許瑞， 南小龍， 蔣國清， 覃金寧， 何友宇， 熊作勝， 姜必廣， 王賓海， 李騫*

1. 中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410083；

2. 湖南省核工業(yè)地質(zhì)局三0六大隊(duì)，湖南 長沙 410083

引 言

銻(Sb)廣泛存在于土壤、水體和大氣中。Sb在環(huán)境中可以以四種價(jià)態(tài)(-III、0、III和V)存在，其中Sb(III)和Sb(V)是最普遍的。在好氧環(huán)境中，Sb(V)為優(yōu)勢種，主要以Sb(OH)6-的形式存在；在缺氧條件下以Sb(III)為主，主要以Sb(OH)3的形式存在[1]。此外，Sb也以有機(jī)化合物(甲基化物種)形式存在[2]。Sb是生物體內(nèi)一種非必需的有毒微量類金屬元素。長期暴露在高濃度的Sb污染環(huán)境中會產(chǎn)生一系列人類健康風(fēng)險(xiǎn)，人體攝入過量Sb可能會導(dǎo)致嘔吐、腹瀉、皮疹、心臟和呼吸道等疾病[3,4]。因此，Sb及其化合物已被美國環(huán)境保護(hù)署(EPA)和歐盟委員會(CEC)列為重點(diǎn)污染物[5]。

環(huán)境中的Sb污染是由自然和人為活動(dòng)造成的。自然來源包括火山活動(dòng)和含Sb地殼巖石和礦物的風(fēng)化[6]；人為活動(dòng)來源主要是采礦和冶煉[7]。此外，Sb也被廣泛用于制造阻燃劑、輕武器彈藥、半導(dǎo)體、二極管、電池、合金、顏料和催化劑等，從而加速了Sb到環(huán)境中的釋放[3]。全球每年Sb產(chǎn)量超過1.3×106t，主要生產(chǎn)國為中國、俄羅斯、塔吉克斯坦和玻利維亞等。

圖1顯示了近5年來世界各國Sb儲量。中國作為全球最大的Sb生產(chǎn)國，擁有世界上最豐富的Sb資源，包括114個(gè)Sb礦[8]，約占全球Sb總儲量的52%。我國Sb資源儲量最大的省份是湖南，該省冷水江市錫礦山是全球最大的Sb礦，Sb年產(chǎn)量占全國的三分之一，素有“世界銻都”之稱。總體來說，我國Sb污染土壤中主要集中在采礦和冶煉領(lǐng)域。例如，錫礦山已開采多年，大量的廢水、礦渣和堿渣被排放到附近環(huán)境中，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)破壞[8]。因此，開發(fā)高效、環(huán)保的Sb污染土壤修復(fù)技術(shù)已成為近年來國內(nèi)外研究者研究的熱點(diǎn)。

圖1 世界各國Sb儲量(數(shù)據(jù)來源：美國地質(zhì)調(diào)查局，USGS)

目前，我國污染土壤修復(fù)技術(shù)體系主要由物理、化學(xué)和生物修復(fù)技術(shù)組成，主要包括化學(xué)法(土壤淋洗、固化/穩(wěn)定化、氧化/還原、離子拮抗等)[9-12]，物理法(電動(dòng)修復(fù)、熱處理等)[13,14]和生物法(植物修復(fù)，微生物修復(fù)等)[15,16]。雖然物理化學(xué)法具有周期短、操作簡單、適應(yīng)范圍廣等優(yōu)勢，但也存在成本高、二次污染、對土壤擾動(dòng)大等不足，故而不能廣泛應(yīng)用。生物技術(shù)由于其低成本、可持續(xù)、環(huán)境友好等特點(diǎn)，在Sb污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用越來越受到重視，尤其是微生物介導(dǎo)法[17]。微生物群落是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最具多樣性和優(yōu)勢的生物類群。據(jù)報(bào)道，微生物的代謝活動(dòng)負(fù)責(zé)周期表中大約1/3元素的轉(zhuǎn)化[18]。盡管Sb具有毒性，但許多微生物仍能在Sb污染的環(huán)境中生存和繁衍。Luo等[19]利用宏基因組學(xué)和PCR技術(shù)對As和Sb污染土壤中微生物基因的表達(dá)進(jìn)行了表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與As和Sb循環(huán)相關(guān)的功能基因(如arsC、arrA、aioA和arsB)的分布、多樣性和豐度與As和Sb濃度呈正相關(guān)。Majzlan等[20]在富含Sb的尾礦中發(fā)現(xiàn)Sphingomonas，Caulobacter，Janthinobacterium，Geobacter，Rhodoferax和Sulfuricurvum等多個(gè)菌屬具有較高的豐度。此外，有些細(xì)菌可以通過微生物氧化還原Sb獲得能量并支持其生長[21]。上述結(jié)果表明，微生物對Sb具有耐受性，其可能在Sb的生物地球化學(xué)循環(huán)中起著關(guān)鍵作用。雖然Sb和As在毒理學(xué)、物理和化學(xué)性質(zhì)上有一些相似之處，但對Sb生物轉(zhuǎn)化的研究仍然非常有限。另外，目前還不清楚Sb污染環(huán)境中地球化學(xué)因素對Sb行為的影響。因此，了解土壤理化性質(zhì)對Sb行為的影響以及微生物與Sb的相互作用機(jī)制，對于進(jìn)一步開發(fā)Sb污染土壤的微生物修復(fù)策略具有重要意義。

近年來大多數(shù)綜述文章都集中在環(huán)境中Sb的毒理性和生物利用度等方面，關(guān)于微生物與Sb相互作用的分子機(jī)制的綜述較少。本綜述的主要內(nèi)容如下: (1) 概述了土壤理化性質(zhì)對Sb 遷移轉(zhuǎn)化行為的影響；(2) 介紹了Sb對土壤生物的毒性效應(yīng)；(3) 討論了微生物對Sb的抗性及解毒機(jī)理；(4) 分析了Sb污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)及機(jī)理。

