鞠愛霞，趙嬌，單萬亭，孫爽，肖洪彬，李秋紅

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

辛伐他汀(Simvastatin,SV)是常用他汀類口服片劑，對3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶有高度的選擇性抑制作用，使肝臟膽固醇合成減少而具有顯著的降血脂效果，因良好的患者依從性和較少的不良反應(yīng)而受到廣泛關(guān)注[1]。臨床研究表明[2-6]，辛伐他汀能夠有效預(yù)防心血管疾病，降低病死率。與其他他汀藥物(洛伐他汀、阿托伐他汀等)相比，辛伐他汀具有較好的治療效果, 更能提高患者的生命質(zhì)量[7]。他汀類藥物是被《美國心臟病學(xué)雜志》主編稱為能和青霉素媲美的藥物，用于心血管疾病的一級預(yù)防和治療。但心腦血管疾病機(jī)制較為復(fù)雜，包括血小板聚集、血液粘稠度增加、多種炎癥介質(zhì)釋放等[8-9]。臨床研究和實(shí)踐證實(shí)，燈盞花素(Breviscapine,BRE)(藥用燈盞細(xì)辛的有效成分)具有抗凝改善循環(huán)、抗炎抗氧化、抗凋亡、神經(jīng)保護(hù)、防止血栓形成等藥理作用[10-14]，對心腦血管疾病具有較好的療效[15-16]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[17-18]，燈盞花素與辛伐他汀聯(lián)用治療心腦血管疾病療效優(yōu)于辛伐他汀單獨(dú)治療。辛伐他汀為轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2的底物[19-20]，而燈盞花素對轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2具有抑制作用，理論推測燈盞花素通過抑制MRP2，使辛伐他汀外排減少，導(dǎo)致辛伐他汀組織分布增加、血藥濃度增加、排泄減少等。但目前尚無基于MRP2的燈盞花素與辛伐他汀聯(lián)用后辛伐他汀轉(zhuǎn)運(yùn)過程的相關(guān)研究。因此，本研究建立高效液相色譜法，考察燈盞花素和辛伐他汀聯(lián)用后對小鼠體內(nèi)辛伐他汀的組織分布的影響和大鼠膽汁累計(jì)排泄的影響，同時應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)和免疫蛋白印跡 (Western blot)技術(shù)測定藥物對大鼠肝臟MRP2mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)的影響，為燈盞花素與辛伐他汀兩藥在臨床上的合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料

1.1 藥品與試劑

辛伐他汀對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100601-201003)，辛伐他汀片(濟(jì)南利民制藥有限責(zé)任公司，批號：1511424-3)，洛伐他汀對照品(內(nèi)標(biāo)，中國食品藥品檢定研究所，批號：100601-201003)，燈盞花素注射液(石藥銀湖制藥有限公司，批號：1011604262)，戊巴比妥鈉(Merck試劑公司，批號：P11011)，動物組織RNA快速抽提試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司，批號：D301KA4963)，引物序列：MRP2及β-actin引物(上海生工生物工程股份有限公司)，Quant One Step RT-PCR試劑盒(北京天根生物技術(shù)股份有限公司，批號：P4808)，ECL發(fā)光液(碧云天生物技術(shù)公司，批號：EL0419004)，乙腈(TEDIA試劑公司，批號：AS1122-001)，氯仿其他試劑均為色譜純純，水為超純水。

1.2 儀器

LC-2010A型高效液相色譜儀(日本島津公司)，KL512型氮?dú)獯蹈蓛x(北京成萌偉業(yè)有限公司)，DY89-II型勻漿儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，PTC-200型PCR擴(kuò)增儀(上海蘊(yùn)策生物科技有限公司)，UV-722型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，GIS2010型凝膠圖像處理設(shè)備(上海天能科技有限公司)，AlphaEaseFC4.0型紫外凝膠成像系統(tǒng)(美國)，Legra64R型BECKMANAL低溫高速離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特有限公司)，Direct Detect III型紅外微定量分析儀(上海默克化工技術(shù)有限公司)，BIO-RAD Universal Hood III型成像系統(tǒng)(美國Bio-Bard公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

健康SD雄性大鼠，周齡8～10周，體質(zhì)量180～220 g，健康KM雄性小鼠，周齡6～8周，體質(zhì)量25～30 g，均購于青島派特福德白鼠養(yǎng)殖公司SCXK(魯)2014-004。

2 方法

2.1 給藥方案及樣品采集

將60只健康KM小鼠隨機(jī)均分成2組，辛伐他汀組尾靜脈注射生理鹽水；燈盞花素與辛伐他汀組尾靜脈注射燈盞花素(40 mg·kg-1)連續(xù)給藥7 d，末次給藥后同時灌胃辛伐他汀(80 mg·kg-1)，兩組分別于0.5 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h處死小鼠，取心、肝、腎、腦組織，取一定量組織，加入適量生理鹽水，勻漿，各組織勻漿樣品置-20 ℃冷凍保存。

