徐 放,張衛(wèi)華,潘 文,楊會(huì)肖,楊曉慧,廖煥琴,徐 斌,朱報(bào)著,王裕霞
(廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)試驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院,廣東 廣州 510520)
【研究意義】我國(guó)木本花卉資源豐富、應(yīng)用廣泛,具有較大的市場(chǎng)潛力,僅廣東省木本花卉年產(chǎn)值就超過9億元。但不同木本花卉品種栽培條件差異較大,且近年來(lái)極端氣候發(fā)生頻率增加[1],盲目引種栽培可能會(huì)因?yàn)闅夂蛞蛩卦斐奢^大損失[2-3]。【前人研究進(jìn)展】近年來(lái),對(duì)抗寒性和抗旱性的研究逐步深入,基于生理指標(biāo)對(duì)抗逆能力進(jìn)行評(píng)定的研究體系已日趨成熟[4-5],相對(duì)電導(dǎo)率(EC)和相對(duì)含水量(RWC)等已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各物種的抗逆研究中,取得了很好的效果,Deans等[6]對(duì)橡樹進(jìn)行相對(duì)電導(dǎo)率的檢測(cè),評(píng)價(jià)了在不同寒害條件下植株的損傷情況;Su等[7]和Sedaghat等[8]分別在黑麥草和冬小麥中利用相對(duì)含水量的檢測(cè)對(duì)不同家系的抗寒水平進(jìn)行了評(píng)定。以往研究主要利用隸屬函數(shù)法評(píng)定抗逆性的強(qiáng)弱,如蘇李維等[9]利用多個(gè)生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)法對(duì)葡萄的抗寒能力進(jìn)行了排序。但相關(guān)研究方法利用主成分分析減少生理表型的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析時(shí),部分測(cè)定數(shù)據(jù)無(wú)法發(fā)揮最大的統(tǒng)計(jì)效力,也無(wú)法利用由逆境處理時(shí)間或處理方式的變化而引起的生理數(shù)據(jù)的動(dòng)態(tài)變化。將k-mean等統(tǒng)計(jì)方法引入抗逆研究中,可以為不同物種或品種抗逆能力的聚類提供了更為精準(zhǔn)的分類手段,可以獲得更為直觀的抗逆性聚類,而且可以更充分利用測(cè)量得到的動(dòng)態(tài)變化的生理數(shù)據(jù)[10]。在綜合評(píng)價(jià)的研究中,TOPSIS方法被廣泛應(yīng)用于工程[11]、數(shù)學(xué)[12]、醫(yī)療[13]等多個(gè)領(lǐng)域,引入抗逆行評(píng)價(jià)中可以豐富相關(guān)的研究方法?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】到目前為止,我國(guó)南方地區(qū)主要栽培的木本花卉物種對(duì)低溫和干旱的抗性研究尚無(wú)報(bào)道,急需相關(guān)研究指導(dǎo)后續(xù)的引種和栽培。【擬解決的關(guān)鍵問題】為了比較和評(píng)價(jià)不同木本花卉植物的抗寒和抗旱能力,同時(shí)對(duì)不同物種的抗性進(jìn)行準(zhǔn)確排序和聚類,本研究選用27個(gè)木本花卉物種為研究材料,分析低溫和干旱脅迫比較不同逆境處理下的生理指標(biāo)差異,首次在抗逆性研究中采用k-means方法對(duì)抗逆能力進(jìn)行聚類并利用TOPSIS方法進(jìn)行抗性排序,以期為木本花卉的引種和栽培應(yīng)用提供依據(jù),也為抗逆性的研究提供新的思路。