1 土壤理化性質(zhì)對Sb遷移轉(zhuǎn)化行為的影響

土壤重金屬的行為(遷移、轉(zhuǎn)化、生物利用度和毒性等)與土壤理化性質(zhì)(如pH、氧化還原電位及其他無機(jī)或有機(jī)物等)密切相關(guān)[22]。因此，了解土壤理化性質(zhì)如何影響Sb的形態(tài)轉(zhuǎn)化、吸附和遷移對于準(zhǔn)確評估Sb污染土壤的風(fēng)險(xiǎn)及生物修復(fù)Sb污染土壤具有重要指導(dǎo)意義。

在含氧或輕度還原土壤系統(tǒng)中，Sb(III)熱力學(xué)不穩(wěn)定，Sb主要以Sb(V)的形式存在[23]。這主要是由于Sb污染土壤系統(tǒng)中通常存在鐵錳(氫)氧化物發(fā)生氧化作用或溶解態(tài)硫化物緩慢的還原動(dòng)力學(xué)及絡(luò)合作用[24]。在缺氧土壤系統(tǒng)中，Sb(III)占主導(dǎo)地位[25]。此時(shí)，微生物逐漸被迫選擇能量較低的末端電子受體進(jìn)行呼吸反應(yīng)[2]。Mitsunobu等[26]考察了日本某尾礦土壤水中Sb的氧化形態(tài)。研究表明，Sb以Sb(V)的形式存在，其氧化電位范圍分布廣泛(Eh = 360 ～ 140 mV, pH 8)；Sb與土壤中含F(xiàn)e物質(zhì)豐度呈正相關(guān)，土壤中Sb的主相為Fe(III)氫氧化物。綜上，Sb(III)更容易在較低的Eh值下被氧化為Sb(V)，Sb(V)在好氧環(huán)境中比Sb(III)更穩(wěn)定。Steely等[27]研究了靶場土壤和被砷酸鉛農(nóng)藥污染的蘋果園土壤中Sb(III) 和Sb(V)與腐殖酸(HA)之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sb會與HA發(fā)生絡(luò)合作用，HA具有阻止Sb在土壤中遷移的能力，且有利于Sb(III)轉(zhuǎn)化為毒性較小的Sb(V)。Karimian等[28]指出在有機(jī)物質(zhì)存在的還原條件下，F(xiàn)e(II)的生成可能導(dǎo)致初始亞穩(wěn)態(tài)HA-Sb(V)-Fe(III)相迅速轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的相，從而降低了土壤中Sb的遷移率。此外，在土壤系統(tǒng)中，Sb(V)的遷移率在很大程度上受pH的影響[29]，即Sb(V)的遷移率在較高的pH值下增加。這主要是由于土壤中的Sb(OH)6-陰離子與黏土、鐵或鋁的含水氧化物和有機(jī)質(zhì)的表面負(fù)電荷基團(tuán)之間存在靜電排斥現(xiàn)象。

金屬氧化物是土壤中一類重要的礦物，通常具有納米尺寸，對金屬污染物的反應(yīng)活性較高。針鐵礦廣泛存在于土壤和沉積物中，其對有毒金屬(膠體)在環(huán)境的轉(zhuǎn)化和遷移起著重要作用[30]。Fan等[30]考察了溶液pH、針鐵礦含量、HA等環(huán)境因素對光誘導(dǎo)亞銻酸鹽氧化的影響。結(jié)果表明，在光照條件下，亞銻酸鹽可被針鐵礦吸附和氧化，從而降低了環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。Tighe和Lockwood[31]報(bào)道了在pH值為2.5～7時(shí)，95%的Sb (V)會被非晶形氫氧化鐵吸附，pH值在4左右時(shí)達(dá)到最大吸附量。同樣，赤鐵礦的表面結(jié)合位點(diǎn)對Sb (V)的吸附能力較強(qiáng)，在pH 4時(shí)吸附能力最強(qiáng)[32]。此外，有機(jī)物可能通過競爭吸附位點(diǎn)、靜電作用和形成絡(luò)合物影響金屬的遷移率[33]。據(jù)報(bào)道，土壤中存在的金屬(氫)氧化物對Sb具有很強(qiáng)的吸附能力，且吸附能力強(qiáng)弱依次為MnOOH >Al(OH)3>FeOOH。吸附過程中，pH對Sb吸附程度影響較大，在酸性條件下吸附效果較好。隨著pH值增加到6以上，吸附量逐漸減少[2]。當(dāng)pH值低于6時(shí)，超過80%的Sb (III)被上述三種物質(zhì)固定[34]。同時(shí)，陽離子和陰離子的存在可以通過影響金屬濃度和pH等促進(jìn)或抑制Sb吸附[35,36]。利用光譜技術(shù)與DFT 計(jì)算相結(jié)合已發(fā)現(xiàn)一些吸附體內(nèi)部復(fù)合物的形成，如水合氧化鐵對Sb的吸附主要以單齒單核與雙齒雙核兩種構(gòu)型存在[37,38]；Sb(V)主要吸附于水鈉錳礦邊緣位點(diǎn)，形成單齒單核絡(luò)合構(gòu)型[39]；鋁氫氧化物吸附Sb的構(gòu)型為雙齒雙核[40]。這些吸附復(fù)合體在環(huán)境中非常穩(wěn)定，很難解吸[41]。此外，缺氧環(huán)境下，錳的氧化物可以氧化Sb (III)，反應(yīng)過程可以表示為[42]：

MnO2+Sb(OH)3+H2O→Mn(OH)2+H3SbO4

(1)

