歐福勇 李珍麗 姚曉喜

423000 郴州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(歐福勇、姚曉喜)，耳鼻喉科(李珍麗)

以發(fā)病率高、致殘率高為特點(diǎn)的頸動脈粥樣硬化(carotid atherosclerosis，CAS)是導(dǎo)致患者腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作的主要原因之一。其主要病理改變在于頸動脈內(nèi)膜大量脂質(zhì)沉積，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等進(jìn)而導(dǎo)致動脈血管內(nèi)膜增生、血管重構(gòu)等惡性血管事件的發(fā)生[1]。研究表明，頸動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是CAS的始動環(huán)節(jié)[2]。因此，尋找有效的保護(hù)頸動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的手段對于CAS的治療具有重大意義。微小RNA(microRNA，miR)是具有調(diào)控功能的非編碼RNA，參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物性能[3]。已經(jīng)證實(shí)，miR-217、miR-34a參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡過程[4]。而近年來，miR-146a對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用引起關(guān)注。Anzola等[5]研究證實(shí)，miR-146a能夠調(diào)控腸道微血管內(nèi)皮細(xì)胞抵抗炎癥反應(yīng)。Wang等[6]研究顯示，miR-146a在由糖尿病引起的神經(jīng)性血管重構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但有關(guān)miR-146a對頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用尚未見報(bào)道。Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子1(janus activated kinase 2/signal transducer and activator of transcription 1，JAK2/STAT1)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化、增殖和凋亡等病理生理過程[7]。Gregersen等[8]報(bào)道，STAT1在CAS中存在表達(dá)異常的現(xiàn)象。本研究通過構(gòu)建CAS動物模型，探討miR-146a和STAT1對頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞生理功能的影響，以期為臨床研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)生物 4月齡清潔級雄性新西蘭白兔40只，體重(2.0±0.2)kg，由我院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SYXK(湘)2018-0008，動物使用許可證號：SYXK(湘)2018-0007；依照我院實(shí)驗(yàn)動物管理辦法，室溫21℃～25℃下，濕度維持在60 %左右，自然光照、標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水、單籠飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

MiR-146a模擬物miR-146a-mimics及miR-146a模擬物陰性對照miR-146a-mimics-NC由上海吉瑪技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)完成。

1.1.2 試劑及主要儀器 LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(德國QIAGEN公司)；全蛋白抽提試劑盒(日本TOYOBO公司)；PBS緩沖溶液、EdU試劑盒(美國Invitrogen公司)；雙熒光素酶測定試劑盒Ⅰ、Ⅲ型膠原兔多克隆抗體(美國Abcamn公司)；麻醉劑、JAK2抗體、磷酸化STAT1(p-STAT1)抗體(美國Jackson公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Western blot試劑盒(美國Sigma公司)；Transwell小室(美國R&D公司)；TUNEL試劑盒(美國Amresco公司)。

YJ-875A醫(yī)用凈化工作臺(北京六一儀器廠)；LIOOS600T熒光顯微鏡(日本尼康公司)；Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad公司)；-80℃深冷冰箱(德國維根斯公司)；Leica RM2135組織切片機(jī)(德國Leica公司)；高速低溫離心機(jī)(北京六一儀器廠)；qRT-PCR儀(美國Palo Alto公司)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建頸動脈粥樣硬化動物模型及實(shí)驗(yàn)分組將40只新西蘭白兔按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，每組10只，分別為：假手術(shù)組(sham組)、模型組、miR-146a-mimics-NC組(對照組)和miR-146a-mimics組(實(shí)驗(yàn)組)。

