胡立巧，張精精，董永平

(安徽工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，安徽馬鞍山243032)

電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)是一種將電化學(xué)與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的現(xiàn)代分析方法，通過(guò)施加一定的電壓或電流使具有發(fā)光性能的物質(zhì)在電極表面發(fā)生某種電化學(xué)反應(yīng)，發(fā)光體由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)以光的形式釋放能量回到基態(tài)，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象[1]。近年來(lái)，ECL因其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍寬、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、免疫分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域[2-4]。

大環(huán)分子可與目標(biāo)分子形成配合物或包合物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子高靈敏性和高選擇性檢測(cè)。β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)由7個(gè)D-吡喃葡萄糖單元構(gòu)成，具有疏水性空腔和親水性外部，可與目標(biāo)分子選擇性結(jié)合。β-環(huán)糊精已被廣泛用于電分析化學(xué)，如β-環(huán)糊精功能化的金納米顆粒修飾電極用于抗壞血酸的檢測(cè)[5]；β-環(huán)糊精修飾的銀納米顆粒自修飾錫電極用于對(duì)硝基芳香烴異構(gòu)體的痕量檢測(cè)[6]；β-環(huán)糊精功能化的鈀納米顆粒修飾電極用于汞離子的檢測(cè)[7]。二氰二胺(dicyandiamide，DCD)是一種重要化工生產(chǎn)原料，廣泛用于制作涂料、薄膜膠、包裝膠黏劑等，但其具一定毒性，對(duì)人體和環(huán)境均有危害，因此研究二氰二胺的檢測(cè)方法具有現(xiàn)實(shí)意義。檢測(cè)二氰二胺的方法有高效液相色譜法[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]、紫外光譜法[10]和拉曼光譜法[11]等，但這些方法存在操作復(fù)雜、成本較高等缺點(diǎn)。鑒于此，文中采用滴涂法制備β-環(huán)糊精修飾電極(β-CD/GCE)，研究二氰二胺濃度對(duì)魯米諾在β-CD/GCE上ECL強(qiáng)度的增強(qiáng)作用，建立檢測(cè)二氰二胺的電致化學(xué)發(fā)光新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

MPI-B型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司)，CHI760D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，LS-55熒光光譜儀(珀金埃爾默有限公司)，L8雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)。三電極系：β-環(huán)糊精修飾電極為工作電極、飽和甘汞電極(SCE)為參比電極、鉑絲電極為輔助電極。鹽酸多巴胺購(gòu)自上海阿拉丁科技有限公司，β-環(huán)糊精購(gòu)自阿達(dá)瑪斯試劑有限公司，魯米諾購(gòu)自Sigma，其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 修飾電極的制備

將玻碳電極先后用粒徑為0.3 μm 和50 nm的Al2O3拋光粉處理至鏡面，再用無(wú)水乙醇、去離子水超聲清洗，在0～1.5 V(vs.SCE)電位區(qū)間循環(huán)伏安掃描至伏安圖重現(xiàn)，表明電極處理干凈。將8 μL β-環(huán)糊精懸浮液滴涂在玻碳電極表面，干燥后即得β-環(huán)糊精修飾玻碳電極（β-CD/GCE）。

1.3 測(cè)試方法

在CHI760D電化學(xué)工作站進(jìn)行循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)，探究魯米諾在β-CD/GCE和空白電極(bare GCE)的電化學(xué)響應(yīng)情況，電位窗口為-1.5～1.5 V，掃描速度為0.1 V/s，電解質(zhì)溶液為含1.0×10-5mol/L魯米諾的0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS，pH值7.4)。采用MPI-B型化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)測(cè)試β-CD/GCE上的電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)，光電倍增管高壓設(shè)定為800 V，電位窗口為-1.5～1.5 V，掃描速度為0.1 V/s，依據(jù)發(fā)光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)二氰二胺的定量測(cè)量。魯米諾(luminol)、β-環(huán)糊精(β-CD)、魯米諾/β-環(huán)糊精(luminol/β-CD)、魯米諾/β-環(huán)糊精/二氰二胺(luminol/β-CD/DCD)等熒光光譜和紫外-可見(jiàn)光譜分別用LS-55熒光光譜儀和L8雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得。用濃度為10-5mol/L的抗壞血酸(AA)、多巴胺(DA)、鄰苯二酚(CA)、對(duì)苯二酚(HQ)、間苯二酚(RE)等分析物進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，評(píng)估β-CD/GCE在1.0×10-5mol/L魯米諾中的選擇性。電化學(xué)阻抗譜在濃度為5×10-3mol/L[Fe(CN)6]3-/4-和0.1 mol/L ΚCl的電解質(zhì)溶液中進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-環(huán)糊精的電化學(xué)與電致化學(xué)發(fā)光行為