10只健康SD大鼠隨機(jī)均分成2組，辛伐他汀組：尾靜脈注射生理鹽水;燈盞花素與辛伐他汀組：尾靜脈注射燈盞花素(20 mg·kg-1)給藥7 d，末次給藥后同時灌胃辛伐他汀(20 mg·kg-1)，兩組分別采集0～2 h，2～4 h，4～6 h，6～8 h，8～12 h，12～24 h的膽汁樣品，記錄不同時間段膽汁樣品的體積，置-20 ℃冷凍保存。

2.2 生物樣品處理

將組織/膽汁樣品置于1.5 mL離心管中，加入50 μL洛伐他汀內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋30 s，加入氯仿1 mL渦旋混合5 min，離心10 min，取上清夜，向離心管中再次加入氯仿1 mL重復(fù)上述操作，合并兩次上清液，37 ℃氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL流動相復(fù)溶，渦旋 30 s，取上清液進(jìn)樣測定。

2.3 RT-PCR測肝臟MRP2 mRNA表達(dá)水平

20只SD大鼠隨機(jī)平均分成生理鹽水組，燈盞花素注射液組，辛伐他汀組，燈盞花素注射液與辛伐他汀組，連續(xù)給藥7 d，末次給藥后禁食12 h，處死，取出肝臟，生理鹽水清洗，濾紙吸干水分。用動物總RNA快速抽提試劑盒提取RNA，所得RNA樣品進(jìn)行光密度和凝膠電泳檢測，A260/A280值均在1.8～1.9之間，凝膠電泳經(jīng)AlphaEaseFC4.0型紫外凝膠成像系統(tǒng)處理在5 s，18 s，28 s處有明顯條帶，說明提取的RNA純度較高，結(jié)構(gòu)完整。樣品按Fast Quant 一步法RNA試劑盒說明書操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列：MRP2:5′sense5′-TTACCTCCATCACCCTCTTCAA-3′,3′Antisens5′-TCGTCTCCTCCCAAATACCTCT-3′;β-actin:5′sense5′-TTCAACGGCACAGTCAAG-3′,3′Antisense5′-CACACCCATAACAAACAT-3′)，所得產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳(100 V,1 h)，并用Image-Pro Plus軟件分析灰度值。

2.4 Western blot測肝臟MRP2蛋白表達(dá)量

提取肝臟MRP2蛋白，紅外微定量分析儀測蛋白濃度。制備8%分離膠和5%的濃縮膠，進(jìn)行電泳(60 V,30 min;100 V,1.5 h)，轉(zhuǎn)膜時間依分子量大小而定MRP2(15 V，20～30 min)、β-actin(15 V，20～30 min)，封閉(2 h)，進(jìn)行一抗和二抗孵育，ECL發(fā)光顯影，Image lab軟件測定光密度值和灰度值。目的基因的蛋白相對表達(dá)量=目的基因蛋白表達(dá)量/內(nèi)參基因蛋白表達(dá)量。

2.5 生物樣品中辛伐他汀方法學(xué)考察

2.5.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil(R) C18(150 mm×4.6 mm)，流動相：乙腈-0.15%冰醋酸水溶液(64∶36，v/v)，流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：238 nm，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。

2.5.2 專屬性考察

分別取空白生物樣品、空白生物樣品+洛伐他汀對照品(100 ng/mL)+辛伐他汀對照品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品后，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，生物樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾辛伐他汀和內(nèi)標(biāo)的測定。辛伐他汀保留時間分別為13.5 min左右，內(nèi)標(biāo)洛伐他汀保留時間分別為10.5 min左右。液相色譜圖見圖1。

圖1 辛伐他汀色譜圖(1-內(nèi)標(biāo)，2-辛伐他汀)

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

辛伐他汀各生物樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍如表1所示，r2>0.99，符合生物樣品分析要求。

表1 辛伐他汀各生物樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.5.4 精密度與準(zhǔn)確度考察

辛伐他汀日內(nèi)、日間精密度RSD<10%，相對回收率在90%～110%之間，精密度和準(zhǔn)確度達(dá)到要求。結(jié)果見表2。

2.5.5 穩(wěn)定性考察

各組織和膽汁生物樣品中辛伐他汀的高、中、低3個濃度在室溫能穩(wěn)定保存24 h，于-20 ℃冷凍保存能穩(wěn)定21 d，解凍-冷凍重復(fù)循環(huán)3次仍能保持穩(wěn)定；辛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品貯備液在室溫下放置24 h或置于-20 ℃保存30 d后仍然是穩(wěn)定。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表2 辛伐他汀的精密度及方法回收率

3 結(jié)果

3.1 燈盞花素對辛伐他汀組織分布的影響

辛伐他汀進(jìn)入小鼠體內(nèi)后迅速向各組織中分布，結(jié)果如表3，在0.5 h即可被檢測到，辛伐他汀在各組織中分布濃度由高到低依次為：肝>腎>心>腦。各組織中，辛伐他汀的濃度隨著時間的變化如圖2所示。與辛伐他汀組比較，燈盞花素和辛伐他汀組顯著增加辛伐他汀在各組織中的分布量，尤其在2 h、4 h、8 h、12 h時，肝中辛伐他汀的濃度含量增加均有顯著性差異(P<0.05)，表明燈盞花素可顯著增加各組織中辛伐他汀的分布量，且對于肝臟的藥物分布影響最為顯著，可能有利于提高肝臟靶器官的藥物濃度，從而提高藥物的療效。