準(zhǔn)確量取2.5 μL的LipofectamineTMRNAiMAX分別與9 μL的miR-146a-mimics-NC、miR-146a-mimics混合均勻，37℃下靜置2 h。通過尾靜脈分別注射7 μL混合液到對照組和實(shí)驗(yàn)組動物體內(nèi)，注射速度維持在2 μL/min，留針時(shí)長5 min，sham組和模型組注射等劑量的生理鹽水。注射完畢24 h后，采用150 g 2%L-蛋氨酸飼料喂養(yǎng)配合頸總動脈球囊損傷法構(gòu)建頸動脈粥樣硬化模型[9]。具體操作如下：sham組采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，模型組、對照組和實(shí)驗(yàn)組每日均使用150 g 2%L-蛋氨酸喂養(yǎng)，喂養(yǎng)2周后，施以球囊損傷造成頸內(nèi)動脈內(nèi)膜損傷，繼續(xù)以150 g/d 2%L-蛋氨酸喂養(yǎng)4周。球囊損傷手術(shù)如下：術(shù)前12 h禁食不禁水，耳緣靜脈注射1 ml/kg 3%戊巴比妥鈉麻醉，兔板固定在手術(shù)臺上，常規(guī)方法頸部備皮，沿頸正中線切開皮膚，剝離左側(cè)頸總動脈，用虹膜剪在頸總動脈遠(yuǎn)心端剪開一個(gè)V型切口將直徑為0.67 mm的球囊插入血管內(nèi)，使用微型注射器來回抽插注入空氣擴(kuò)張球囊，抽插距離不超過1.5 cm，抽插3次后撤出球囊，使用無菌7-0結(jié)扎線在頸正中線切口近心端處結(jié)扎頸外動脈，同時(shí)松開所有血管鉗，觀察頸動脈內(nèi)血流正常且無出血點(diǎn)，縫合頸部皮膚，術(shù)畢每日1次靜脈注射80萬單位青霉素注射液防止感染，連續(xù)3次。sham組只剝離頸內(nèi)動脈，不進(jìn)行球囊擴(kuò)張和結(jié)扎，余同模型組。

1.2.2 HE染色檢測CAS病理改變 喂養(yǎng)4周后，實(shí)驗(yàn)兔均禁食12 h后處死，剝離各組動物的頸內(nèi)動脈，80%的組織標(biāo)本進(jìn)行液氮封存，20%的組織標(biāo)本，56℃水浴1 h，生理鹽水沖洗10 min，10%甲醛溶液固定1 h，石蠟包埋10 min，切片，蒸餾水清洗3次，HE染色，光鏡下觀察CAS病變程度。

1.2.3 原代培養(yǎng)各組動物頸動脈的血管內(nèi)皮細(xì)胞取出20%各組組織標(biāo)本，將標(biāo)本上的脂肪、結(jié)締組織剔除干凈，使用微型剪在顯微鏡下將其剪成若干3 mm×3 mm的小片，內(nèi)皮向下貼入培養(yǎng)瓶中，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)4 h后，向培養(yǎng)瓶中加入含有滅活的10%FBS、peillin G、STC的DMEM培養(yǎng)基，在細(xì)胞密度達(dá)85%后，0.25%胰蛋白酶消化傳代進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的增殖情況調(diào)整各組細(xì)胞濃度，以5×104個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)2 h后，10%甲醛固定并進(jìn)行EdU實(shí)驗(yàn)，操作嚴(yán)格按照試劑盒操作要求進(jìn)行。

1.2.5 Transwell小室檢測各組細(xì)胞的遷移 調(diào)整各組細(xì)胞濃度，以5×104個(gè)/孔接種于24孔無血清培養(yǎng)板中，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，用DMEM重懸細(xì)胞至細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/L，將250 μL的細(xì)胞懸液加入Transwell上室，同時(shí)在Transwell下室中添加500 μL濃度為10%的FBS培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)12 h，PBS漂洗后用棉棒擦Transwell小室內(nèi)部，4%甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫室溫避光染色10 min，置于倒置熒光顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)穿過基底膜材料Matrigel細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 小管形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的血管生成能力 在96孔培養(yǎng)板上平鋪一層新鮮Matrigel溶膠，迅速轉(zhuǎn)移進(jìn)無菌培養(yǎng)箱設(shè)定37℃，待Matrigel溶膠凝固后，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以1×104個(gè)/ml接種在96孔板中，然后分組同上，分別加入各組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成情況并拍照記錄。

