王曉春，楊天輝 ，王 川，楊煒迪，陳彩錦

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，銀川 750002;2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院固原分院，寧夏 固原 756000)

土壤的鹽堿化在世界范圍內(nèi)廣泛存在，包括鹽堿化和次生鹽堿化。如何開發(fā)利用現(xiàn)有的鹽堿化土地資源是當(dāng)今農(nóng)業(yè)發(fā)展和社會可持續(xù)發(fā)展的一大熱點。目前，有關(guān)鹽堿化土地的開發(fā)和利用大致分為生物和非生物2種措施，生物措施較非生物措施在改良和利用鹽堿地方面具有長效性和深度性。篩選、培育耐鹽堿植物就是一種有效的生物措施。苜蓿(MedicagosativaL.)被稱為“牧草之王”，具有產(chǎn)草量高、利用年限長、再生性強(qiáng)、適口性好、營養(yǎng)豐富等特點，其高效的生物固氮能力對鹽堿地改良利用十分有益，還可以給畜牧業(yè)提供優(yōu)質(zhì)飼草。但是生產(chǎn)中一直缺少適于鹽堿地栽培的耐鹽堿苜蓿品種，篩選和培育耐鹽堿能力強(qiáng)的品種對生態(tài)、經(jīng)濟(jì)等社會各個方面都具有重要意義。

耐鹽堿新品種選育常見的方法有引種篩選、雜交、轉(zhuǎn)基因等[1]。楊青川等認(rèn)為，可以通過較大強(qiáng)度的耐鹽脅迫進(jìn)行選擇與篩選，從而獲得耐鹽遺傳變異材料[2]。尹國麗等研究表明，種子在逆境脅迫下能否正常萌發(fā)及幼苗生長良好是植物存活的前提條件，是在某一地區(qū)形成自然群落的關(guān)鍵因素[3]。劉卓等認(rèn)為，單鹽毒害比復(fù)鹽大[4]。馬春平等研究認(rèn)為，低濃度NaCl溶液對苜蓿發(fā)芽勢影響較小，不易進(jìn)行耐鹽性鑒定[5]。本試驗在借鑒以上學(xué)者研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，以高濃度中性鹽NaCl溶液對前期經(jīng)低濃度鹽溶液鑒定的商業(yè)種子(以下均稱為父代種子)及其子一代種子(收種于鹽堿地種植的優(yōu)勢單株)開展培養(yǎng)箱內(nèi)的萌發(fā)期耐鹽性鑒定、評價，比較不同品種兩代種子的耐鹽性，分析探討苜蓿耐鹽性的遺傳變化規(guī)律，為篩選培育較耐鹽的苜蓿新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

15個苜蓿品種子一代種子來源于鹽堿地種植第3年的優(yōu)勢單株(選擇分枝數(shù)多、植株高大、葉片較大等特征)。鹽堿地土壤以灰鈣土、白疆土為主，鹽漬化嚴(yán)重，肥力偏低。春季土壤pH=8.5，全鹽5.4 g·kg-1。

1.2 試驗方法

設(shè)置NaCl溶液濃度分別為0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，以蒸餾水為對照(0)，共5個梯度，每個梯度3次重復(fù)。種子需先經(jīng)0.1%的升汞消毒10 min，蒸餾水沖洗3次，再經(jīng)75%酒精消毒5 min，再用蒸餾水沖洗3次，控干水分備用。每個品種選取大小一致、顆粒飽滿的50粒種子均勻放于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑10 cm)中，每皿加入鹽溶液10 mL，置于人工氣候箱內(nèi)(25 ℃恒溫，光暗培養(yǎng)16 h/8 h)萌發(fā)。發(fā)芽期間采用稱重法補(bǔ)水，每24 h補(bǔ)充每皿蒸發(fā)的水分，保持鹽濃度不變。種子發(fā)芽以胚根露白為標(biāo)準(zhǔn)[6]，每天觀察統(tǒng)計發(fā)芽情況，第10天結(jié)束試驗。

1.3 測定項目及方法

發(fā)芽勢(%)=(發(fā)芽脅迫試驗第4天正常發(fā)芽粒數(shù)/供試種子粒數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽脅迫試驗第7天正常發(fā)芽粒數(shù)/供試種子粒數(shù))×100%；