選用27個(gè)物種的生長(zhǎng)均一的種子苗作為試驗(yàn)材料,包括黃花風(fēng)鈴木(Handroanthus chrysanthus)、藍(lán)花風(fēng)鈴木(Tabebuia pentaphylla)、金花風(fēng)鈴木(T.rosea)、火焰木(Spathodea campanulata)、藍(lán)花楹(Grafton jacaranda)、本地木棉(Bombax malabaricum)、美麗異木棉(Ceiba speciosa)、廣寧紅花油茶(Camellia semiserrata)、杜鵑紅山茶(C.azalea)、小葉紫薇(Lagerstroemia indica)、大葉紫薇(L.speciosa)、黃槐(Cassia surattensis)、無(wú)憂木(Saracadives Pierre)、宮粉羊蹄甲(Bauhinia variegata)、紅花羊蹄甲(B.blakeana)、鐵刀木(Cassia siamea)、臘腸樹(C.f istula)、儀花(Lysidice rhodostegia)、鳳凰木(Delonix regia)、穗花棋盤腳(Barringtonia racemosa)、美花紅千層(Callistemon citrinus)、深山含笑(Michelia maudiae)、櫻花(Prunus serrulata)、紅樺銀樺(Grevillea banksii)、國(guó)慶花(Koelreuteria bipinnata)、澳洲火焰木(Brachychiton acerifolius)、紅花荷(Rhodoleia championii)。選擇地徑3.5 mm以上、株高20 cm以上、真葉展開8片以上的幼苗進(jìn)行試驗(yàn)。
1.2.1 抗寒性試驗(yàn) 低溫脅迫于2019年3月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候箱(HP1000GS型)內(nèi)進(jìn)行,光照強(qiáng)度為1 200 lx,光照時(shí)間為12 h,相對(duì)濕度保持在75%~85%。試驗(yàn)苗木表面灰塵洗凈后放入人工氣候箱內(nèi),以常溫(25 ℃)為對(duì)照,設(shè)9±1、6±1、3±1、0±1、-3(±1)℃等5個(gè)溫度梯度,以3 ℃/d降溫,當(dāng)溫度降至某一設(shè)定溫度時(shí),保持24 h,選擇第2~6展開葉進(jìn)行測(cè)定,3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)1個(gè)單株。取樣時(shí)間均為上午8:00,采樣后繼續(xù)降溫(表1)。
表1 抗寒試驗(yàn)人工氣候室降溫程序Table 1 Cooling procedure of cold resistance test in artificial climate chamber
1.2.2 抗旱性試驗(yàn) 采用PEG水分脅迫模擬干旱處理,每個(gè)樹種選取3株生長(zhǎng)一致的健壯苗木,3次重復(fù),以單株為1個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液和聚乙二醇6000(Polyethylene glycol 6000,PEG-6000)配制以下滲透勢(shì)的溶液:0 MPa(CK),-0.3 MPa(PEG-6000含量50 g/L),-0.5 MPa(PEG-6000含量150 g/L),-2.0 MPa(PEG-6000含量300 g/L)。苗木先在1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中過渡48 h,洗凈后放入不同滲透勢(shì)的PEG溶液中,進(jìn)行輕脅迫、中脅迫、強(qiáng)脅迫,每種脅迫分別處理12、24、36 h,以不加PEG的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液作對(duì)照。各處理均在室溫下進(jìn)行,室內(nèi)溫度為26 ℃左右,相對(duì)濕度為75%~85%。不同樹種相同指標(biāo)均選擇上午8:00同時(shí)取樣進(jìn)行測(cè)定。
