陳 晨，趙楠楠，符麗君，朱振華，閻 沖，祝家昌，修 皓

0引言

糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract)是糖尿病常見的并發(fā)癥，可導致患者視力障礙。目前我國是全球糖尿病人數(shù)最多的國家，2017年糖尿病人數(shù)為1.14億，預計到2045年將達到約1.5億[1]。晶狀體上皮細胞的凋亡是除先天性白內(nèi)障以外的所有類型白內(nèi)障發(fā)生的共同細胞學基礎[2]。晶狀體上皮細胞是晶狀體內(nèi)代謝最活躍的部分，該細胞呈單層排列，為晶狀體的生長、分化和損傷修復等提供基礎物質(zhì)及代謝能量。一旦正常生理功能被破壞，晶狀體纖維排列紊亂，晶狀體則出現(xiàn)混濁[3]。糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生與晶狀體上皮細胞的凋亡密切相關，研究表明40mmol/L葡萄糖能夠顯著上調(diào)晶狀體上皮細胞的凋亡[4]，其中細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表達可影響細胞凋亡。目前認為，在細胞周期進程中，Cyclin D1是G1期細胞周期素，其含量受生長因子等因素的調(diào)控，呈周期性變化[5]。本研究在體外不同濃度的高糖條件下培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞，探究其在創(chuàng)傷后Cyclin D1的表達，揭示Cyclin D1與糖尿病性白內(nèi)障之間可能存在的關系，為今后研究奠定基礎。

1材料和方法

1.1材料實驗細胞：人晶狀體上皮細胞(HLEB3)購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司；細胞總RNA及總蛋白提取試劑盒購自Magen公司；四甲基偶氮唑(MTT)、逆轉錄試劑盒、青霉素/鏈霉素、熒光定量PCR試劑盒、蛋白Marker購自Ferentas公司；特異性引物由天一輝遠生物科技有限公司合成；兔源Cyclin D1一抗、山羊抗兔二抗購自Abcam公司；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE上樣緩沖液購自于Biosharp公司；BCA法蛋白定量測定試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。主要儀器設備：熒光定量PCR儀[(FQD-48A(A4)，杭州博日科技有限公司]；超微量分光光度計(N50 Touch，德國Implen)；凝膠成像儀(ChemiDoc XRS，BioRad)；雙穩(wěn)定時電泳儀(DYY-8C，北京六一儀器廠)；A2生物安全柜(SG403A-HE，美國BAKER公司)；連續(xù)波長酶標儀(Epoch，美國Biotek公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)HLEB3細胞復蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時觀察細胞的生長情況，48h換液1次，當細胞生長接近90%融合時，按1∶3比例傳代，取處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖活力將處于對數(shù)生長期的HLEB3細胞按1×103個/孔密度接種于96孔板，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細胞長滿后，更換為含有不同終濃度葡萄糖[5.5(對照組)、10.5、15.5、25.5、30.5mmol/L]的培養(yǎng)液，并設空白調(diào)零孔，每組設5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，在各孔中加入MTT(5mg/mL)10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4～6h。棄去上清液，加入DMSO溶液150μL，低速振蕩10min，于全自動酶標儀570nm處讀取吸光度值，記錄每組調(diào)零后的吸光度值，根據(jù)每組的平均吸光度值評估細胞在不同葡萄糖濃度下的增殖活力。

1.2.3高糖預處理條件下細胞創(chuàng)傷刺激后Cyclin D1表達情況根據(jù)細胞增殖活力的測定結果，本研究最終選用25.5mmol/L葡萄糖濃度作為高糖模型的處理濃度。將處于對數(shù)生長期的HLEB3細胞接種于10個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h，第2d換用含25.5mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基預處理細胞至細胞長滿(1～3d)(高糖預處理組)，預處理后的細胞分為劃傷組(進行劃傷處理)和對照組(不進行劃傷處理)，分別于劃傷后0、12、24、48、72h收集細胞并提取細胞總RNA和總蛋白。