Bagherifam等[43]發(fā)現(xiàn)，天然的錳氧化物能夠降低農(nóng)業(yè)土壤中Sb的流動(dòng)性和生物利用度。Xu等[44]發(fā)現(xiàn)氧化錳的主要作用是將Sb(III)氧化為Sb(V)，而氧化鐵的主要作用是吸附Sb(V)。Fu等[45]利用X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)(XAFS)研究了氧化錳(IV)在土壤中對Sb(III)的氧化作用，發(fā)現(xiàn)氧化錳(IV)在氧化Sb(III)過程中起著重要作用。Belzile等[42]發(fā)現(xiàn)無論是天然的還是合成的Fe氫氧化物，都可以在短時(shí)間內(nèi)有效地將全部Sb(III)轉(zhuǎn)化為Sb(V)。然而，在氧化過程中，微生物并沒有發(fā)揮重要的催化作用，而是在Fe氫氧化物表面進(jìn)行了電子的非生物轉(zhuǎn)移?？傮w反應(yīng)可以表示為：

2Fe(OH)3+Sb(OH)3→2Fe(OH)2+H3SbO4+H2O

(2)

如圖2所示, 可能的反應(yīng)機(jī)制可概括為：(1) Fe(III)氫氧化物吸附亞銻酸鹽并在其表面形成一個(gè)復(fù)合體(一個(gè)Sb(III)占據(jù)兩個(gè)Fe(III)位點(diǎn))；(2) Sb的兩個(gè)電子轉(zhuǎn)移到Fe原子上；(3)氧化Sb(V)和還原Fe(II)的釋放。因此，土壤中天然存在的鐵錳等(氫)氧化物對Sb的吸附和氧化是一種天然的解毒過程。

圖2 Sb(III)吸附，電子轉(zhuǎn)移及Sb(V)和Fe(II)吸附反應(yīng)示意圖[41]

綜上所述，土壤氧化還原電位會影響Sb在土壤中的存在價(jià)態(tài)，進(jìn)而影響Sb的毒性和溶解度；土壤有機(jī)質(zhì)(腐殖質(zhì))和金屬(氫)氧化物可以氧化或固定Sb, 從而在一定程度上降低了Sb的活性和遷移能力；土壤pH 值可以促進(jìn)金屬(氫)氧化物對Sb的吸附固定。因此，研究不同地區(qū)、不同土壤類型中Sb及其化合物與土壤中礦物和有機(jī)物之間的平衡關(guān)系以及不同土壤條件(pH、氧化還原電位等)下Sb的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律，可以為有效地選擇和使用Sb污染土壤修復(fù)的方法提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

2 Sb對土壤微生物的毒性效應(yīng)

Sb進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)后，會通過Sb自身的毒性作用或與土壤多介質(zhì)組分的交互作用，對土壤生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成污染脅迫。微生物過程在維持土壤功能和健康方面起著關(guān)鍵作用，但微生物過程對環(huán)境因子的變化極其敏感[46]。Sb的遷移率和毒性很大程度上取決于其氧化形態(tài)[22]。因此，微生物轉(zhuǎn)化Sb可以影響Sb在土壤環(huán)境中的毒性；同樣，Sb又會對微生物產(chǎn)生生態(tài)效應(yīng)(如生物量、基本呼吸速率、酶活性、群落結(jié)構(gòu)和生化過程等)，而負(fù)面生態(tài)效應(yīng)會導(dǎo)致土壤微生物多樣性失衡，從而影響土壤功能[47,48]。許多研究已經(jīng)證明, 土壤酶活性可以作為重金屬污染物不利影響的敏感指標(biāo)[49,50]。例如，Sb會影響土壤氮循環(huán)，主要表現(xiàn)為脲酶和脫氫酶活性的下降[51]。研究表明，Sb(III)會影響A.tumefaciensGW4 的Ars抗性、Sb(III)氧化酶AnoA、磷酸鹽代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝以及脂類、嘌呤和氨基酸的代謝[3]。此外，Sb(III)對巰基有很強(qiáng)的親和力，可以在生物反應(yīng)中代替磷，說明Sb會抑制DNA復(fù)制和微生物代謝過程[52]，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)菌DNA突變[53]。Sb及其化合物還會破壞細(xì)胞內(nèi)離子平衡，引起細(xì)胞缺氧[54]。Obiakor等[55]發(fā)現(xiàn)，在短期暴露(2 ～ 6 h)條件下，Sb(III)對A.brasilenseSp7的毒性是Sb(V)的10倍左右。這可能與兩種價(jià)態(tài)的Sb在細(xì)胞中的滲透能力和停留時(shí)間有關(guān)，Sb(III)作為中間價(jià)態(tài)物質(zhì)很容易通過自由擴(kuò)散被水甘油通道轉(zhuǎn)運(yùn)而滲透細(xì)胞膜[56]。盡管目前尚不清楚細(xì)胞對Sb(V)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[57]，但Sb(III)的易滲透性可以解釋其比Sb(V)毒性相對更高的原因。An和Kim[51]報(bào)道了在含Sb(III)的肉湯培養(yǎng)基中，Escherichiacoli，Bacillussubtilis和Streptococcusaureus的生長活性均受到了抑制。Murata等[58]也證明了在日本茨城縣土壤中的Sb(III) 會降低微生物的存活率。此外，不同價(jià)態(tài)的Sb對細(xì)菌和真菌種群的影響不同，但不論Sb(III)和Sb(V)，其對土壤微生物種群抑制率的大小順序?yàn)椋杭?xì)菌>真菌>放線菌[59]。Diquattro等[60]評估了銻酸鹽對不同土壤中微生物群落和土壤生化功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堿性土壤中，Sb(OH)6-在短期內(nèi)嚴(yán)重抑制了土壤微生物豐度、多樣性和功能，最終影響了土壤肥力。當(dāng)Sb濃度過高時(shí)，Sb氧化細(xì)菌細(xì)胞中H2O2大量積累，H2O2可以通過多不飽和脂肪酸的過氧化作用對細(xì)胞膜的脂質(zhì)層造成氧化損傷，并破壞細(xì)菌的代謝功能，從而抑制細(xì)菌的生長[61]。

