朱朝輝，趙瑞麗，曾小玲，陳繼兵，徐同偉

（福州市蔬菜科學(xué)研究所，福建 福州 350111）

【研究意義】茄子（Solanum melongena）屬常異花作物，天然雜交率低，雜種優(yōu)勢明顯。但是采用常規(guī)雜交育種選育一個新品種所需群體大、年限較長、耗費大量人力物力、品種更新?lián)Q代慢。單倍體育種可以快速固定優(yōu)良性狀、縮短育種周期、獲得純合雙單倍體，而且還方便用于誘變突變體離體選擇和基因工程。獲得植株單倍體的方法很多，如配子體的離體誘導(dǎo)［1-2］、遠緣雜交［3］和單倍體誘導(dǎo)系［4］等，其中利用小孢子培養(yǎng)獲得純合雙單倍體植株是常用、有效的方法之一?！厩叭搜芯窟M展】1996年，Miyoshi［5］研究發(fā)現(xiàn)在不含糖的培養(yǎng)基中，茄子小孢子在35℃條件下3 d完成脫分化。連勇等［6］利用KM培養(yǎng)基對茄子體細胞融合的雜種小孢子進行培養(yǎng)，獲得大量再生植株。宋彥平等［7］以附加7.5%葡萄糖的KM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，對茄子雜交種單核靠邊期小孢子進行游離培養(yǎng)試驗獲得愈傷組織，但不同基因型之間小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著。朱朝輝等［8］采用不同培養(yǎng)基分段暗培養(yǎng)茄子游離小孢子方法獲得愈傷組織。佟曦然等［9］研究發(fā)現(xiàn)，不同游離方式獲得的茄子小孢子的發(fā)育途徑不同，經(jīng)擠壓法獲得的小孢子只形成愈傷組織，而采用自然散落法獲得的小孢子則產(chǎn)生胚狀體。范適等［10］研究結(jié)果顯示，基因型對小孢子誘導(dǎo)頻率影響大，對露地生長的花藥進行變溫處理有利于愈傷組織誘導(dǎo)?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關(guān)于茄子小孢子培養(yǎng)的研究主要集中在供體植株基因型、小孢子發(fā)育時期和預(yù)處理、植株生長環(huán)境、培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)方式、細胞學(xué)觀察等方面，但是二倍體茄子游離小孢子發(fā)育同步性差，小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率低、難分化成苗等因素制約著該技術(shù)的廣泛應(yīng)用［11］?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以二倍體茄子游離小孢子為材料，對影響小孢子發(fā)育同步性、愈傷組織誘導(dǎo)率、生長速度、活力、轉(zhuǎn)綠率（成熟）、芽分化的若干因素進行研究，以期建立一個再生頻率高的茄子游離小孢子再生體系，為茄子小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種中的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016－2018年在福州市蔬菜科學(xué)研究所進行，供試材料為荷蘭茄子品種HLB，采自本所試驗基地。選取長勢良好、無病蟲害的植株取樣，茄子小孢子的游離方法參考朱朝輝等［8］。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同培養(yǎng)方式對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 （1）靜止和振蕩培養(yǎng)對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。將游離出的茄子小孢子添加至N3液體培養(yǎng)基（參考朱朝輝等［8］進行改良）中25℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)過程采用以下方式多次添加培養(yǎng)基：A0，不添加（CK）；A1，直接添加；A2，先吸除部分原來培養(yǎng)基，再添加等體積新鮮培養(yǎng)基；A3，將原來培養(yǎng)基連同孢子、小愈傷組織一起均分兩皿，添加相應(yīng)體積新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)方式為黑暗振蕩培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速為80 r/min）和黑暗靜止培養(yǎng)，每個處理設(shè)置10皿，培養(yǎng)8 d時統(tǒng)計愈傷組織數(shù)量，并觀察其生長速度。

（2）培養(yǎng)基不同更換方式對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。在黑暗靜止培養(yǎng)條件下，比較多次添加N3培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)及生長的影響，設(shè)以下處理：B0，不添加培養(yǎng)基（CK）；B1，直接添加等體積培養(yǎng)基；B2，先吸除部分培養(yǎng)基，再添加等體積N3培養(yǎng)基；B3，先平均分成2皿，再添加N3培養(yǎng)基至原體積。每個處理設(shè)置5皿，每皿5個愈傷組織，每隔8 d添加1次，共添加2次。培養(yǎng)8、16、24 d時（添加前）統(tǒng)計新生愈傷組織數(shù)量，并觀察其生長速度，