1.0×10-5mol/L魯米諾在空白電極(bare GCE)與β-環(huán)糊精修飾玻碳電極(β-CD/GCE)的循環(huán)伏安曲線和電致發(fā)電曲線如圖1。

圖1 魯米諾在bare GCE及β-CD/GCE上的循環(huán)伏安曲線和電致化學(xué)發(fā)光曲線Fig.1 Cyclic voltammetric curves and ECL curves of luminol on bare GCE and β-CD/GCE

由圖1(a)可見(jiàn)：β-CD/GCE上的電流比空白電極上有一定增加，但魯米諾的氧化過(guò)程(0.5 V)沒(méi)有明顯變化，β-環(huán)糊精不能催化魯米諾的電化學(xué)氧化過(guò)程。由圖1(b)可見(jiàn)：魯米諾在β-CD/GCE上的ECL強(qiáng)度比空白電極高出近4倍，β-CD能夠增強(qiáng)魯米諾的電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度，主要是因?yàn)棣?CD的空腔尺寸與魯米諾的空腔尺寸相匹配，有助于魯米諾在電極表面的固載，從而增強(qiáng)ECL強(qiáng)度[12]；加入濃度為1.0×10-3mol/L的二氰二胺(DCD)，魯米諾在β-CD/GCE上ECL強(qiáng)度增加1倍，該ECL體系可用于二氰二胺的檢測(cè)。

β-CD，luminol，luminol/β-CD，luminol/β-CD/DCD的熒光光譜和紫外-可見(jiàn)光譜如圖2。由圖2可發(fā)現(xiàn)：luminol，luminol/β-CD，luminol/β-CD/DCD的吸收曲線重疊，β-環(huán)糊精和二氰二胺對(duì)魯米諾的吸收強(qiáng)度沒(méi)有影響，說(shuō)明β-環(huán)糊精和二氰二胺均不能與魯米諾發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；魯米諾的熒光發(fā)射峰位于425 nm處，β-環(huán)糊精和二氰二胺不產(chǎn)生熒光發(fā)射，推測(cè)luminol/β-CD/DCD體系的發(fā)光體是激發(fā)態(tài)魯米諾；在魯米諾溶液中加入β-環(huán)糊精，熒光峰位置未變，峰強(qiáng)度卻增加，說(shuō)明β-環(huán)糊精與魯米諾間沒(méi)有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，但兩者之間存在電荷轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)；體系中加入二氰二胺后熒光峰的位置未變，但峰強(qiáng)度略有降低，說(shuō)明二氰二胺與β-環(huán)糊精存在與魯米諾反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。

圖2 β-CD，luminol，luminol/β-CD，luminol/β-CD/DCD的紫外-可見(jiàn)光譜和熒光光譜Fig.2 UV-vis spectra and fluorescence spectra of β-CD,luminol,luminol/β-CD,luminol/β-CD/DCD

2.2 ECL實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

β-環(huán)糊精修飾玻碳電極在pH值為6.0～8.0魯米諾溶液中的電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)如圖3(a)。由圖3(a)可看出，隨著pH值增加，魯米諾在β-CD/GCE上的ECL強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。因中性條件下對(duì)生物分子的檢測(cè)更具意義，故文中選擇pH=7.4的中性溶液為工作溶液。