目前，有關(guān)Sb不同價(jià)態(tài)對土壤微生物的生態(tài)毒理效應(yīng)的研究還相對較少。鑒于土壤微生物在維持生態(tài)系統(tǒng)整體服務(wù)功能方面發(fā)揮著重要作用，仍需進(jìn)一步研究Sb對土壤微生物生長和代謝的毒性機(jī)理。

3 微生物對Sb的抗性機(jī)制

了解微生物對Sb的抗性機(jī)制是Sb污染土壤生物修復(fù)的關(guān)鍵。微生物會利用不同的途徑來避免或減少細(xì)胞內(nèi)Sb的毒性積累，其可以通過改變膜的組成或抑制攝取來增加耐受性。如首先抑制Sb進(jìn)入細(xì)胞，若Sb進(jìn)入細(xì)胞，則促使Sb主動(dòng)從細(xì)胞中擠出，或在細(xì)胞內(nèi)以無毒的形式將其隔離[62]。生物外排是微生物為保護(hù)自身免受Sb的毒害而采取的最重要的措施之一。目前還沒有發(fā)現(xiàn)微生物吸收Sb的專門通道，或許還沒有進(jìn)化出這樣的通道，因?yàn)镾b不是微生物生長必需的微量元素[63]?；贏s和Sb之間相似的化學(xué)性質(zhì)，通常認(rèn)為它們具有相同的抗性機(jī)制。編碼As(III)/Sb(III)泵蛋白的arsB基因(arsRDABC操縱子的成員)已被證明同時(shí)具有As(III)和Sb(III)抗性[64,65]。arsB編碼一個(gè)12α螺旋跨膜蛋白，該蛋白常與調(diào)節(jié)蛋白ArsR、As(V)還原酶ArsC、ATP酶ArsA和轉(zhuǎn)錄抑制蛋白ArsD結(jié)合，將As(III)和Sb(III)擠出細(xì)胞[66,67]。Butcher等[68]將T.ferrooxidans耐砷基因arsB和arsC克隆到缺失突變體ars的菌株Escherichiacoli后，發(fā)現(xiàn)其對Sb的抗性增強(qiáng)。盡管ars基因源于專性嗜酸細(xì)菌，但其在大腸桿菌中同樣具有抗性功能。Li等[66]從Sb礦區(qū)中分離除了6株Sb(III)氧化菌，包括Acinetobactersp. JL7,Comamonassp. JL25,Comamonassp. JL40,Comamonassp. S44,Stenotrophomonassp. JL9和Variovoraxsp. JL23。與其他Sb(III)氧化菌相比，Comamonassp. S44對As(III)的抗性較高，對Sb(III)的抗性較低，分析該菌株的基因組發(fā)現(xiàn)了4個(gè)編碼As(V)還原酶蛋白的arsC基因，這可能與高As(III)抗性有關(guān)。說明Comamonassp. S44對As和Sb的抗性機(jī)制可能存在較大差異。據(jù)報(bào)道，Acr3p及其同源物YqcL可以替代ArsB作為Sb(III)的流出泵，且Acr3p主要存在于Actinobacteria和Alphaproteobacteria中[69]，但在古生菌和真核生物中也發(fā)現(xiàn)了Acr3p，其中基因簇acr1、acr2和acr3負(fù)責(zé)Sb(III)的抗性[70]。Kang等[71]研究發(fā)現(xiàn)，Agrobacteriumtumefaciens5A中acr3的缺失導(dǎo)致了對Sb(III)的敏感性增加。Ghosh等[72]發(fā)現(xiàn)Sb(III)刺激了Saccharomycescerevisiae中acr3的表達(dá)，其基因產(chǎn)物具有Sb(III)的耐受性。

此外，Meng等[56]發(fā)現(xiàn)As(III)和Sb(III)可以通過水-甘油的跨膜輸送蛋白通道GlpF進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞，并通過ArsB載體蛋白催化Sb(III)的外排。另外，在Saccharomycescerevisiae中，GlpF的同源物Fps1p也介導(dǎo)了Saccharomycescerevisiae對Sb(III)的吸收。fps1的缺失提高了Saccharomycescerevisiae對Sb(III)的耐受性，而該基因的組成性表達(dá)導(dǎo)致了超敏反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞暴露于Sb(III)環(huán)境時(shí)，fps1的表達(dá)被抑制，這表明一個(gè)協(xié)調(diào)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以保護(hù)細(xì)胞免受Sb(III)的毒性影響[62]。ABC超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ycf1也可以通過液泡隔離而獲得Sb(III)耐受性的性能[73]。Kassa等[61]發(fā)現(xiàn)高濃度Sb會誘導(dǎo)Serratiamarcescens抗氧化生物標(biāo)志物如脯氨酸(PRO)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)水平顯著升高，使細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境壓力。在Leishmania中，Sb(III)主要通過水-甘油通道蛋白AQP1進(jìn)入細(xì)胞[74]。一般來說，AQP1的轉(zhuǎn)錄水平與Leishmania細(xì)胞中Sb(III)的積累和敏感性水平相關(guān)[75]。其中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PGPR和ABCI4參與了Sb(III)-巰基外排，從而降低了細(xì)胞內(nèi)Sb(III) 的積累[72]。據(jù)報(bào)道，Sb(V)流入細(xì)胞的途徑不同于Sb(III)[76]。然而，微生物對Sb(V)的攝取機(jī)制仍不清楚。

4 微生物修復(fù)Sb污染土壤

近年來，微生物修復(fù)Sb污染土壤技術(shù)不斷發(fā)展。整體而言，微生物修復(fù)機(jī)制與Sb形態(tài)、土壤理化性質(zhì)和微生物種類及特性密切相關(guān)。其修復(fù)機(jī)理主要包括氧化、還原、吸附和甲基化等，各機(jī)理往往共同作用、相互影響。因此，對各機(jī)理及其相互作用進(jìn)行定性與定量解析仍然是目前研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。此外，由于微生物修復(fù)的復(fù)雜性，需要與多學(xué)科技術(shù)如代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏基因組學(xué)、基因工程等結(jié)合使用，以明確其修復(fù)機(jī)制，進(jìn)而達(dá)到穩(wěn)定修復(fù)效果。