1.3.1 電導(dǎo)率 取幼苗自上而下第2~6片展開葉,將葉片先用自來(lái)水輕輕沖洗除去表面的污物,然后用去離子水沖洗2遍,再用濾紙輕輕吸干葉片表面的水分,避開主葉脈,用打孔器打取3個(gè)直徑為0.8 cm的圓片,用去離子水沖洗3次,放入內(nèi)有20 mL去離子水的三角瓶中,室溫放置15 h,然后用電導(dǎo)儀(DDS-307型)在室溫下測(cè)定溶液的的電導(dǎo)率值(R),之后封住三角瓶口,在富華儀器有限公司生產(chǎn)的420型三用水箱中沸水浴30 min,以將組織全部殺死,冷卻至室溫后在同樣的條件下測(cè)定各瓶溶液的電導(dǎo)率值 (R1),以葉片殺死前的電導(dǎo)率占?xì)⑺篮箅妼?dǎo)率的百分?jǐn)?shù)表示膜的相對(duì)透性,計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率:
相對(duì)電導(dǎo)率(EC)=R/R1×100
1.3.2 相對(duì)含水量(RWC) 采樣稱取鮮葉質(zhì)量后用蒸餾水浸泡24 h,然后稱飽和鮮質(zhì)量,最后在105 ℃下烘8 h稱干質(zhì)量,計(jì)算RWC:
試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用R語(yǔ)言[14]agricolae程序包[15]和自編程序完成低溫處理下不同物種的生理指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析,對(duì)干旱處理的生理指標(biāo)進(jìn)行雙因素方差分析,并利用Duncan多重極差檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。將不同物種在5個(gè)溫度下的RWC和EC指標(biāo)值,使用NbClust程序包[16],利用k-means方法分別進(jìn)行聚類分析,并分別對(duì)比RWC和EC聚類結(jié)果的差異,提取出聚類有差異的物種進(jìn)行第二次k-means聚類分析。以不同干旱脅迫程度和不同時(shí)間的9個(gè)RWC和EC指標(biāo)值分別對(duì)各物種進(jìn)行聚類,分析過程與低溫試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析相同。選擇0℃時(shí)的RWC和EC作為抗寒能力排序的指標(biāo),選擇強(qiáng)干旱脅迫下處理36 h的RWC和EC作為抗旱能力排序的指標(biāo),利用TOPSIS方法對(duì)各物種的抗寒和抗旱能力進(jìn)行排序,首先利用R語(yǔ)言scale()命令對(duì)不同指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理,利用以下公式進(jìn)行排序指標(biāo)計(jì)算:
Ui=(ECi-ECMin)2+(RWCi-RWCMax)2
式中,ECi和RWCi分別為歸一化后各組數(shù)據(jù)的值,ECmin和RWCmax分別為歸一化處理后各數(shù)據(jù)的最小值和最大值,因EC與抗性呈負(fù)相關(guān),RWC與抗性呈正相關(guān),因此選擇ECmin和RWCmax作為標(biāo)準(zhǔn)。
基于試驗(yàn)測(cè)定,各物種不同逆境處理與對(duì)照條件下的生理指標(biāo)見表2、表3和表4,對(duì)照不同樹種RWC在79.1%~109.2%之間,隨著處理溫度的降低,低溫處理各RWC指標(biāo)逐步下降,其中大葉紫薇在-3 ℃處理后RWC值降至12.4%,為所有處理的最低值;對(duì)照EC在13.0%~39.8%之間,低溫處理中該指標(biāo)隨著溫度的降低而逐漸升高,以紅花荷在-3 ℃處理后EC值最高,達(dá)到85.4%。干旱處理RWC和EC與低溫處理呈相同的變化趨勢(shì),其中儀花在強(qiáng)干旱脅迫36 h后RWC值在所有檢測(cè)樣本中最低,降低至16.8%;所有樣本中,臘腸樹在干旱脅迫36 h后EC值最高,達(dá)到87.0%。
