甲類傳染病管理[1]。SARS-CoV-2的基因特征與中東呼吸綜合征冠狀病毒有明顯區(qū)別[2-3]。SARS-CoV-2的潛伏期一般為1～14 d，多數(shù)為3～7 d，極個(gè)別患者潛伏期可達(dá)24 d[4]。當(dāng)SARS-CoV-2入侵機(jī)體后，機(jī)體會(huì)進(jìn)行免疫防御并產(chǎn)生特異性抗體，其中特異性的免疫球蛋白M(IgM)抗體是機(jī)體感染后早期產(chǎn)生的抗體，可提示目前存在感染或近期感染；而免疫球蛋白G(IgG)抗體是再次免疫應(yīng)答時(shí)產(chǎn)生的主要抗體，可提示患者處于恢復(fù)期或既往感染[5]。此外，在SARS-CoV-2感染過程中，特異性T淋巴細(xì)胞通過釋放淋巴因子發(fā)揮重要作用[6-7]。有研究表明，CD3+的水平隨著機(jī)體免疫功能的提升而升高；CD4+能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，為機(jī)體T淋巴細(xì)胞增生提供良好的條件；而CD8+可以有效抑制B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞活性，減少抗體產(chǎn)生[8]。本研究初步分析了免疫功能與COVID-19康復(fù)患者SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果復(fù)陽的關(guān)系，以期為COVID-19的防控工作提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月23日至3月5日四川大學(xué)華西醫(yī)院收治的100例COVID-19確診患者作為研究對象，其中經(jīng)治療核酸檢測結(jié)果轉(zhuǎn)陰后再次復(fù)陽的患者42例為復(fù)陽組，經(jīng)治療核酸檢測結(jié)果轉(zhuǎn)陰且未復(fù)陽的患者58例為非復(fù)陽組。COVID-19診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[9]。兩組患者年齡、性別、合并肺部疾病、合并慢性病、舒張壓、收縮壓、糖化血紅蛋白水平、血脂異常情況等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2方法

1.2.1治療方法 所有患者入院后給予化痰、抗感染、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、對癥支持等常規(guī)綜合治療。癥狀較重者在常規(guī)綜合治療的基礎(chǔ)上，給予經(jīng)鼻持續(xù)氣道正壓通氣治療[3]。呼氣末正壓(PEEP)初次設(shè)定為4 cm H2O，氣流量設(shè)定為1～12 L，每分鐘吸氧濃度控制在30%～60%。根據(jù)患者的動(dòng)脈血二氧化碳分壓和動(dòng)脈血氧分壓調(diào)節(jié)其氧氣吸入濃度和PEEP，使其血?dú)夥治鎏幱谡顟B(tài)，即吸入氧濃度≤30%，PEEP降至2～3 cm H2O，動(dòng)脈血二氧化碳分壓>95%。治療12～24 h后，改用鼻導(dǎo)管吸氧，隨后逐漸停止供氧。若患者煩躁不安，則采用水合氯醛灌腸鎮(zhèn)靜；若患者的煩躁難以控制，可靜脈持續(xù)泵入咪達(dá)唑侖鎮(zhèn)靜。若以上治療無效，則進(jìn)行氣管插管機(jī)械通氣治療，并在治療前0.5 h和治療后24 h觀察患者的臨床表現(xiàn)，積極預(yù)防心功能不全及消化道出血等并發(fā)癥。

1.2.2檢測方法 兩組患者確診時(shí)采集外周靜脈血5 mL，經(jīng)4 000 r/min離心5 min后，收集血清標(biāo)本，保存于-70 ℃冰箱中待測。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞，包括CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+、CD16+56+，儀器為BD FACSAria II流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，結(jié)合專用軟件獲取數(shù)據(jù)。采用免疫散射比濁法檢測患者免疫球蛋白A(IgA)、IgM、IgG和血清補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4水平，試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3觀察指標(biāo) 細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)：比較復(fù)陽組和非復(fù)陽組外周血T淋巴細(xì)胞(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、B淋巴細(xì)胞(CD19+)、NK細(xì)胞(CD16+56+)的水平差異。體液免疫相關(guān)指標(biāo)：比較復(fù)陽組和非復(fù)陽組IgA、IgM、IgG、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4的水平差異。

2 結(jié) 果

2.1兩組細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)水平比較 復(fù)陽組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD19+水平均明顯低于非復(fù)陽組，CD8+、CD16+56+水平均明顯高于非復(fù)陽組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)水平比較