4.1 生物氧化

Sb在土壤中主要以Sb(III)和Sb(V)兩種化學(xué)形態(tài)存在，雖然這兩種價(jià)態(tài)的Sb都是有毒的，但Sb(III)化合物的毒性是Sb(V)化合物的10倍[77]。因此，將毒性較大的Sb(III)氧化為毒性較小的Sb(V)，對Sb污染土壤修復(fù)具有重要意義。除了化學(xué)氧化劑(H2O2、碘酸鹽、鐵錳(氫)氧化物)外，微生物在Sb(III)氧化過程中也起著重要作用[3,78]。

微生物對Sb(III)的氧化可以促進(jìn)Sb污染物的沉淀和原位固定，是一種很有潛力的污染土壤修復(fù)方法[77]。到目前為止，對介導(dǎo)Sb(III)氧化的細(xì)菌種類和分子機(jī)制的報(bào)道還較少。近年來，已鑒定出60多種好氧Sb(III)氧化菌，其中假單胞菌屬、單胞菌屬、農(nóng)桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬占主導(dǎo)地位[3,79]。Li等[80]發(fā)現(xiàn)了一種存在于Sb(III)氧化菌AgrobacteriumtumefaciensGW4中的氧化還原酶(AnoA)。敲除anoA基因會降低細(xì)菌對Sb(III)的抗性，使其對Sb(III)氧化能力降低約27%，而anoA基因過表達(dá)的菌株可使Sb(III)氧化能力提高約34%。此外，Li等[81]報(bào)道了aioAB是導(dǎo)致細(xì)胞周質(zhì)中Sb(III)氧化的原因。若無aioAB，更多的Sb(III)進(jìn)入細(xì)胞后，Sb(III)氧化酶AnoA和參與細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的蛋白顯著增加，從而提高了Sb(III)的氧化效率。然而，當(dāng)這兩個(gè)基因被破壞時(shí)，Sb(III)氧化過程并沒有完全停止，這表明細(xì)菌氧化Sb(III)還有其他機(jī)制的存在[82]。Nguyen等[77]從Sb(III)污染土壤中分離出2株Sb(III)氧化菌(Shinellasp. NLS1和Ensifersp. NLS4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種菌株均能在營養(yǎng)受限的條件下氧化Sb(III)。其中，Shinellasp. NLS1具有aioA基因，可以充當(dāng)亞銻酸鹽氧化酶的功能，Ensifersp. NLS4不具有aioA基因，但其能夠在厭氧條件下以硝酸鹽為電子受體對Sb(III) 進(jìn)行氧化，說明Sb(III)生物氧化會通過不同的途徑發(fā)生。Li等[66]報(bào)道了6種Sb(III)氧化細(xì)菌均未表現(xiàn)出As(III)氧化能力，雖然As和Sb具有相似的理化性質(zhì)。此外，Comamonassp. S44菌株的全基因組中未發(fā)現(xiàn)推測的As(III)氧化酶基因aioBA。這與Lehr等[83]報(bào)道的A.tumefaciens5A的情況不同，該菌株同時(shí)具有As(III)和Sb(III)氧化能力。這說明細(xì)菌氧化Sb(III)和As(III)存在不同的基因偶聯(lián)。此外，Sb(III)會誘導(dǎo)細(xì)菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)，會產(chǎn)生大量的H2O2，H2O2可以作為氧化劑將Sb(III)氧化為Sb(V)[84]。一般來說，生物有氧呼吸不可避免地伴隨著活性氧(ROS)的產(chǎn)生。Wang等[82]提出了一種新的非酶介導(dǎo)的氧化機(jī)制，即通過破壞PseudomonasstutzeriTS44的ROS-通路保護(hù)，使H2O2積累并促進(jìn)Sb(III)氧化為Sb(V)。除過氧化氫酶外，谷胱甘肽(GSH)也被認(rèn)為是細(xì)菌氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要組成部分[85]。Liu等[85]發(fā)現(xiàn)ComamonastestosteroniS44對多種重金屬具有抗性，并且能夠?qū)⒂卸镜膩嗕R酸鹽(Sb(III))氧化成毒性較小的銻酸鹽(Sb(V))。這可能是Fe-S組裝轉(zhuǎn)錄因子IscR通過調(diào)節(jié)IscS介導(dǎo)的半胱氨酸脫硫作用，促進(jìn)了GSH的形成。另外，Sb(III)誘導(dǎo)iscR表達(dá)，iscR的缺失降低了細(xì)胞GSH含量。這些結(jié)果表明氧化細(xì)菌Sb(III)受到IscR的調(diào)控。IscR調(diào)控Sb(III)氧化的假設(shè)模型可概括為:(1) Sb(III)可誘導(dǎo)細(xì)菌氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生H2O2；(2) 在堿性條件下H2O2將Sb(III)氧化為Sb(V)；(3) IscR參與調(diào)控GSH的形成。然后，H2O2被過氧化氫酶KatA和GSH消耗，這也可能影響細(xì)菌氧化Sb(III)[3]。

然而，對厭氧菌氧化Sb(III)的認(rèn)識還很有限。目前僅分離出幾株厭氧或兼性厭氧Sb(III)氧化細(xì)菌[77,78,86]，這些菌株利用硝酸鹽作為電子受體氧化Sb(III)，而氧化機(jī)制仍不清楚。Li等[78]發(fā)現(xiàn)在以硝酸鹽為電子受體的缺氧條件下，Sinorhizobiumsp. GW3在培養(yǎng)過程中能夠同時(shí)氧化Fe(II)和Sb(III)；然而，在Fe(II)和硝酸鹽同時(shí)存在的情況下，Sb(III)氧化速率明顯提高。除Sb(III)氧化菌外，其他氧化性微生物也能間接促進(jìn)Sb(III)在自然環(huán)境中的氧化。Bai等[87]報(bào)道了Mn氧化細(xì)菌Pseudomonassp. QJX-1能夠氧化Mn(II)形成生物源Mn氧化物(BMO)，BMO可以將Sb(III)氧化為Sb(V)，但只有Sb(III)氧化生成的Sb(V)離子能被進(jìn)一步吸附到BMO表面。