苗長：脅迫第10天，從每皿隨機(jī)選取10株，測量的幼苗拉直長度，

GI=∑Gt/Dt，Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；

VI= GI×S，GI為發(fā)芽指數(shù)，S為一定時期內(nèi)的幼苗長度[7-9]。

以上指標(biāo)的相對值為處理值與對照的比值。

耐鹽半致死濃度為相對發(fā)芽率為50%時的NaCl濃度，耐鹽致死濃度為相對發(fā)芽率為10%時的NaCl濃度[10]。

表1 供試材料來源

1.4 耐鹽性綜合評價

苜蓿種子萌發(fā)期耐鹽性采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評價。隸屬函數(shù)公式為：

X(μ)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，X為苜蓿某一萌發(fā)耐鹽指標(biāo)的測定值，Xmax和Xmin為該指標(biāo)的最大值和最小值[11-13]。

以不同鹽濃度脅迫下的相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對苗長、相對活力指數(shù)為耐鹽指標(biāo)，計算各項指標(biāo)隸屬函數(shù)值并排序，根據(jù)隸屬函數(shù)值大小綜合評價值不同品種兩代種子的耐鹽性，比較兩代種子品種間的耐鹽性大小，平均值越大，耐鹽性越強(qiáng)，反之，耐鹽性越弱。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)值均以平均值表示，用SPSS 18.0分析軟件對同一濃度下不同品種和同一品種不同濃度間各指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析(Duncan法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿父代種子與子一代種子發(fā)芽率、硬實率的分析比較

由圖1可見，所有供試品種父代種子的發(fā)芽率都高于子一代種子，硬實率都低于子一代種子，發(fā)芽率的高低由種子硬實影響。苜蓿種子硬實是一種普遍存在的現(xiàn)象[14]。本試驗中兩代種子都存在硬實情況，但兩代種子硬實率差異明顯。父代種子的硬實率極低，平均硬實率僅為1.4%，對發(fā)芽結(jié)果影響很小。子一代種子硬實率普遍較高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于父代種子，最高的種子硬實率達(dá)到42.8%。子一代種子的硬實率對發(fā)芽結(jié)果的影響較大。

圖1 苜蓿各品種父代種子與子一代種子發(fā)芽率、硬實率比較

2.2 高濃度鹽脅迫下苜蓿父代種子及其子一代種子相對發(fā)芽勢、發(fā)芽率的分析比較

發(fā)芽勢反映了種子的發(fā)芽速度和整齊度，主要測試種子生命力的強(qiáng)弱。因為種子硬實的影響，以相對發(fā)芽勢、發(fā)芽率評價種子的發(fā)芽能力。供試的15個苜蓿品種父代種子及其子一代種子在高濃度鹽脅迫下，隨著NaCl濃度的升高，相對發(fā)芽勢均下降。在0.8%NaCl脅迫下，父代種子大多數(shù)品種依然保持著較高的發(fā)芽勢，除了3個品種，相對發(fā)芽勢都在80%以上，其中有7個品種相對發(fā)芽勢高于90%。而子一代種子的相對發(fā)芽勢，大于80%的有9個品種，高于90%的只有1個品種；在1.0%NaCl濃度脅迫下，父代種子相對發(fā)芽勢在80%以上的有6個品種，其中南苜501、中苜1號的相對發(fā)芽勢依然在95%左右。而子一代種子相對發(fā)芽勢保持在80%以上的只有阿迪娜和德國大葉2個品種，其中有3個品種的相對發(fā)芽勢只有13.1%、14.6%和0。子一代種子大多數(shù)品種(11個)的相對發(fā)芽勢與上一濃度梯度相比，急劇下降，最高的下降了84.6%，下降幅度大于父代種子。在1.2%NaCl脅迫下，父代種子依然有9個品種保持相對較高的相對發(fā)芽勢，有4個品種相對發(fā)芽勢低于50%。而子一代種子相對發(fā)芽勢高于50%的只有3個品種，且值偏低，其余12個品種相對發(fā)芽勢則更低；在1.4%NaCl脅迫下，父代種子相對發(fā)芽勢除了中苜1號(79.5%)和DS 310 FY(68.3%)的較高外，其余13個品種的相對發(fā)芽勢都低于50%，其中高于10%的有8個品種，而子一代種子低于10%的有11個品種，其余4個品種相對發(fā)芽勢維持在10%～20%之間。歸納得出：有2個品種的子一代種子高于父代種子；有2個品種的2代種子的相對發(fā)芽勢差異不顯著；有1個品種在0.8%NaCl濃度下，父代種子略低于子一代，但在1.0% NaCl濃度脅迫下，又低于父代種子。由此可見，在同濃度鹽脅迫下，多數(shù)品種子一代種子相對發(fā)芽勢低于父代種子，并且差距較大。