1.2.4非高糖預處理條件下細胞創(chuàng)傷刺激后Cyclin D1表達情況將處于對數(shù)生長期的HLEB3細胞接種于10個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h，第2d繼續(xù)用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞長滿(1～3d)(非高糖預處理組)，換用含25.5mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基，同時將細胞分為劃傷組(進行劃傷處理)和對照組(不進行劃傷處理)，分別于劃傷后0、12、24、48、72h收集細胞并提取細胞總RNA和總蛋白。

1.2.5 qRT-PCR法檢測Cyclin D1 mRNA的表達胰蛋白酶消化細胞后按照試劑說明書提取總RNA，進行cDNA逆轉錄。將所得cDNA濃度稀釋至250ng/μL后進行熒光定量PCR。引物序列：Cyclin D1引物F：CTCGGTGTCCTACTTCAAATGT，R：TCCTCGCACTTCTGTTCCT，該引物來自于NCBI比對結果(NM_053056.2)；β-actin引物F：ACCCTGAAGTACCCCATCGAG，R：ACATGATCTGGGTCATCTTCTCG，該引物來自于參考文獻[6]。反應體系為25μL：2×SYBGreen Master Mix 12.5μL，正反向引物各1μL，cDNA 1μL，ddH2O補齊至25μL。反應程序采用三步法進行擴增：50℃ 2min；95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 15s，40個循環(huán)，每次實驗均設3個重復，每個時間點均設3次實驗重復以避免偶然因素影響，采用2-ΔΔCt方法計算相對表達量。

1.2.6 Western blot法分析Cyclin D1蛋白表達情況胰蛋白酶消化細胞后按照試劑說明書逐步操作提取總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度，于-80℃保存。將提取總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1～2h，加入兔抗人Cyclin D1一抗(1∶10000)，4℃孵育過夜，PBST沖洗3次后加入山羊抗兔二抗(1∶10000)，室溫輕微震蕩孵育2h，PBST沖洗3次，黑暗條件下加入ECL反應5～15min，在BioRad化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光1～15min，以β-actin為內(nèi)參。

2結果

2.1不同濃度葡萄糖對細胞增殖活力的影響MTT檢測結果顯示，一定濃度的葡萄糖會使HLEB3細胞增殖活力增強，其中25.5mmol/L葡萄糖處理HLEB3細胞24h時細胞的增殖活力出現(xiàn)最大值，濃度超過25.5mmol/L葡萄糖處理HLEB3細胞24h細胞的增殖活力下降，故后續(xù)實驗選擇25.5mmol/L葡萄糖培養(yǎng)細胞(圖1)。

2.2高糖預處理細胞創(chuàng)傷刺激后形態(tài)變化倒置顯微鏡下觀察高糖預處理組和非高糖預處理組細胞在劃傷刺激條件下不同時間點的形態(tài)變化(圖2)，結果顯示，劃傷后0h，劃傷處兩組細胞形態(tài)無明顯差別，均呈均勻單層貼壁生長，形態(tài)規(guī)則，劃傷處邊緣細胞有少量細胞呈漂浮狀，劃痕中間無細胞生長。劃傷后12、24h，兩組細胞形態(tài)并無多大差別，劃傷處邊緣的細胞已經(jīng)重新貼壁，并開始向外

圖1 不同濃度葡萄糖對晶狀體上皮細胞增殖活力的影響。

圖2 倒置顯微下觀察劃傷處理不同時間細胞形態(tài)變化(×100)。

表1 高糖預處理組細胞Cyclin D1 mRNA表達情況

生長，劃傷處由不平整逐漸趨于平滑，但高糖預處理組細胞數(shù)量明顯少于非高糖預處理組。隨著時間延長，劃傷處產(chǎn)生細胞凸起，劃痕間距明顯縮小。劃傷后48h，兩組細胞形態(tài)有明顯差異，非高糖預處理組細胞生長速度明顯快于高糖預處理組，細胞數(shù)量和細胞凸起明顯較多，且劃痕間距明顯小。劃傷后72h，兩組細胞形態(tài)差異沒有劃傷48h時明顯，但較其他觀察時間點劃傷邊緣處不再平整，細胞凸起要多?？傮w而言，高糖預處理對HLEB3細胞的生長具有抑制性，特別是在劃傷刺激后48h。