1.2.2 愈傷組織大小及固液共培對其成活率和質(zhì)量的影響 分別將長至1～2 mm、2～4 mm、＞4 mm的愈傷組織接種至以下4種培養(yǎng)基中：M0（MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+36 g/L甘露醇）培養(yǎng)基、M1（M0+1 mL N3）培養(yǎng)基、M2（M0+2 mL N3）培養(yǎng)基、M3（M0+3 mL N3）培養(yǎng)基。每個處理接種5皿，每皿接種5個同類型愈傷組織，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計愈傷組織成活率。

1.2.3 不同誘導(dǎo)時間及培養(yǎng)基類型對愈傷組織分化的影響 （1）不同誘導(dǎo)時間對愈傷組織分化的影響。將培養(yǎng)16、24、32 d誘導(dǎo)獲得的＞2 mm的愈傷組織轉(zhuǎn)接至M2培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每個時間段誘導(dǎo)的愈傷組織均接種5皿，每皿5個，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計成活率。（2）不同甘露醇質(zhì)量濃度對愈傷組織轉(zhuǎn)綠（成熟）的影響。將＞2 mm的愈傷組織分別接種在添加0、18、36、54 g/L甘露醇的MS固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每個處理接種30瓶，每瓶接種1個愈傷組織，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計轉(zhuǎn)綠和變褐愈傷組織數(shù)量。（3）不同激素組合對愈傷組織芽分化的影響。將轉(zhuǎn)綠愈傷組織接種于附加不同激素的MS固體培養(yǎng)基中進行芽分化試驗，ZT、KT、NAA、IAA采用兩兩組合區(qū)組設(shè)計，共16個處理（表1），每個處理接種30瓶，每瓶接種1個愈傷組織，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計芽分化率。培養(yǎng)溫度25（±1）℃，光照時間14 h/d，光強3 000～4 000 lx。

表1 茄子小孢子愈傷組織芽分化的試驗設(shè)計Table 1 Test design of bud differentiation of eggplant microspores callus

1.2.4 再生植株倍性鑒定 從愈傷組織上分離2～3 cm的芽，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+NAA 5 mg/L+IAA 0.5 mg/L）中培養(yǎng)30 d分化出發(fā)達根系，形成完整植株。采用Accuri C6 Plus流式細胞儀鑒定再生植株的倍性。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003進行統(tǒng)計分析，采用SPSS 17.0進行極差分析，采用Duncan’s法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)方式對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.1.1 靜止和振蕩培養(yǎng)對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)對愈傷組織誘導(dǎo)和生長影響較大。振蕩培養(yǎng)條件下，不同處理間新生愈傷組織數(shù)量差異不顯著，平均0.2～0.6個/皿，且生長速度較快；靜止培養(yǎng)條件下，A1、A2、A3處理誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)量達3.2～3.8個/皿，顯著高于A0處理，且生長速度較快，A0處理誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)量為1.4個/皿（表2），其生長速度較慢。此結(jié)果顯示，靜止培養(yǎng)有利于茄子愈傷組織誘導(dǎo)，振蕩培養(yǎng)有利于愈傷組織生長。

2.1.2 培養(yǎng)基不同更換方式對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 在靜止培養(yǎng)條件下，N3培養(yǎng)基的不同更換方式和更換時間對茄子愈傷組織誘導(dǎo)率產(chǎn)生了顯著影響。第1次添加后，B0處理中愈傷組織生長緩慢，新增愈傷組織數(shù)量顯著低于B1、B2、B3處理。B1、B2、B3處理中愈傷組織的生長速度和新生愈傷組織數(shù)量差異均不明顯，表現(xiàn)愈傷組織生長快，平均每皿新生愈傷組織3.3～3.6個。第2次添加后，不同處理新生愈傷組織數(shù)量差異較大，B2和B3處理間差異不顯著，分別有3.6、3.4個/皿，但顯著高于B0（0.4個/皿）和B1（0.8個/皿）處理。第3次添加后，新生愈傷組織的數(shù)量只有B2處理是3.6個/皿，其他處理顯著降低。B0、B1處理第1次添加后新生愈傷組織數(shù)量顯著高于第2、3次添加，B2處理3次添加后新生愈傷組織數(shù)量差異不顯著，B3處理第1、2次添加后新生愈傷組織數(shù)量差異不顯著，顯著高于第3次添加。此結(jié)果顯示，多次部分更換新鮮培養(yǎng)基（B2處理）效果最好，表現(xiàn)為單皿誘導(dǎo)的愈傷組織總量增加（表3）。

