鄭永征,劉光輝,潘銘東

0引言

眼內(nèi)炎是眼科手術(shù)的嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響視力。術(shù)前結(jié)膜囊內(nèi)聚維酮碘消毒是最為有效地預(yù)防術(shù)后眼內(nèi)炎的方法[1]。目前國(guó)內(nèi)外主要使用50g/L聚維酮碘結(jié)膜囊內(nèi)消毒3min[2-3]。但部分患者術(shù)后出現(xiàn)眼干、眼痛等角膜刺激征。2017年《我國(guó)白內(nèi)障摘除手術(shù)后感染性眼內(nèi)炎防治專家共識(shí)》建議對(duì)眼表有問(wèn)題患者使用10g/L或低于50g/L聚維酮碘結(jié)膜囊消毒[4]。聚維酮碘是廣譜殺菌消毒劑，聚維酮碘殺菌的主要原理是氧化損傷。聚維酮碘在水中能緩慢釋放出游離碘，游離碘可與菌體蛋白的氨基酸結(jié)合使其變性，游離碘還可氧化細(xì)菌蛋白中的SH-、OH-、NH-等活性基團(tuán)和不飽和脂肪酸的雙鍵，從而滅活微生物的活力，殺滅微生物，抑制微生物繁殖、釋放毒素[5]。但聚維酮碘的作用沒(méi)有特異性。除微生物外，它還可以作用于正常的角膜上皮細(xì)胞。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞，研究聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞氧化損傷的影響。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源人角膜上皮細(xì)胞株(Scien Cell，Cat.6510)。

1.1.2試劑及儀器50g/L聚維酮碘(上海利康消毒高科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、2.5g/L胰酶(美國(guó)HyClone)，CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)，人丙二醛(malondialdehyde,MDA)、人超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA試劑盒(MDA：CSB-E08557h；SOD：CSB-E08554h，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，Annexin V-FITC/PI流式試劑盒(美國(guó)Beckman Coulter)。酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司，軟件版本SkanIt Software 5.0 for Microplate Readers RE,ver.5.0.0.42)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿，加入含100g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基10mL，置于37℃ 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2d后換液一次，細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)按照1∶3傳代。選取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及處理

1.2.2.1不同濃度聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞的影響取體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)良好的角膜上皮細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字法分為：對(duì)照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組。低濃度組采用10g/L聚維酮碘孵育3min，中濃度組采用25g/L聚維酮碘孵育3min，高濃度組采用50g/L聚維酮碘孵育3min。然后使用PBS潤(rùn)洗3次，每次2min，加入含100g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。采用ELISA檢測(cè)各組MDA、SOD含量，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，倒置顯微鏡觀察角膜上皮細(xì)胞形態(tài)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.2.2不同消毒時(shí)間聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞的影響取體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)良好的角膜上皮細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字法分為：對(duì)照組、短時(shí)間組、中等時(shí)間組和長(zhǎng)時(shí)間組。短時(shí)間組采用50g/L聚維酮碘孵育1min，中等時(shí)間組采用50g/L聚維酮碘孵育2min，長(zhǎng)時(shí)間組采用50g/L聚維酮碘孵育3min。然后使用PBS潤(rùn)洗3次，每次2min，加入含100g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。采用ELISA檢測(cè)各組MDA、SOD含量，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，倒置顯微鏡觀察角膜上皮細(xì)胞形態(tài)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.2.3 ELISA檢測(cè)各組MDA含量各組細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔1mL培養(yǎng)基，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按處理因素處理后培養(yǎng)24h，吸走培養(yǎng)液，PBS潤(rùn)洗3次，每孔加入200μL細(xì)胞裂解液后置于搖床5min，用細(xì)胞刮反復(fù)刮底壁，將所得細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移入冰浴的1.5mL EP管中，4℃ 12 000g離心10min，取上清液作為待測(cè)樣品。按試劑盒說(shuō)明書取100μL細(xì)胞裂解上清液，200μL MDA檢測(cè)工作液，混勻后100℃ 15min，冷卻至室溫，1000g離心10min，取200μL上清液到96孔板中，采用532μm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。