由表3、圖1可知,基于27個(gè)樹種的RWC和EC指標(biāo),計(jì)算k-means聚類數(shù)均為2類,即抗寒和不抗寒兩個(gè)類群,第一次聚類時(shí),小葉紫薇、大葉紫薇、黃槐、無(wú)憂樹、紅花羊蹄甲、儀花、紅花銀樺、國(guó)慶花8個(gè)物種在RWC和EC聚類中存在差異(圖1A、B),因此對(duì)上述8個(gè)物種進(jìn)行第二次聚類,RWC和EC重新聚類結(jié)果8個(gè)物種被分為兩類且結(jié)果相同(圖1C、D)。在兩次聚類中,聚類1各物種在降溫至6℃時(shí)平均EC變化曲線顯示其電導(dǎo)率有較大的提升,相對(duì)含水量明顯下降,而聚類2在降溫至0℃前電導(dǎo)率變化幅度較小,降至0℃后電導(dǎo)率才有顯著提升,相對(duì)含水量也是在溫度降至0℃之后才出現(xiàn)明顯下降。因此,認(rèn)為聚類1中的14個(gè)物種為不抗寒物種,聚類2中的13個(gè)物種為抗寒物種。
表2 27個(gè)物種低溫脅迫生理指標(biāo)變化情況Table 2 Changes in physiological indicators of 27 species under low-temperature stress
表4 27個(gè)物種抗寒聚類情況Table 4 Clustering of cold resistance of 27 species
圖1 27個(gè)物種低溫脅迫下生理指標(biāo)變化曲線與抗寒性聚類情況Fig.1 Physiological index change curve wder low-tempter ture stress and cold resistance ability clustering of 27 species
由表5可知,基于干旱試驗(yàn)中各物種的RWC和EC變化情況,利用Kmeans聚類結(jié)果顯示兩指標(biāo)的最優(yōu)聚類數(shù)均為2,且各聚類內(nèi)包含的物種完全相同。由圖2可知,不同程度干旱脅迫下,聚類2物種的RWC和EC隨著時(shí)間的變化均顯示出更為明顯的變化,而聚類1的兩指標(biāo)隨時(shí)間變化相對(duì)穩(wěn)定,且聚類2各物種的平均電導(dǎo)率高于聚類1、相對(duì)含水量低于聚類1。表明聚類1中17個(gè)物種為抗旱物種,聚類2中10個(gè)物種為不抗旱物種。
表5 27個(gè)物種抗旱聚類情況Table 5 Drought resistance ability clustering of 27 species
圖2 27個(gè)物種干旱脅迫下生理指標(biāo)變化曲線與抗旱能力聚類情況Fig.2 Physiological index change curve under drought stress and drought resistance clustering of 27 species
對(duì)RWC和EC表型進(jìn)行歸一化處理后求得各物種的U值,其中抗寒U值最大的物種為黃花風(fēng)鈴木(21.75),最小為杜鵑紅山茶(0),即杜鵑紅山茶抗寒能力最強(qiáng),黃花風(fēng)鈴木抗寒能力最弱;抗旱U值最大的物種為臘腸樹(30.50),最小為鐵刀木(0),即鐵刀木抗旱能力最強(qiáng),臘腸樹抗旱能力最弱。各物種抗寒能力與抗旱能力U值和排序見表6。基于各物種抗寒與抗旱能力的U值結(jié)果,以抗寒U值為橫坐標(biāo),抗旱U值為縱坐標(biāo),對(duì)所有物種的抗逆性進(jìn)行綜合評(píng)定(圖3),可見其物種抗逆能力的分布情況。評(píng)價(jià)結(jié)果顯示山茶科兩個(gè)物種、千屈菜科兩個(gè)物種均呈現(xiàn)對(duì)低溫和干旱較好的抗性,有較好的向寒冷和干旱地區(qū)推廣的潛力。
表6 27個(gè)物種抗寒和抗旱能力排名Table 6 Ranking of cold and drought resistance ability of 27 species