表2 不同培養(yǎng)方式對愈傷組織發(fā)生及誘導(dǎo)的影響Table 2 Effect of different culture methods on callus formation and induction

2.2 愈傷組織大小及固液共培對其成活率和質(zhì)量的影響

本研究結(jié)果表明，茄子愈傷組織直接在固體培養(yǎng)基（M0）上分化培養(yǎng)時，成活的愈傷組織均呈白色緊實狀，其成活率與大小關(guān)系密切：1～2 mm的愈傷組織成活率只有34.67%，褐化死亡多；2～4 mm與＞4 mm的愈傷組織成活率差異不顯著，分別為85.33%和82.67%（表4）。

在固體培養(yǎng)基中添加N3液體培養(yǎng)基進行固液共培，愈傷組織成活率可達82%以上，且與其大小關(guān)系不大。但液體培養(yǎng)基的體積對愈傷組織質(zhì)量影響較大：當添加1～2 mL N3培養(yǎng)基進行固液共培時，愈傷組織緊實、呈白色；當添加的N3培養(yǎng)基大于2 mL時，愈傷組織成活率雖然較高，但呈透明水浸狀，這種愈傷組織在后續(xù)芽誘導(dǎo)過程中褐化死亡率高?？梢?，進行固液共培所添加的N3液體培養(yǎng)基以1～2 mL最適宜。

2.3 不同誘導(dǎo)時間及培養(yǎng)基類型對愈傷組織分化的影響

2.3.1 不同誘導(dǎo)時間對愈傷組織分化的影響 小孢子愈傷組織誘導(dǎo)時間對后期分化培養(yǎng)影響較大，培養(yǎng)16 d誘導(dǎo)的愈傷組織分化培養(yǎng)時成活率最高，達93.33%，與培養(yǎng)24 d的（86.00%）差異不顯著。培養(yǎng)16 d、24 d誘導(dǎo)的愈傷組織分化培養(yǎng)時成活率均顯著高于32 d，培養(yǎng)32 d誘導(dǎo)的成活率最低，為42.67%。

表3 新鮮培養(yǎng)基添加方式和次數(shù)對愈傷組織誘導(dǎo)和生長的影響Table 3 Effects of addition method and frequency of fresh culture medium on callus induction and growth

表4 愈傷組織大小及固液共培對其成活率和質(zhì)量的影響Table 4 Effects of callus size and solid-liquid co-culture on survival rate and quality of callus

2.3.2 不同甘露醇質(zhì)量濃度對愈傷組織轉(zhuǎn)綠（成熟）的影響 愈傷組織轉(zhuǎn)綠是進一步分化的前提，在固體培養(yǎng)基中添加適量甘露醇有利于其轉(zhuǎn)綠，在不含甘露醇的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時轉(zhuǎn)綠率僅52.00%；當甘露醇質(zhì)量濃度為18 g/L時，愈傷組織轉(zhuǎn)綠率為81.33%；甘露醇質(zhì)量濃度為36 g/L時，其轉(zhuǎn)綠率最高達94.64%；但甘露醇過高濃度會增加愈傷組織褐化數(shù)量，當甘露醇質(zhì)量濃度增高至54 g/L時，其轉(zhuǎn)綠率降為45.67%。

2.3.3 不同激素組合對愈傷組織芽分化的影響 在16種不同激素配方中，F(xiàn)6組合的芽分化率最高、達57.78%（表5），與其他組合的差異達到極顯著水平，芽分化率第二的是F5組合（36.66%），F(xiàn)10組合最低只有3.3%。觀察芽生長勢，F(xiàn)6組合芽長勢好，葉片呈綠色、舒展，莖節(jié)正常粗壯。因此，F(xiàn)6組合（ZT 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L）最適合茄子愈傷組織芽分化。

2.7 再生植株倍性鑒定

當芽長至2～3 cm即可從愈傷組織上分離，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+NAA 5 mg/L+IAA 0.5 mg/L）培養(yǎng)30 d，分化出發(fā)達根系，形成完整植株（圖1）。經(jīng)馴化、移栽成活率可達96%。本試驗獲得37株再生植株，采用流式細胞儀檢測出32株為二倍體，5株為單倍體。