1.2.2.4 ELISA檢測(cè)各組SOD含量各組細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔1mL培養(yǎng)基，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按處理因素處理后培養(yǎng)24h，吸走培養(yǎng)液，PBS潤(rùn)洗3次，每孔加入100μL SOD樣品制備液后置于搖床5min，用細(xì)胞刮反復(fù)刮底壁，將所得細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移入冰浴的1.5mL EP管中，4℃ 12 000g離心10min，取上清液作為待測(cè)樣品。按試劑盒說(shuō)明書取20μL細(xì)胞上清液，160μL WST-8/酶工作液，20μL反應(yīng)啟動(dòng)工作液，混勻后37℃孵育30min，采用450μm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。

1.2.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性檢測(cè)時(shí)各組細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL培養(yǎng)基，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按處理因素處理后培養(yǎng)24h，更換新鮮培養(yǎng)基每孔100μL，每孔再加入10μL CCK-8試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2h后，采用420μm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。

1.2.2.6 Annexin V-FITC/PI測(cè)細(xì)胞凋亡各組細(xì)胞接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿，每孔10mL培養(yǎng)基，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按處理因素處理后培養(yǎng)24h，吸走培養(yǎng)液，PBS潤(rùn)洗3次，用2.5g/L胰酶消化為單個(gè)細(xì)胞，1000g離心3min。2mL PBS重懸細(xì)胞并且計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，取100μL細(xì)胞懸液加入Annexin V-FITC抗體5μL和PI抗體5μL，避光室溫孵育15min后加入400μL結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步使用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞MDA含量的影響對(duì)照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組中角膜上皮細(xì)胞MDA含量分別為4.182±0.306、9.269±0.106、12.282±0.263、17.733±0.423nmol/L。聚維酮碘濃度越高，角膜上皮細(xì)胞的MDA含量越高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1092.91，P<0.01)。對(duì)照組、短時(shí)間組、中等時(shí)間組和長(zhǎng)時(shí)間組MDA含量分別為4.195±0.261、12.123±0.557、15.194±0.476、17.583±0.554nmol/L。聚維酮碘消毒時(shí)間越長(zhǎng)，角膜上皮細(xì)胞的MDA含量越高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=454.51，P<0.01)。

2.2 ELISA檢測(cè)聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞SOD含量的影響對(duì)照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組中角膜上皮細(xì)胞SOD含量分別為7.132±0.370、6.815±0.185、6.422±0.338、5.866±0.234U/mg。聚維酮碘濃度越高，角膜上皮細(xì)胞的SOD含量越低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.481，P<0.01)。對(duì)照組、短時(shí)間組、中等時(shí)間組和長(zhǎng)時(shí)間組SOD含量分別為7.148±0.316、6.320±0.318、6.050±0.196、5.832±0.254U/mg。聚維酮碘消毒時(shí)間越長(zhǎng)，角膜上皮細(xì)胞的SOD含量越低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.112，P<0.01)。

2.3 CCK-8法檢測(cè)聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞活性的影響對(duì)照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組中角膜上皮細(xì)胞活力分別為1.269±0.055、1.192±0.061、1.042±0.077、0.892±0.038。聚維酮碘濃度越高，角膜上皮細(xì)胞的活性越低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.547，P<0.01)。

圖1 不同濃度聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞的影響(×200) A：對(duì)照組；B：低濃度組；C：中濃度組；D：高濃度組。

圖2 不同消毒時(shí)間聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞的影響(×200) A：對(duì)照組；B：短時(shí)間組；C：中等時(shí)間組；D：長(zhǎng)時(shí)間組。

對(duì)照組、短時(shí)間組、中等時(shí)間組和長(zhǎng)時(shí)間組中角膜上皮細(xì)胞活力分別為1.260±0.024、1.119±0.043、1.001±0.042、0.876±0.062。聚維酮碘消毒時(shí)間越長(zhǎng)，角膜上皮細(xì)胞的活性越低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.816，P<0.01)。

2.4倒置顯微鏡觀察聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞的影響不同濃度聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞的影響見圖1。對(duì)照組角膜上皮細(xì)胞呈多角形，排列規(guī)則，透光性好；聚維酮碘消毒后部分角膜上皮細(xì)胞變性，活性下降，出現(xiàn)皺縮，透光性降低，甚至出現(xiàn)凋亡小體，聚維酮碘濃度越高，變性的角膜上皮細(xì)胞越多。不同消毒時(shí)間聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞的影響見圖2。對(duì)照組角膜上皮細(xì)胞呈多角形，排列規(guī)則，透光性好；聚維酮碘消毒后部分角膜上皮細(xì)胞變性，活性下降，聚維酮碘消毒時(shí)間越長(zhǎng)，變性的角膜上皮細(xì)胞越多。