種子的發(fā)芽率是苜蓿萌發(fā)期耐鹽能力的直接表現(xiàn)，是衡量苜蓿耐鹽性的關(guān)鍵指標(biāo)。各品種父代種子及其子一代種子相對發(fā)芽率變化規(guī)律同相對發(fā)芽勢。在0.8%的NaCl濃度脅迫下，供試品種的父代種子相對發(fā)芽率都保持在87%以上，比絕大多數(shù)子一代種子(9個品種)相對發(fā)芽率高，而子一代種子相對發(fā)芽率均值為76.9%；在1.0%的NaCl濃度脅迫下，各品種父代種子相對發(fā)芽率均值下降為80.1%，子一代種子僅為42.9%，下降幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于父代種子。子一代種子相對發(fā)芽率低于50%有10個品種，而父代種子只有1個品種，可見，1.0%NaCl濃度是子一代大多數(shù)品種的半致死濃度；在1.2%的NaCl濃度脅迫下，父代種子相對發(fā)芽率均值下降為62.6%，子一代種子僅為29%。相對發(fā)芽率低于50%的父代種子有4個品種，子一代品種有13個；在1.4%的NaCl濃度脅迫下，父代種子相對發(fā)芽率平均為37%，其中有3個品種相對發(fā)芽率依然較高。而子一代種子平均相對發(fā)芽率只有9.5%?？梢姡?.4%的NaCl濃度是父代種子大多數(shù)品種(11個)的半致死濃度，是子一代種子大多數(shù)品種(10個)的致死濃度。在各個鹽濃度下，各品種兩代種子相對發(fā)芽率變化無對應(yīng)關(guān)系。

2.3 在高濃度鹽脅迫下，脅迫時間對苜蓿父代種子及其子一代種子萌發(fā)的影響

鹽脅迫抑制苜蓿種子的萌發(fā)時間。無鹽脅迫下(0)，兩代種子15 h后均有種子萌發(fā)，但隨鹽濃度升高，種子萌發(fā)時間依次推遲。在相同鹽濃度下，父代種子各品種7 d時的相對發(fā)芽率比4 d時的相對發(fā)芽率(勢)有增加或不變，說明種子依然有活力。但隨著脅迫時間的增加(≥7 d時)，在高濃度鹽的脅迫下，已發(fā)芽的苗都會出現(xiàn)不同程度毒害表現(xiàn)，苗較長的植株出現(xiàn)根斷、干或腐軟等現(xiàn)象(圖2)，芽較短的苗則表現(xiàn)出發(fā)軟等失活現(xiàn)象(圖3)。隨著鹽濃度和脅迫時間的增加，受毒害的苗比例會增加。當(dāng)脅迫10 d時，苗較長的植株，雖然根斷或根失活，但部分苗看起來還有生活力，一旦解除鹽脅迫，會從根頸處發(fā)出新的側(cè)根，從而恢復(fù)生命力。而較短的幼苗或幼芽則會完全變軟失活，死亡。

圖3 芽較短的種苗在高濃度鹽脅迫下發(fā)軟、失活

圖2 健壯植株的根在高濃度鹽脅迫下干、斷或腐軟

子一代種子發(fā)芽形態(tài)變化與父代種子相同，但耐受鹽脅迫的時間更短。5 d時，毒害作用就開始顯現(xiàn)，尤其是在芽較短的苗上。子一代種子有的品種在7 d時的相對發(fā)芽率比4 d時的相對發(fā)芽率(勢)低，也驗證了這個結(jié)果。隨著脅迫時間增加，子一代種子比相同濃度、脅迫時間的父代種子受到的毒害作用更大，因為子一代種子的苗弱于父代種子，所以耐鹽能力就弱于父代種子。而相同脅迫濃度、時間下幼苗的強(qiáng)弱可以通過苗長反映。實際生產(chǎn)大田土壤的鹽度也是變化的，會隨著降雨或者灌水等有所下降，所以評價苜蓿種子的耐鹽能力也應(yīng)該結(jié)合苗的長勢(苗長)。