圖1 愈傷組織分化及植株再生Fig.1 Callus differentiation and plant regeneration

3 討論

3.1 愈傷組織誘導(dǎo)的影響

茄子小孢子培養(yǎng)本身有一些機制尚不明確，小孢子發(fā)育同步性低，愈傷組織誘導(dǎo)率不高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，振蕩培養(yǎng)有利于小孢子愈傷組織生長，這與前人的結(jié)論［12-13］一致，但振蕩培養(yǎng)不利于愈傷組織誘導(dǎo)，而靜止培養(yǎng)條件下愈傷組織誘導(dǎo)率較高。培養(yǎng)基添加方式對愈傷組織誘導(dǎo)影響大，本試驗發(fā)現(xiàn)，在靜止培養(yǎng)條件下，采用部分更換方式添加N3培養(yǎng)基可以提高愈傷組織單皿誘導(dǎo)總量。隨著培養(yǎng)時間延長，有害物質(zhì)不斷積累［14］，處理B1和B3中新生愈傷組織數(shù)量迅速下降。B2采用部分更換培養(yǎng)基的方法，不但為細胞分裂提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，而且還減少或稀釋了培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)［15］，有利于新愈傷組織的誘導(dǎo)和生長，所以在2次更換培養(yǎng)基新生的愈傷組織數(shù)量基本穩(wěn)定。

固液共培時，添加1～2 mL N3液體培養(yǎng)基能使愈傷組織部分暴露在空氣中更容易獲得氧氣，成活率高，質(zhì)量好；當N3液體培養(yǎng)基體積達到3 mL以上時，茄子小孢子愈傷組織浸沒在液體中，獲得氧氣較少，含水量高，玻璃化趨重，降低愈傷組織質(zhì)量。這與袁素霞等［16］觀察到“結(jié)球甘藍（Brassica oleracea L.）和青花菜（Brassica oleraceaL.var.italicPlanch）小孢子胚在液體培養(yǎng)基中滯留時間越長、玻璃化程度越重”的結(jié)果相似。因此，添加1～2 mL N3培養(yǎng)基進行固液共培，是茄子小孢子愈傷組織分化培養(yǎng)的適宜方式。

3.2 愈傷組織分化的影響

添加較高質(zhì)量濃度的甘露醇可以提高培養(yǎng)基滲透壓，使愈傷組織生長緩慢、結(jié)構(gòu)致密，為分化積累必要營養(yǎng)物質(zhì)，從而提高轉(zhuǎn)綠（成熟）率，縮短分化時間。本研究中茄子愈傷組織在含36 g/L甘露醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時轉(zhuǎn)綠率最高，這與前人“培養(yǎng)基添加甘露醇可以提高馬鈴薯（Solanum tuberosum）原生質(zhì)體愈傷組織分化率、縮短分化期”的結(jié)果［17-18］一致。但過高質(zhì)量濃度的甘露醇（50 g/L）會造成培養(yǎng)基滲透壓過高，加重茄子愈傷組織褐化率，這與賴鐘雄［19］在龍眼（Dimocarpus longgana Lour）幼胚成熟培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)“較高濃度蔗糖有利幼胚成熟、但過高蔗糖濃度則會加重外植體褐變”的結(jié)果相似。

在不同激素處理中，ZT 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L的激素組合有利于茄子愈傷組織芽分化，這與連勇等［6］在茄子體細胞雜種游離小孢子培養(yǎng)研究中的結(jié)果有所不同，其原因可能是基因型、小孢子游離方法、培養(yǎng)環(huán)境等不同所致。

4 結(jié)論

通過對茄子游離小孢子培養(yǎng)體系進行優(yōu)化試驗，結(jié)果表明茄子游離小孢子在黑暗靜止條件下培養(yǎng)，愈傷組織的誘導(dǎo)效果較好；2次更換部分N3液體培養(yǎng)基可以獲得更多高質(zhì)量愈傷組織；添加1～2 mL N3液體培養(yǎng)基進行固液共培有利于愈傷組織生長和成活，但過多液體培養(yǎng)基會降低愈傷組織質(zhì)量；早誘導(dǎo)的愈傷組織分化培養(yǎng)成活率高；在添加36 g/L甘露醇的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)綠率最高，達94.64%；ZT 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L激素組合有利于愈傷組織芽分化，分化率達57.78%。