2.5聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞凋亡率的影響對(duì)照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組中角膜上皮細(xì)胞凋亡率分別為3.35%±0.13%、6.50%±0.35%、8.41%±0.10%、15.33%±0.27%。聚維酮碘濃度越高，角膜上皮細(xì)胞的凋亡率越高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1386.175，P<0.01)。對(duì)照組、短時(shí)間組、中等時(shí)間組和長(zhǎng)時(shí)間組中角膜上皮細(xì)胞凋亡率分別為3.37%±0.28%、8.12%±0.48%、11.31%±0.37%、15.50%±0.271%。聚維酮碘消毒時(shí)間越長(zhǎng)，角膜上皮細(xì)胞的凋亡率越高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=598.196，P<0.01)。

3討論

術(shù)前殺滅結(jié)膜囊細(xì)菌是預(yù)防術(shù)后眼內(nèi)炎的重要措施。術(shù)前滴用抗生素眼液，術(shù)前用等滲鹽水或抗生素沖洗結(jié)膜囊，術(shù)前結(jié)膜囊內(nèi)聚維酮碘消毒均可降低結(jié)膜囊細(xì)菌數(shù)量，但術(shù)前結(jié)膜囊內(nèi)聚維酮碘消毒是最為有效的方法[1]。聚維酮碘是廣譜殺菌消毒劑，可直接殺滅細(xì)菌、病毒、真菌、芽孢與原蟲。大多數(shù)細(xì)菌30s內(nèi)可殺滅[5]。聚維酮碘殺菌的主要原理是氧化損傷。聚維酮碘在水中能緩慢釋放出游離碘，游離碘可氧化菌體蛋白的氨基酸使其變性[5]。聚維酮碘不含酒精，對(duì)皮膚黏膜刺激小，是黏膜的首選消毒劑。

聚維酮碘的作用沒(méi)有特異性。除微生物外，它還可以作用于正常細(xì)胞。高濃度的聚維酮碘對(duì)組織細(xì)胞有一定的毒性，聚維酮碘結(jié)膜囊消毒時(shí)，結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞直接接觸聚維酮碘，局部濃度越高，細(xì)胞毒性也越大。我們研究發(fā)現(xiàn)聚維酮碘消毒后角膜上皮細(xì)胞的MDA含量升高，SOD含量降低，細(xì)胞活性降低，部分角膜上皮細(xì)胞變性，出現(xiàn)皺縮，透光性降低，甚至出現(xiàn)凋亡小體，凋亡率增高。正常結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧系統(tǒng)處于相對(duì)平衡狀態(tài)，體內(nèi)產(chǎn)生的自由基會(huì)被抗氧系統(tǒng)及時(shí)淬滅，維持體內(nèi)自穩(wěn)狀態(tài)[6]。聚維酮碘結(jié)膜囊消毒時(shí)，游離碘在氧化細(xì)菌蛋白的同時(shí)，也可以氧化結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞中的蛋白，甚至細(xì)胞核內(nèi)DNase活性。這時(shí)突然產(chǎn)生的大量自由基超過(guò)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的清除能力，結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。細(xì)胞膜或細(xì)胞核模上的磷脂、酶和膜受體上的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)可因氧化應(yīng)激產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物。MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，MDA含量升高影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性，激活P38、JNK、CDC42、JAK、PI3K/Akt、自噬等信號(hào)途徑，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄NF-κB、STAT和EGR1，激活細(xì)胞核內(nèi)DNase活性引起DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6-9]。SOD是體內(nèi)的一種抗氧化金屬酶，人體內(nèi)有Cu/Zn-SOD和Mn-SOD兩類。SOD通過(guò)金屬離子如Mn+1(氧化態(tài))和Mn(還原態(tài))的交替電子得失實(shí)現(xiàn)催化作用。超氧陰離子自由基與金屬離子形成配合物，Mn+1被還原為Mn，同時(shí)生成氧，Mn又被HO2氧化為Mn+1，同時(shí)生成過(guò)氧化氫，SOD又被氧化為初始氧化態(tài)的SOD。最后，H2O2在過(guò)氧化氫酶的作用下，被催化分解為水和氧。SOD催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過(guò)氧化氫，消除體內(nèi)超氧自由基，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷，減少由于氧化損傷引起的細(xì)胞凋亡[6，10-12]。聚維酮碘消毒后角膜上皮細(xì)胞的MDA含量升高，SOD含量降低，提示聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡增加。Chou等[5]研究發(fā)現(xiàn)聚維酮碘可抑制人角膜纖維細(xì)胞和人角膜上皮細(xì)胞中的線粒體脫氫酶和細(xì)胞內(nèi)酯酶活性，包括DNase活性。盡管細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有改變，但細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制并且細(xì)胞膜完整性被破壞，細(xì)胞對(duì)外部刺激沒(méi)有反應(yīng)，認(rèn)為聚維酮碘通過(guò)固定而不是細(xì)胞凋亡或壞死導(dǎo)致人角膜纖維細(xì)胞和人角膜上皮細(xì)胞死亡。