2.4 苜蓿父代種子及其子一代種子在高濃度鹽脅迫下苗長的分析、比較

10 d時，測量已發(fā)芽幼苗的胚根、胚芽長度時，發(fā)現(xiàn)在設(shè)置的4個鹽濃度脅迫下，胚軸較長的苗都有胚根斷或腐的情況存在，但部分苗還有活力，可以發(fā)出新的側(cè)根，所以以未失活苗整個苗長數(shù)據(jù)比較不同品種的兩代種子的耐鹽能力，而不是傳統(tǒng)的胚根。苗長越長，其耐鹽能力就相對較強(qiáng)。當(dāng)NaCl濃度為1.2%時，子一代種子發(fā)芽苗基本全部失活，無有效苗長數(shù)據(jù)。而在1.4% NaCl濃度下，父代種子多數(shù)品種發(fā)芽幼苗也多數(shù)失活，數(shù)據(jù)不具有普遍性，為無效數(shù)據(jù)。統(tǒng)計結(jié)果見表2。

由表2可見，隨著NaCl濃度的增加，各品種父代及其子一代發(fā)芽的幼苗生長均受到抑制，長度逐漸下降。在0.8%NaCl濃度脅迫下，與對照(0)相比，在1.0% NaCl濃度脅迫下與0.8% NaCl濃度脅迫相比，均表現(xiàn)為苗長下降，子一代種子苗長下降幅度大于父代種子。NaCl濃度為1.2%時，父代種子有3個品種的苗受到鹽溶液毒害，多數(shù)失活，但其他品種已發(fā)芽苗里大多數(shù)苗依然有活力，而子一代發(fā)芽苗則全部失活。且父代種子發(fā)芽苗大于30 mm的品種有4個(鹽寶，德國大葉，耐鹽，中苜1號)?？梢姡诓煌}濃度脅迫下，兩代種子已發(fā)芽苗長在品種上無對應(yīng)關(guān)系。

表2 各苜蓿品種父代種子與子一代種子在高濃度NaCl脅迫下的苗長 單位：mm

2.5 苜蓿父代種子及其子一代種子萌發(fā)期耐鹽性綜合評價

以隸屬函數(shù)值對兩代種子萌發(fā)期耐鹽性進(jìn)行綜合評價(表3)，通過排序得出父代種子耐鹽性由大到小品種依次為：DS 310 FY，中苜1號，耐鹽，德國大葉，南苜501，鹽寶，中苜3號，隴東，皇后2000 R，巖石，阿迪娜，三得利，甘農(nóng)3號，龍牧801，WL 343 HQ，這個結(jié)果與在較低鹽濃度下的鑒定結(jié)果基本一致[15]；子一代品種依次為：德國大葉，WL 343 HQ，耐鹽，鹽寶，阿迪娜，龍牧801，巖石，皇后2000 R，三得利，南苜501，中苜3號，中苜1號，甘農(nóng)3號、DS 310 FY，隴東。兩代種子耐鹽能力品種間無對應(yīng)關(guān)系(|r|<0.3)。

表3 苜蓿各品種父代種子與子一代種子萌發(fā)期耐鹽性各指標(biāo)隸屬函數(shù)值及綜合評價值

3 討 論

3.1 高濃度鹽對苜蓿種子萌發(fā)的影響

本研究參考王曉春等[16]的方法，以0.8%NaCl濃度為起點，開展苜蓿父代種子及其子一代種子耐鹽脅迫鑒定比較試驗。兩代種子在發(fā)芽率上差異明顯，子一代種子發(fā)芽率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于父代種子，這個差異是由子一代種子具有較高的硬實率造成的。目前，對于種子硬實現(xiàn)象成因的定論說法不一，形成的原因尚無確切定論[17]。但因本試驗中子一代種子采自鹽堿地苜蓿植株，土壤鹽堿度都較高，且較貧瘠，所以分析土壤條件不良是造成子一代種子硬實率高的可能原因。

隨著NaCl脅迫濃度的升高，苜蓿父代種子及子一代種子的相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、苗長等指標(biāo)均下降，但子一代種子下降的幅度比父代種子大，并且在相同鹽濃度脅迫下，絕大多數(shù)父代種子的相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、苗長高于子一代種子，說明父代種子比子一代種子更耐鹽，并且子一代種子與父代種子耐鹽性在品種間無相對應(yīng)的變化關(guān)系。這個結(jié)果有可能是品種內(nèi)個體差異引起，因為本試驗子一代種子均為單株種，而父代種子為混合種。楊青川等研究表明：苜蓿品種間耐鹽性差異不顯著，而品種內(nèi)植株差異明顯[2]?？赡芤驗樽右淮N子是單株種子，不能代表子一代種子品種共性。