2.2兩組體液免疫相關(guān)指標(biāo)水平比較 復(fù)陽組IgA、IgM、IgG、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4水平均明顯低于非復(fù)陽組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組體液免疫相關(guān)指標(biāo)水平比較

2.3核酸檢測結(jié)果復(fù)陽的危險(xiǎn)因素 以復(fù)陽結(jié)果作為因變量，單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，CD4+/CD8+、IgG、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4是COVID-19康復(fù)患者核酸檢測結(jié)果復(fù)陽的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

表4 核酸檢測結(jié)果復(fù)陽的危險(xiǎn)因素分析

3 討 論

相關(guān)研究顯示，CD4+/CD8+失衡，CD8+異常激活，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞數(shù)目減少所致的免疫抑制效應(yīng)是導(dǎo)致感染性疾病的主要原因[10-11]。SARS-CoV-2感染患者細(xì)胞免疫紊亂程度加重，主要表現(xiàn)為CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平明顯降低，CD8+水平明顯升高。CD4+是常見的輔助性T淋巴細(xì)胞，可促進(jìn)細(xì)胞免疫效應(yīng)；CD8+具有免疫抑制效應(yīng)，并可對毒性細(xì)胞發(fā)揮抑制作用[12-13]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)陽組患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD19+水平均明顯低于非復(fù)陽組患者，CD8+、CD16+56+水平均明顯高于非復(fù)陽組患者，提示SARS-CoV-2感染可能通過抑制T淋巴細(xì)胞的活化功能，最終導(dǎo)致免疫炎性反應(yīng)；同時(shí)，SARS-CoV-2侵襲機(jī)體后通過黏附因子附著于宿主細(xì)胞，再釋放毒性物質(zhì)損傷宿主細(xì)胞的抗原結(jié)構(gòu)，通過刺激B淋巴細(xì)胞釋放自身抗體，最終導(dǎo)致免疫紊亂。但關(guān)于T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞分布平衡紊亂的具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究[14]。結(jié)合本研究結(jié)果，T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞免疫失衡可能參與了COVID-19康復(fù)患者核酸檢測結(jié)果復(fù)陽的過程。

抗體的本質(zhì)是能與抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白，但是非特異性的具有免疫功能的球蛋白也具有重要作用。體液免疫在病原微生物感染中發(fā)揮免疫防御的作用，在血液中表現(xiàn)為IgA、IgM、IgG的水平變化。IgA對局部黏膜組織發(fā)揮重要的免疫保護(hù)效應(yīng)，機(jī)體感染時(shí)，血清IgA水平明顯降低；IgM是機(jī)體早期體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體；IgG屬于抗感染抗體之一，其在抗細(xì)菌感染和抗病毒感染中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究顯示，SARS-CoV-2感染患者體液免疫功能明顯降低，主要表現(xiàn)為血清IgA、IgG、IgM水平下降[15]。另有研究顯示，感染性疾病患者常常合并免疫功能紊亂，且與病情嚴(yán)重程度具有密切的關(guān)系，表現(xiàn)為IgA合成不足與IgM、IgG合成過度[16]。病原體感染機(jī)體后，通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)，抑制T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子或B淋巴細(xì)胞分泌抗體而發(fā)揮免疫抑制作用，但治愈后的二次感染則可能通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞趨化因子和白細(xì)胞生成、聚集，最終導(dǎo)致自身免疫損傷。本研究結(jié)果顯示，復(fù)陽組患者IgA、IgM、IgG、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4水平均較非復(fù)陽組患者明顯降低，提示COVID-19康復(fù)患者核酸檢測結(jié)果復(fù)陽可能與體液免疫相關(guān)指標(biāo)水平異常有關(guān)。進(jìn)一步行危險(xiǎn)因素分析發(fā)現(xiàn)，CD4+/CD8+、IgG、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4是COVID-19患者核酸檢測結(jié)果復(fù)陽的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

4 結(jié) 論

體液免疫、細(xì)胞免疫與COVID-19康復(fù)患者核酸檢測結(jié)果復(fù)陽有關(guān)，其中CD4+/CD8+、IgG、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4是COVID-19康復(fù)患者核酸檢測結(jié)果復(fù)陽的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但本研究樣本量較小，后續(xù)需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究驗(yàn)證。