綜上所述，不論在有氧和缺氧環(huán)境， Sb(III)都可以被土壤中的微生物和鐵錳(氫)氧化物等輕易氧化，這也解釋了土壤中Sb(III)濃度較低的原因。因此，未來對Sb(III)生物地球化學(xué)氧化的研究可以集中在更為復(fù)雜的自然環(huán)境中。

4.2 生物還原

微生物對Sb(V)還原是Sb在生物地球化學(xué)循環(huán)中不可缺少的過程。這些微生物過程影響了Sb的環(huán)境形態(tài)和遷移能力。迄今為止，大多數(shù)生物修復(fù)Sb污染土壤的研究主要集中于Sb(III)氧化[25,66,88], 對生物還原法修復(fù)Sb污染土壤的研究相對較少。根據(jù)熱力學(xué)平衡計(jì)算，Sb(V)在水溶液中以Sb(OH)6-(銻酸鹽)的形式存在，且在含氧土壤系統(tǒng)中相對穩(wěn)定，而在還原條件下主要以Sb(OH)3(亞銻酸鹽)的形式存在[89]。土壤中Sb(V)還原為Sb(III)的過程已被證明可以與Fe(II)的氧化進(jìn)行非生物耦合[90,91]，但該過程也被證明是由微生物催化進(jìn)行的[92,93]。土壤環(huán)境中普遍存在Sb氧化還原物被鐵錳(氫)氧化物吸附的現(xiàn)象[2,94]，在淹水條件下會通過還原作用溶解釋放Sb。在還原條件下，Sb(V)會被轉(zhuǎn)化為Sb(III)，而后者更容易與鐵(氫)氧化物結(jié)合而被固定[7]。因此，生物還原Sb(V)是一種很有前途的生物修復(fù)策略。Hockmann等[95]研究表明，在厭氧石灰性土壤中，本地微生物可以迅速將Sb(V)還原為Sb(III)，生成的Sb(III)隨后與鐵(氫)氧化物表面結(jié)合，使Sb固定。Lai等[96]證明了Rhizobium可以利用H2作為唯一電子供體將Sb(V)還原生成Sb(III)沉淀(Sb2O3)。Wang等[97]首次論證了硫酸鹽還原菌(SRB)可以將Sb(V)還原為Sb(III)，將硫酸鹽離子轉(zhuǎn)化為硫化物并與Sb(III)形成絡(luò)合物作為沉淀的可行性。Kulp等[93]報(bào)道了在缺氧沉積物中Sb(V)的厭氧細(xì)菌還原作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用乙酸或乳酸作為電子供體可以將Sb(V)還原成Sb(III)并與硫化物絡(luò)合析出沉淀。Nguyen等[98]從氧化銻生產(chǎn)工廠附近采集的沉積物樣本中分離出一株Sb還原細(xì)菌JUK-1，其在生長過程中會生成Sb(OH)3的沉淀。Abin和Hollibaugh[99]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)在DesulfuribacillusstibiiarsenatisMLFW-2T中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)呼吸型Sb(V)還原酶。該酶屬于二甲亞砜還原酶(DMSOR)家族，它包含多種能夠還原硝酸鹽、砷酸鹽、硒酸鹽、高氯酸鹽以及氧化甲酸鹽、亞砷酸鹽和亞硝酸鹽的蛋白[100]。Shi等[101]采用宏基因組學(xué)和元轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法來揭示生物反應(yīng)器中的DMSOR家族基因是否具有將Sb(V)還原的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，一些DMSOR家族基因(sbrA還原酶基因)高度轉(zhuǎn)錄，含有sbrA的假定操縱子包括編碼c型細(xì)胞色素的基因、響應(yīng)調(diào)節(jié)因子和鐵氧化還原蛋白，它們共同實(shí)現(xiàn)Sb(V)還原。然而，目前關(guān)于細(xì)菌還原Sb(V)的分子機(jī)制尚不清楚，參與這一反應(yīng)的酶也尚未確定。

此外，土壤環(huán)境中Sb的遷移率通常會受到與鐵礦物吸附或共沉淀作用的影響[1,102,103]。鐵氧化物的形成和礦物相轉(zhuǎn)化對Sb的遷移性起著重要作用[104,105]。研究表明，除Sb(V)還原菌外，微生物對Fe(III)的還原也會對Sb的遷移率產(chǎn)生很大的影響[7,106]。Li等[78]證實(shí)了由微生物(Sinorhizobiumsp. GW3)介導(dǎo)產(chǎn)生的含F(xiàn)e(III)的沉淀物可以有效地氧化和固定Sb(III)。Burton等[107]發(fā)現(xiàn)異化的Fe(III)還原菌Shewanellaputrefaciens(CN-32)介導(dǎo)的Fe(III)還原有助于在還原環(huán)境中固定Sb(V)。Arsic等[25]也發(fā)現(xiàn)了微生物介導(dǎo)的Fe(III)還原似乎與污染沉積物中Sb流動(dòng)性的降低有關(guān)。

在之前的研究中，微生物Fe(III)還原對Sb遷移率的影響很少被單獨(dú)考慮(即在微生物還原的Fe(III)是唯一終端電子的條件下)。這些影響主要是從微生物介導(dǎo)的復(fù)雜環(huán)境中(例如在天然土壤和沉積物中)的研究中推斷出來的。在自然環(huán)境中，微生物對Fe(III)、Mn(IV)和Sb(V)還原通常同時(shí)發(fā)生，這可能會使得Sb與鐵礦物組合發(fā)生變化，從而導(dǎo)致Sb的滯留[107]。因此，研究Fe(III)、Mn(IV)微生物還原與Sb(III)的反應(yīng)過程，并進(jìn)一步研究其在特定條件下(好氧、缺氧、其他還原性金屬離子存在)的反應(yīng)機(jī)理，有助于闡明Sb在土壤環(huán)境中的行為。這也可能是一種修復(fù)土壤中Sb污染的有效方法。