濃度為1.0×10-5mol/L魯米諾溶液中β-環(huán)糊精修飾量對(duì)ECL強(qiáng)度的影響如圖3(b)。由圖3(b)可看出，隨著β-環(huán)糊精修飾量的增加，ECL強(qiáng)度先增加后降低，修飾量為8 μL時(shí)ECL強(qiáng)度最大。因此，選擇β-環(huán)糊精修飾量為8 μL時(shí)作為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。

不同修飾量β-環(huán)糊精修飾玻碳電極的電化學(xué)阻抗譜如圖3(c)。圖中：橫坐標(biāo)為實(shí)部的阻抗(Z')；縱坐標(biāo)是虛部的阻抗(-Z'')。由圖3(c)可看出：修飾電極在高頻區(qū)Nyquist圓的半徑較大，對(duì)應(yīng)較大的電荷轉(zhuǎn)移阻力(Rct)；隨著β-環(huán)糊精修飾量的增加，Rct不斷增大，說(shuō)明電子的遷移阻力越來(lái)越大，這是由于β-環(huán)糊精自身的低導(dǎo)電性所致。由此進(jìn)一步說(shuō)明β-環(huán)糊精不是通過(guò)增強(qiáng)電子轉(zhuǎn)移過(guò)程來(lái)增強(qiáng)魯米諾的ECL強(qiáng)度，而是通過(guò)主客體分子的作用增加在電極表面魯米諾分子的濃度來(lái)增強(qiáng)ECL強(qiáng)度。

為評(píng)估β-CD/GCE 在濃度為1.0×10-5mol/L魯米諾中的選擇性進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3(d)。由圖3(d)可看出，除二氰二胺可增強(qiáng)ECL強(qiáng)度外，其他分析物對(duì)ECL強(qiáng)度產(chǎn)生抑制作用。表明，β-環(huán)糊精修飾玻碳電極對(duì)二氰二胺的ECL檢測(cè)具有良好的選擇性。

2.3 β-CD/GCE體系電極的性能分析

最佳實(shí)驗(yàn)條件下魯米諾ECL強(qiáng)度與二氰二胺濃度之間的關(guān)系及其擬合關(guān)系如圖4。由圖4(a)可看出：二氰二胺濃度在1.0×10-5～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)，隨其濃度的增加ECL信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；ECL強(qiáng)度(I)與二氰二胺濃度(c)的對(duì)數(shù)具很好的線性關(guān)系，線性回歸方程I=538.58logc+3 950.4，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 6(圖4(b))。為驗(yàn)證采用魯米諾β-CD/GCE的電致化學(xué)發(fā)光體系檢測(cè)二氰二胺方法的實(shí)用性，以自來(lái)水樣品為基底，通過(guò)加標(biāo)回收法測(cè)定樣品的回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3次實(shí)驗(yàn)的平均回收率為96%，表明魯米諾β-CD/GCE的電致化學(xué)發(fā)光體系不存在系統(tǒng)檢測(cè)誤差，可用于二氰二胺濃度的檢測(cè)。

圖3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of experimental conditions

圖4 β-CD/GCE的分析性能Fig.4 Analytical performances of β-CD/GCE

3 結(jié) 論

1)魯米諾作為發(fā)光試劑時(shí)，β-CD/GCE通過(guò)β-環(huán)糊精的主客體識(shí)別作用增加電極表面魯米諾分子的濃度，在中性條件下產(chǎn)生強(qiáng)烈的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

2)魯米諾ECL強(qiáng)度隨溶液pH值增加而增強(qiáng)；β-環(huán)糊精修飾量增加，ECL強(qiáng)度先增加后降低，修飾量為8 μL時(shí)ECL強(qiáng)度最大。

3)二氰二胺對(duì)魯米諾電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度有明顯的增強(qiáng)作用，在1.0×10-5～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)，電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與二氰二胺濃度的對(duì)數(shù)呈良好線性關(guān)系，魯米諾電致化學(xué)發(fā)光可用于二氰二胺濃度的檢測(cè)。