3.2 高濃度鹽脅迫下脅迫時間對苜蓿種子萌發(fā)的影響

在高濃度NaCl脅迫下，隨著脅迫時間的增加，很多已發(fā)芽苗出現(xiàn)根斷、腐等受毒害表現(xiàn)，說明鹽脅迫對根的傷害大于芽、莖，這與王靜等[18]的試驗結(jié)論一致。目前雖然已有大量的有關(guān)苜蓿萌發(fā)期耐鹽脅迫的研究，但關(guān)于多長時間苗開始受到鹽溶液毒害及毒害作用機(jī)理的研究報道卻相對較少。相同脅迫時間對生活力強(qiáng)的種子毒害作用小于生活力弱的種子。在相同鹽濃度脅迫下，子一代種子相對發(fā)芽勢低于父代種子，子一代種子發(fā)芽苗弱于父代種子發(fā)芽苗，受毒害的程度更重，失活種子比例多于父代種子。說明在相同鹽濃度、脅迫時間下，子一代種子的耐鹽能力弱于父代種子。

3.3 苜蓿耐鹽性的探究

在高濃度鹽脅迫下，受鹽毒害影響較小、耐受時間長或者成活的材料就是育種家要篩選的突變或者耐鹽材料。這種耐鹽種質(zhì)是培育耐鹽品種的重要材料基礎(chǔ)。提高苜蓿的耐鹽性，對耐鹽種質(zhì)及變異材料篩選十分必要。植物種子萌發(fā)和幼苗生長是植物生長最脆弱的階段，對土壤鹽堿的影響最敏感，隨著根系及植株的生長發(fā)育，耐鹽堿能力逐漸增強(qiáng)，所以這個階段是植物建植成敗的關(guān)鍵時期[19,20]。本試驗選擇萌發(fā)期，以鹽堿地生產(chǎn)性狀突出的苜蓿植株的后代，和父代種子開展不同品種的種子耐鹽(NaCl)脅迫，結(jié)果表明，子一代種子的耐鹽性差于父代種子，并且兩代種子品種在耐鹽性上無對應(yīng)關(guān)系。楊青川等認(rèn)為，苜蓿具有通過選擇增加耐鹽性的遺傳潛力，經(jīng)過數(shù)代選擇，勢必會增加群體的耐鹽性[2]。但本試驗結(jié)果卻反映子一代種子在耐鹽性上不但沒有超過父代種子，還較父代種子差。苜蓿耐鹽性屬于數(shù)量遺傳，受基因與環(huán)境的影響[21]。本試驗選擇的材料是鹽堿地里健壯突出的單株，經(jīng)開放授粉后收種，主觀上側(cè)重于生產(chǎn)性狀。但在大田栽培中，抗逆性與豐產(chǎn)性通常成反比，側(cè)重于生產(chǎn)，勢必會影響抗逆性的篩選，從而造成子一代種子的耐鹽遺傳能力不突出。其次兩代種子來源地不同，子一代種子來源于鹽堿重，較貧瘠，地力差的大田，而父代種子為商業(yè)種子，采收于種子田，這種差距勢必會造成子一代種子生活力弱于父代種子。而生活力強(qiáng)的種子抵御鹽堿毒害的能力更強(qiáng)，更耐鹽，國內(nèi)外都已有報道[22,23]，證實施肥可以增加作物的耐鹽性。

4 結(jié) 論

對兩代種子15個品種開展萌發(fā)期耐鹽脅迫，通過對各耐鹽指標(biāo)的分析、比較，得出子一代種子耐鹽性弱于父代種子，并且耐鹽性在品種間無對應(yīng)關(guān)系。苜蓿耐鹽遺傳潛力主要受遺傳背景的多樣性、生理過程的復(fù)雜性、逆境因子的多變性及各種因素的相互作用的綜合影響，要掌握苜蓿耐鹽遺傳潛力，必須從苜蓿種子的背景來源，生長的不同階段的耐鹽性，以及大量的材料，開展幾個世代系統(tǒng)的深入研究。