我們研究還發(fā)現(xiàn)聚維酮碘消毒后對(duì)角膜上皮細(xì)胞的氧化損傷呈濃度和時(shí)間依賴性。聚維酮碘濃度越高，角膜上皮細(xì)胞的MDA含量越高，SOD含量越低，細(xì)胞活性越低，凋亡率越高。聚維酮碘消毒時(shí)間越長(zhǎng)，角膜上皮細(xì)胞的MDA含量越高，SOD含量越低，細(xì)胞活性越低，凋亡率越高。這與Shibata等[13]報(bào)道的聚維酮碘對(duì)角膜上皮具有一定細(xì)胞毒性，且其毒性呈濃度依賴性一致。增加聚維酮碘濃度和延長(zhǎng)消毒時(shí)間會(huì)增加碘向角膜的滲透量，并可能導(dǎo)致角膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞的毒性，結(jié)膜囊內(nèi)殘留的聚維酮碘可能進(jìn)入前房，損傷角膜內(nèi)皮細(xì)胞。Jiang等[14]通過(guò)角膜熒光染色和角膜厚度測(cè)量?jī)x檢測(cè)不同濃度聚維酮碘對(duì)角膜的毒性，研究發(fā)現(xiàn)50g/L和25g/L的聚維酮碘結(jié)膜囊消毒可引起嚴(yán)重的上皮損傷，20g/L和15g/L的聚維酮碘前房注射后可引起明顯的角膜水腫、角膜增厚。認(rèn)為5g/L或10g/L聚維酮碘結(jié)膜囊消毒是安全可行的。封艷等[15]報(bào)道2.5g/L聚維酮碘已可達(dá)到消毒作用，較5g/L聚維酮碘相比患者主觀舒適度更好，球結(jié)膜充血、角膜上皮損傷更輕。樊芳等[16]報(bào)道50g/L聚維酮碘結(jié)膜囊沖洗30s能有效減少結(jié)膜囊細(xì)菌，對(duì)眼表的損傷小，白內(nèi)障術(shù)前結(jié)膜囊消毒是安全有效。Alp等[17]將50g/L和100g/L聚維酮碘注入前房一滴，均可引起嚴(yán)重的角膜毒性，認(rèn)為聚維酮碘結(jié)膜囊消毒必須防止聚維酮碘滲漏進(jìn)入前房。張碩基等[18]報(bào)道白內(nèi)障摘除術(shù)前使用50g/L聚維酮碘結(jié)膜囊消毒2.0min或3.5min較30s或1.0min更有效減少術(shù)前結(jié)膜囊細(xì)菌數(shù)量，消毒2.0min術(shù)后1h的角膜上皮損傷好于3.5min，認(rèn)為50g/L聚維酮碘結(jié)膜囊消毒2.0min是安全有效地預(yù)防感染措施。

綜上所述，聚維酮碘對(duì)角膜上皮細(xì)胞有氧化損傷作用，損傷呈濃度和時(shí)間依賴性。在保證結(jié)膜囊滅菌效果的情況下，適當(dāng)降低使用濃度或消毒時(shí)間，可以有效減少角膜上皮損傷。

2中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)眼科醫(yī)師分會(huì), 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)醫(yī)院感染專業(yè)委員會(huì), 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)消毒分會(huì), 等. 我國(guó)眼科手術(shù)管理、感染控制、消毒滅菌指南(一). 中華眼科雜志2016;52(3)：167-173