4.3 生物吸附

在微生物與Sb的相互作用過程中，生物吸附是第一步[108]。研究表明，環(huán)境微生物(如細(xì)菌、真菌、藻類)可以吸附和固定多種重金屬[109,110]。Sb的生物吸附機(jī)制主要是由于細(xì)胞壁上存在的羧基、羥基和氨基官能團(tuán)通過靜電吸引、離子交換和絡(luò)合等方式吸附和固定Sb[17,111]。Gu等[112]從尾礦中分離到一種新型細(xì)菌(Acinetobactersp. JH7)，發(fā)現(xiàn)Acinetobactersp. JH7可以吸附Sb(III)。紅外光譜分析表明，-OH, C-N和C-O等官能團(tuán)可能參與了Sb(III)的生物吸附。Zhang等[113]發(fā)現(xiàn)Synechocystissp.可以通過細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)和多糖吸附Sb(III)，吸附量可達(dá)4.68 mg·g-1(干重)。Zhang等[114]使用激發(fā)-發(fā)射矩陣(EEM)熒光光譜法研究了Synechocystissp.胞外聚合物物質(zhì)(EPS)與Sb(III)的絡(luò)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPS與Sb(III)之間的相互作用是自發(fā)的、吸熱的。Sb(III)與EPS的結(jié)合主要受氫鍵和范德華力的影響。紅外光譜分析表明，EPS中的多糖參與了Sb(III)與EPS的絡(luò)合。Cai等[115]研究了Bacillussubtilis對Sb(III)的吸附特性。結(jié)果表明，Bacillussubtilis在水溶液中對Sb(III)離子的生物吸附是可行的、吸熱的、自發(fā)的，其可作為一種廉價(jià)的原生細(xì)菌材料，在低溫條件下協(xié)助植物吸收弱酸性或中性pH污染土壤中的Sb。Sun[111]和Wu等[116]研究了cyanobacteriaMicrocystis對Sb(III)和Sb(V)的生物吸附過程。結(jié)果表明，cyanobacteriaMicrocystis對Sb(III)和Sb(V)有較大的吸附潛力。其中，當(dāng)pH為 4時(shí)，cyanobacteriaMicrocystis對Sb(III)的最大生物吸附量為4.88 mg·g-1(干重)；當(dāng)pH為2.8時(shí)，cyanobacteriaMicrocystis對Sb(V)的最大生物吸附量為7 340.2 mg·kg-1(干重)。Sb(III)的生物吸附符合Freundlich和Langmuir等溫線模型，Sb(V) 的生物吸附符合Freundlich等溫線模型。此外，綠色海藻(Cladophorasericea和Ulvarigida)和棕色海藻(Sargassummuticum和Ascophyllumnodosum)對Sb(III)和Sb(V)也有生物吸附能力[117,118]。

目前，雖然做了大量工作來探索微生物對Sb的吸附行為，但針對土壤細(xì)菌的研究相對較少。事實(shí)上，大多數(shù)微生物會附著在土壤細(xì)粒礦物上，從而形成微生物-礦物復(fù)合材料[119]，其是土壤重金屬的重要吸附劑[120]，并表現(xiàn)出不同于純礦物或微生物對金屬離子的吸附特性[121,122]。Lei等[108]研究了厭氧條件下耐銻土壤細(xì)菌Bacilluscereus和針鐵礦組成二元復(fù)合材料對Sb(III)的吸附行為。結(jié)果表明，針鐵礦、Bacilluscereus和細(xì)菌-針鐵礦復(fù)合材料對Sb(III)的吸附與pH無關(guān)。通過XPS光譜分析發(fā)現(xiàn)，該吸附行為主要與針鐵礦的鐵羥基官能團(tuán)和細(xì)菌的羧基和氨基/酰胺基團(tuán)有關(guān)。

4.4 生物甲基化

已有大量文獻(xiàn)證實(shí)了金屬有機(jī)化合物對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康產(chǎn)生不利影響的可能性[123]。然而，目前關(guān)于Sb甲基化化合物的生態(tài)毒理學(xué)研究還很少，但現(xiàn)有的文獻(xiàn)均表明甲基化Sb化合物的毒性很低[124]。Burrell等[125]測定了二苯基-、三苯基-、三甲基銻化合物的真菌毒性，發(fā)現(xiàn)只有二苯基銻化合物的EC50值低于30 mg·L-1。另外，銻化氫和三甲基銻((CH3)3Sb)被認(rèn)為具有基因毒性[126]。然而，引起DNA損傷所需的最低溶液濃度為200 μmol·L-1。但該濃度比在發(fā)酵氣體中發(fā)現(xiàn)的典型痕量三甲基銻濃度要高出許多數(shù)量級[124]。此外，三甲基二氯化銻((CH3)3SbCl2)細(xì)胞膜通透性較差，在正常暴露條件下不會引起細(xì)胞和基因毒性效應(yīng)[127]。綜上，Sb生物甲基化可以將Sb(III)轉(zhuǎn)化為毒性較小的物質(zhì)[一甲基銻(MMS)、二甲基銻(DMS)和三甲基銻(TMS)][128]。然而，一些研究者認(rèn)為Sb的生物甲基化是一個(gè)偶然的過程[129]，而不是一種解毒機(jī)制。