2.3高糖預處理組細胞Cyclin D1表達情況對高糖預處理組qRT-PCR數(shù)據(jù)進行分析，結果顯示，對照組和劃傷組細胞Cyclin D1 mRNA表達水平差異具有統(tǒng)計學意義(F組間=59.073，P組間<0.001；F時間=35.349，P時間<0.001；F交互=11.162，P交互<0.001)。劃傷24、72h時，兩組細胞Cyclin D1 mRNA表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(t=-10.775、-21.266，均P<0.01)。與劃傷0h時比較，對照組劃傷后12、24、48h時細胞Cyclin D1 mRNA表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；劃傷組劃傷后48、72h時細胞Cyclin D1 mRNA表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1，圖3。綜上，高糖預處理HLEB3細胞后，隨著時間的延長，細胞Cyclin D1 mRNA的表達水平總體呈下降趨勢，而劃傷處理后24、72h其表達水平明顯上調(diào)。Western blot檢測結果顯示，高糖預處理能夠明顯抑制Cyclin D1蛋白的表達，而劃傷刺激在一定程度上可上調(diào)Cyclin D1蛋白的表達水平(圖4)，與qRT-PCR檢測結果基本一致，表明高濃度葡萄糖長時間作用能夠抑制人晶狀體上皮細胞Cyclin D1的表達水平，而劃傷處理能夠上調(diào)Cyclin D1的表達。

圖3 高糖預處理組細胞Cyclin D1 mRNA表達情況 aP<0.05, bP<0.01 vs 同組0h。

2.4非高糖預處理組細胞Cyclin D1表達情況對非高糖預處理組qRT-PCR數(shù)據(jù)進行分析，結果顯示，對照組和劃傷組細胞Cyclin D1 mRNA表達水平差異具有統(tǒng)計學意義(F組間=18.707，P<組間0.012；F時間=108.193，P時間<0.001；F交互=16.097，P交互<0.001)。劃傷48h時，兩組細胞Cyclin D1 mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義(t=-8.097，P<0.001)。兩組劃傷后12、48h時細胞Cyclin D1 mRNA表達水平分別與劃傷0h時比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2，圖5。綜上，未經(jīng)高糖預處理的HLEB3細胞在進行高糖處理后，隨著時間的延長，細胞Cyclin D1 mRNA表達水平呈現(xiàn)出不規(guī)律性，在高糖處理12、48h時其表達水平明顯上調(diào)，而劃傷處理后，細胞Cyclin D1的表達總體無明顯變化，但劃傷48h時其表達水平明顯上調(diào)。Western blot檢測結果(圖6)與qRT-PCR檢測結果基本一致，表明人晶狀體上皮細胞處于高糖環(huán)境下的最初一段時間，細胞對Cyclin D1的表達具有一定的自我調(diào)控能力，能夠通過調(diào)控Cyclin D1的表達從而彌補由于高糖環(huán)境導致的細胞數(shù)量減少，而劃傷處理能夠上調(diào)Cyclin D1的表達。