表3 各組織不同時間點(diǎn)辛伐他汀的濃度

圖2 心臟、腎臟、肝臟、腦中辛伐他汀的藥物濃度(n=5)

3.2 燈盞花素對辛伐他汀膽汁排泄的影響

辛伐他汀各時間段的膽汁累積排泄量如表4所示，平均膽汁累積排泄量-時間曲線如圖5，表明0～2 h內(nèi)檢測到辛伐在膽汁的排泄，2～4 h排泄量最大，6 h內(nèi)辛伐他汀的排泄速度較快及排泄量較大隨后逐漸平緩。與辛伐他汀組相比，燈盞花素與辛伐他汀組的平均膽汁排泄量顯著性降低，尤其在4 h～8 h內(nèi)差距逐漸增大，在24 h內(nèi)膽汁累積排泄量降低了2.21%，表明燈盞花素抑制辛伐他汀的膽汁排泄。

表4 各組辛伐他汀不同時間段的膽汁累積排泄量

圖3 辛伐他汀平均膽汁累積排泄量-時間曲線(n=5)

3.3 MRP2 mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果

辛伐他汀組大鼠肝臟MRP2基因mRNA表達(dá)量略低于生理鹽水組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而燈盞花素組與燈盞花素+辛伐他汀聯(lián)合組均低于生理鹽水組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。從MRP2基因mRNA PCR擴(kuò)增圖看出，各組大鼠MRP2和β-actin均有表達(dá)，雖聯(lián)合組和燈盞花素單獨(dú)組大鼠肝臟MRP2基因mRNA表達(dá)量都降低，但兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明燈盞花素在mRNA水平上抑制了MRP2基因的表達(dá)量。結(jié)果見圖4、圖5、表5。

圖4 各組大鼠MRP2基因表達(dá)量

圖5 MRP2 mRNA PCR擴(kuò)增圖

3.4 MRP2蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

分析表明與生理鹽水組相比，燈盞花素組，燈盞花素與辛伐他汀聯(lián)合組以及辛伐他汀組的MRP2蛋白表達(dá)均降低，但都無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組大鼠在MRP2蛋白條帶均有表達(dá)，且聯(lián)合組的蛋白表達(dá)略低于燈盞花素單獨(dú)組表，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明燈盞花素對肝MRP2蛋白表達(dá)無影響。見圖6、圖7、表5。

圖6 各組大鼠MRP2蛋白表達(dá)

圖7 MRP2蛋白相對表達(dá)量

表5 各組大鼠MRP2mRNA和蛋白相對表達(dá)量

4 討論

MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)體是ABC家族的成員，廣泛存在于小腸、肝臟等組織器官，但在體內(nèi)表達(dá)最高的是肝臟，主要集中在肝細(xì)胞膽管側(cè)膜[21]，MRP2可以轉(zhuǎn)運(yùn)谷胱肝肽結(jié)合物、葡萄糖醛酸結(jié)合物或非結(jié)合型有機(jī)陰離子化合物，因而可以被多種藥物誘導(dǎo)或抑制，同時可能受某些蛋白受體及miRNA[22]等調(diào)控影響，從而改變藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響藥效，產(chǎn)生藥物相互作用。

本研究選擇臨床使用廣泛的燈盞花素注射液研究聯(lián)用后對辛伐他汀的影響及可能機(jī)制，結(jié)果燈盞花素對辛伐他汀的轉(zhuǎn)運(yùn)過程產(chǎn)生顯著影響，對MRP2 mRNA具有抑制作用但未在蛋白水平顯示，可能原因是存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及蛋白翻譯調(diào)控等；同時有研究表明，燈盞花素為葡萄糖醛酸苷，是轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2的底物[23-24]，而辛伐他汀是通過轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2排泄進(jìn)入膽汁，兩者競爭底物的可能性很大，因此燈盞花素對辛伐他汀轉(zhuǎn)運(yùn)過程的影響可能是通過燈盞花素抑制MRP2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平競爭性抑制一起作用的結(jié)果。此外，還有研究[25]證實(shí)可能是由于代謝酶CYP3A4介導(dǎo)的藥物相互作用，燈盞花素可以抑制CYP3A4酶活性，辛伐他汀是CYP3A4酶的底物，從而抑制辛伐他汀代謝使體內(nèi)辛伐他汀含量顯著增加。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，燈盞花素與辛伐他汀在治療劑量聯(lián)合應(yīng)用后燈盞花素通過抑制MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)體對辛伐他汀體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程產(chǎn)生影響，為兩藥臨床聯(lián)合應(yīng)用機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。由于藥物間的相互作用受多種因素影響，且存在種屬差異，本研究結(jié)果具有一定的局限性，因此，在人體內(nèi)單次或多次給藥后燈盞花素對辛伐他汀藥物轉(zhuǎn)運(yùn)過程是否有影響還需進(jìn)一步研究。