目前，多種微生物已被證明具有銻甲基化的能力[130,131]，主要包括：好氧絲狀真菌(Scopulariopsisbrevicaulis、Phaeolusschweinitzii)，嚴(yán)格厭氧原核生物(厭氧細(xì)菌：Clostridiumcollagenovorans、Desulfovibriovulgaris；產(chǎn)甲烷古菌：Methanobacteriumformicicum、Methanobacteriumthermoautrophicum、Methanosar-cinabarkeri)以及嚴(yán)格好氧細(xì)菌(Flavobacteriumsp.)和好氧酵母菌(Cryptococcushumicolus)，厭氧條件下生長的混合培養(yǎng)菌也顯示出了Sb甲基化活性。因此，好氧和厭氧微生物似乎都能使Sb甲基化。最初的研究主要集中在Scopulariopsisbrevicaulis上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只形成了一種揮發(fā)性物質(zhì)，即(CH3)3Sb。其中，s-腺苷蛋氨酸的前體甲硫氨酸被認(rèn)為是Scopulariopsisbrevicaulis甲基化的甲基供體[132]。在厭氧條件下生長的混合培養(yǎng)菌和好氧菌Pseudomonasfluorescens對 (CH3)3SbBr2的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中也發(fā)現(xiàn)了(CH3)3Sb[131]。此外，好氧真菌Scopulariopsisbrevicaulis和Phaeolusschweinitzii在生長過程中可以將無機(jī)Sb生物甲基化形成SbH3、(CH3)2SbH、(CH3)3Sb和一些非揮發(fā)性甲基銻[133-135]，且甲基化的過程是從MMS到DMS，再到TMS[136]，此反應(yīng)過程如圖3所示。在缺氧條件下，Cryptococcushumicolus也可以與無機(jī)Sb生物甲基化形成SbH3、(CH3)2SbH、(CH3)3Sb，且Sb甲基化程度與Sb的初始底物濃度呈正相關(guān)[137]。據(jù)報(bào)道，Sb(III)比Sb(V)更易于生物甲基化。研究發(fā)現(xiàn)，Scopulariopsisbrevicaulis不能使Sb(V)甲基化[138]，或者Sb(V)甲基化效率低于Sb(III)[134]。Andrewes等[133]也發(fā)現(xiàn)了Phaeolusschweintzii對Sb(V)生物甲基化效率較低的現(xiàn)象。也有研究表明Sb(V)可以被Cryptococcushumicolus[139]和土壤及污泥細(xì)菌[131,136]生物甲基化。Duester等[140]發(fā)現(xiàn)土壤中甲基化銻的比例高于As，這與其他關(guān)于微生物培養(yǎng)過程中Sb與As生物甲基化的研究情況相反。鑒于Sb甲基化化合物在Sb的生物地球化學(xué)循環(huán)中的重要性，未來仍需要從不同的生態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行研究以更好地理解Sb生物甲基化對Sb污染環(huán)境修復(fù)的意義。

圖3 不同Sb物種的甲基化途徑[3]

5 展望

土壤Sb污染是一個(gè)全球性問題。微生物修復(fù)是目前最具發(fā)展和應(yīng)用前景的技術(shù)，但其規(guī)?；瘧?yīng)用性研究相對較少。這主要是由于微生物修復(fù)Sb污染土壤的反應(yīng)過程和機(jī)理并未完全明確，以及對應(yīng)的技術(shù)需求與管理支撐尚缺乏針對性研究。此外，由于土壤環(huán)境條件的復(fù)雜性，微生物修復(fù)Sb污染土壤需要綜合考慮Sb的生物地球化學(xué)循環(huán)、遷移率、生物利用度，以及生物修復(fù)后的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)等因素。由于Sb與As具有相似的化學(xué)特性，土壤Sb污染修復(fù)可以借鑒As修復(fù)的生化途徑。然而，Sb的生物修復(fù)也會通過一些獨(dú)特的生化機(jī)制進(jìn)行。為了加速Sb污染土壤的生物修復(fù)進(jìn)程，在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步考慮以下幾個(gè)方面：

(1) 有必要探索更多的具有較高Sb(III)氧化能力的Sb 抗性菌株。另外，除了生物驅(qū)動(dòng)的Sb(III)氧化外，一些非生物因素如土壤環(huán)境中的有機(jī)物、鐵錳礦物、過氧化氫和碘酸鹽等也已被證實(shí)可將Sb(III)氧化為Sb(V)。在實(shí)際環(huán)境條件下，Sb(III)氧化反應(yīng)可能是由化學(xué)和微生物協(xié)同作用引起的。因此，應(yīng)綜合考慮這兩個(gè)因素的影響。

(2) 土壤環(huán)境中Sb氧化還原物可以被鐵錳(氫)氧化物吸附，且Sb(V)被還原為Sb(III)時(shí)更容易與鐵錳(氫)氧化物結(jié)合而被固定。然而，微生物介導(dǎo)的Sb和鐵錳礦物的轉(zhuǎn)化對Sb遷移率的影響關(guān)注較少。這是理解Sb生物地球化學(xué)和Fe循環(huán)之間相互作用方面的一個(gè)關(guān)鍵缺口。這也可能是一種修復(fù)Sb污染土壤的有效方法。

(3) 目前，雖然對Sb(III) 生物甲基化已進(jìn)行了研究，但Sb(III)甲基化的機(jī)制尚不清楚。此外，Sb(III)生物甲基化所產(chǎn)生的揮發(fā)性甲基和氫化物衍生物可能對環(huán)境造成危害。因此，關(guān)于Sb(III)甲基化的機(jī)制和甲基化Sb與天然膠態(tài)配體(如天然有機(jī)質(zhì)、黏土、鐵錳(氫)氧化物等)的結(jié)合仍需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

(4) 考慮到Sb污染環(huán)境條件的極端復(fù)雜性，有必要對Sb污染土壤生物修復(fù)后的可持續(xù)性進(jìn)行研究。因此，可以利用其他學(xué)科發(fā)展技術(shù)和微生物法聯(lián)合修復(fù)技術(shù)將Sb從土壤中提取出來，可減少生態(tài)系統(tǒng)和人類健康風(fēng)險(xiǎn)。