表2 非高糖預處理組細胞Cyclin D1 mRNA表達情況

圖4 Western blot檢測高糖預處理組細胞Cyclin D1蛋白表達A: 對照組; B: 劃傷組。

圖5 非高糖預處理組細胞Cyclin D1 mRNA表達情況 bP<0.01 vs 同組0h。

圖6 Western blot檢測非高糖預處理組細胞Cyclin D1蛋白表達 A: 對照組; B: 劃傷組。

3討論

糖尿病性白內(nèi)障已成為眾多糖尿病眼病并發(fā)癥中位居第二的并發(fā)癥[7]。糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機制有很多，如滲透壓改變、晶狀體蛋白氧化[8]、晶狀體上皮細胞線粒體自噬[9-11]、晶狀體細胞周期變化等。有研究表明，高濃度葡萄糖處理晶狀體上皮細胞，可以誘導細胞進入細胞分裂，但隨著處理時間的延長高濃度葡萄糖對細胞分裂可產(chǎn)生負面影響，從而阻止細胞繼續(xù)進行有絲分裂[12]。本研究中，MTT檢測結果顯示，一定濃度的葡萄糖會使晶狀體上皮細胞增殖活力增強，且葡萄糖濃度為25.5mmol/L時細胞增殖活力最大，超過該濃度細胞增殖活力下降，本研究結果與趙婷婷等[13]研究結果相符。糖尿病患者往往是在患糖尿病多年后才出現(xiàn)糖尿病性白內(nèi)障，而以往研究在研究高糖對晶狀體上皮細胞影響時并未采用高濃度葡萄糖預處理晶狀體上皮細胞來模擬糖尿病患者長期患病導致白內(nèi)障這一情況。故本研究設置25.5mmol/L葡萄糖預處理組和未用25.5mmol/L葡萄糖預處理組，采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，高糖預處理組細胞生長速度明顯慢于非高糖預處理組，且在劃傷刺激后48h特別明顯。陳文靜等[14]研究表明低濃度的葡萄糖(5mmol/L)即可誘導人晶狀體上皮細胞凋亡，本研究結果提示，短暫的高濃度葡萄糖作用會增加晶狀體上皮細胞活性，但長期的高糖環(huán)境會抑制人晶狀體上皮細胞活性，這就解釋了為什么糖尿病性白內(nèi)障往往會出現(xiàn)在糖尿病中后期，而不是前期。

細胞周期受細胞周期蛋白(Cyclin)的調(diào)控，其中主要起作用的是Cyclin D1和Cyclin E1。Cyclin D1主要調(diào)控節(jié)點是G1/S期，Cyclin D1能夠激活細胞周期蛋白依賴性激酶，從而使細胞由G1期進入到S期，促進細胞有絲分裂的進行[15]。本研究中，qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，高糖預處理組人晶狀體上皮細胞中Cyclin D1的表達隨著處理時間延長總體呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，結果與Chang等[12]報道的高糖處理晶狀體上皮細胞對細胞分裂的影響結果基本一致。我們發(fā)現(xiàn)，劃傷處理能夠顯著刺激高糖預處理組人晶狀體上皮細胞Cyclin D1的表達。同樣，我們還發(fā)現(xiàn)，劃傷處理也能夠在一定程度上刺激非高糖預處理組細胞Cyclin D1的表達，但表現(xiàn)出不規(guī)律性，其最高表達時間點出現(xiàn)在劃傷后48h，這與任潔等[16]研究發(fā)現(xiàn)高糖處理晶狀體上皮細胞后48h細胞活性最強結果存在一定的相似性。

綜上所述，本研究將體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞分為高糖預處理組與非高糖預處理組，同時每組內(nèi)又設置劃傷組和對照組，觀察高糖培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞在創(chuàng)傷后Cyclin D1的表達情況，結果證實短暫的高濃度葡萄糖處理人晶狀體上皮細胞能夠增強細胞活性，上調(diào)Cyclin D1的表達，長時間的高糖環(huán)境則能夠抑制細胞活性，下調(diào)Cyclin D1的表達，而劃傷處理能夠刺激Cyclin D1的表達。但高糖具體如何影響Cyclin D1表達，劃傷又是以何種機制調(diào)控Cyclin D1表達，尚不清楚，故Cyclin D1能否作為治療糖尿病性白內(nèi)障的藥物靶點還有待進一步的探究。