圖3 27個(gè)物種抗寒和抗旱能力綜合評(píng)定Fig.3 Comprehensive evaluation of cold and drought resistance of 27 species
植物葉片的電導(dǎo)率和相對(duì)含水量等生理指標(biāo)是反映植物脅迫抗性的最直觀的指標(biāo)[17-19]。研究表明,大多數(shù)常綠樹種難以長(zhǎng)時(shí)間耐受0 ℃以下的低溫脅迫,短時(shí)低溫脅迫可恢復(fù)生長(zhǎng)[20]。本研究中,溫度降低至6 ℃時(shí),不抗寒物種的生理指標(biāo)變化不明顯,并未出現(xiàn)較為嚴(yán)重的傷害;當(dāng)溫度降至3 ℃時(shí),抗寒物種與不抗寒物種的生理指標(biāo)開始產(chǎn)生明顯差異;所有物種在溫度降至0 ℃以下時(shí)生理指標(biāo)產(chǎn)生了明顯變化。因此,在種植非抗寒物種時(shí)應(yīng)注意避免6 ℃以下的低溫脅迫,種植抗寒物種時(shí)應(yīng)避免冰點(diǎn)以下脅迫,防止細(xì)胞液結(jié)冰造成細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的破壞,進(jìn)而形成不可逆的傷害,育苗階段可通過改善農(nóng)藝設(shè)施增加保溫裝置的方法完成。
干旱是植物面臨的常見脅迫,植物大量失水后,引起大部分生理代謝的紊亂,短時(shí)間內(nèi)即可造成嚴(yán)重的不可逆?zhèn)?,耿云紅[21]的研究表明植物葉片電解質(zhì)損失超過50%后,即使恢復(fù)水分供應(yīng),植物也將會(huì)受到永久損傷而無(wú)法完全恢復(fù)。本研究10個(gè)不抗旱物種的生理指標(biāo)顯示在中度和重度干旱脅迫條件下,24~36 h階段內(nèi),EC平均曲線快速升高,36 h后相對(duì)電導(dǎo)率均超過50%,RWC的平均變化曲線基本維持不變,說明這些物種在受到干旱脅迫24 h后已受到較嚴(yán)重的不可逆?zhèn)?,而抗旱樹種在干旱脅迫24 h后生理指標(biāo)變化趨緩,表明各樹種對(duì)脅迫產(chǎn)生了一定程度的適應(yīng)性。因此,在進(jìn)行木本花卉物種的苗期培育時(shí),應(yīng)使用完善的培育設(shè)施如溫室、噴灌或滴灌等,以保證充足的水分供應(yīng),不可使脅迫超過24 h,以免造成種苗的嚴(yán)重的損失。
k-means聚類方法是一種迭代求解的聚類分析算法[22],已被利用在各個(gè)研究領(lǐng)域的聚類問題中[23-25]。本研究中引入k-means統(tǒng)計(jì)方法對(duì)動(dòng)態(tài)變化的生理指標(biāo)進(jìn)行聚類用以推斷不同物種抵抗逆境的能力,取得了較好的效果,可以明顯看出對(duì)寒冷和干旱抗性差異明顯的物種在應(yīng)對(duì)脅迫中產(chǎn)生了不同的生理反應(yīng)過程,結(jié)合TOPSIS方法對(duì)各物種的抗寒和抗旱能力進(jìn)行綜合排序,可以明確不同物種的抗逆程度,對(duì)引種和栽培提供了有力的指導(dǎo)。
本研究結(jié)果表明,在不同的低溫脅迫和干旱脅迫下,27個(gè)物種的生理指標(biāo)呈現(xiàn)出顯著的差異,葉片電導(dǎo)率隨著脅迫程度的加重和脅迫時(shí)間的增加而增加,相對(duì)電導(dǎo)率則呈現(xiàn)相反的變化。根據(jù)k-means聚類和TOPSIS綜合比較法分析表明,13個(gè)物種為抗寒物種,其中杜鵑紅山茶抗寒能力最強(qiáng);17個(gè)物種為抗旱物種,其中鐵刀木抗旱能力最強(qiáng)。山茶科和千屈菜科物種呈現(xiàn)出較強(qiáng)的對(duì)低溫和干旱的綜合抗性;紫薇科和豆科類似,科內(nèi)的物種抗逆性差異較大;木棉科樹種抗旱能力較強(qiáng),抗寒能力較差。