1.2.7 TUNEL染色檢測各組細(xì)胞的凋亡 調(diào)整各組細(xì)胞濃度，以5×104個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，置入37℃、5 %CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，10%甲醛固定，二甲苯浸洗兩次，梯度乙醇浸洗5 min，風(fēng)干后3%過氧化氫-甲醇浸泡10 min，PBS漂洗3次，每次3 min，然后4℃預(yù)冷乙醇上進(jìn)行如下操作：0.1% TritonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS漂洗3次，每次3 min，加入TUNEL反應(yīng)混合液，加封口膜在暗濕盒中反應(yīng)1 h，溫度37℃，PBS漂洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.8 qRT-PCR檢測miR-146a和STAT1蛋白的mRNA表達(dá) 取出10%組織標(biāo)本，采用常規(guī)方法提取各組實(shí)驗(yàn)動物頸動脈組織標(biāo)本細(xì)胞的RNA，并利用比色法和瓊脂糖凝膠電泳法測定RNA濃度和檢測RNA完整性[10]。采用多基因梯度進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，進(jìn)行引物序列設(shè)計(jì)，反應(yīng)過程：(1)預(yù)變性：75℃，120 s；(2)變性：90℃，5 min；(3)退火：60℃，60 s；(4)延伸72℃，30 s；(5)PCR儀采集熒光信號40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參(上游引物為5’-CACATGGCCTCCAAGGA-3’，下游引物為5’-TCCCCTCTTCAAGGGGT-3’)，目的基因miR-146a(上游引物為5’-GGACAATTTGGGCTAGA-3’，下游引物為5’-ACGTAGTTCTCCTGGCA-3’)，STAT1的mRNA(上游引物為5’-AGACAAATGGGCTACA-3’，下游引物為5’-AAAGCTGAGTTTGCGGA-3’)。目的基因相對表達(dá)量用2-△△CT表示。

1.2.9 熒光素酶報(bào)告基因分析 采用RT-PCR技術(shù)從新西蘭白兔的星形膠質(zhì)細(xì)胞基因組中選擇性擴(kuò)增目的蛋白STAT1的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，UTR)序列，一方面用于構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因分析(luciferase reporter gene)中的載體pGL3(pGL3-STAT1-WT)，另一方面構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒(pGL3-STAT1-MUT)，將人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)按25%左右密度接種在36孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)板上將miR-146a-mimics和miR-146a-mimics-NC與空載質(zhì)粒及上述質(zhì)粒分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染完成24 h后，嚴(yán)格按照雙熒光素酶測定試劑盒說明書進(jìn)行操作測定樣本的熒光素酶活性，而螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報(bào)告基因活性。

1.2.10 Western blot檢測各組標(biāo)本中JAK2、p-STAT1蛋白的表達(dá) 取出10%各組組織標(biāo)本，按照常規(guī)提取目標(biāo)蛋白JAK2和p-STAT1，加入RIPA組織裂解液中勻漿器打碎，冰上裂解30 min后，離心獲得上清，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，每個(gè)樣品取50 μg，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜、加入封閉液TBST，維持4℃過夜孕育，然后分別加入1∶1 500一抗(JAK2、p-STAT1)，孕育1 h，洗滌加入抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶10 000)，加入ECL顯色30 min，以GAPDH作為內(nèi)參表示蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色檢測各組實(shí)驗(yàn)兔的CAS病理改變

HE染色結(jié)果如圖1所示，sham組兔的頸動脈顏色均勻，柔軟且富有彈性，管腔通暢，內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞核性狀規(guī)則的定位在細(xì)胞中央，內(nèi)膜、中膜以及外膜界限清晰，內(nèi)膜細(xì)胞形狀規(guī)整多為扁平狀，中膜細(xì)胞多為橢圓形的平滑肌細(xì)胞，膠原和彈力纖維組織環(huán)繞周圍；模型組兔的頸動脈顏色發(fā)白或略顯黃色，管壁明顯增厚，僵硬度增加，管腔表面失去光澤，管腔內(nèi)可見粥樣或纖維斑塊，以致管腔狹窄，內(nèi)膜可見白色條紋或黃白色斑塊，內(nèi)皮細(xì)胞脫落明顯，脂質(zhì)泡沫細(xì)胞增生明顯，中層平滑肌細(xì)胞分布紊亂，性狀不規(guī)整，泡沫細(xì)胞大量填充，彈力纖維缺失、斷裂、溶解明顯，膠原纖維大量形成；對照組兔的頸動脈顏色黃白相間，彈性缺失，內(nèi)膜細(xì)胞增厚明顯，泡沫狀的細(xì)胞大量填充；實(shí)驗(yàn)組兔的頸動脈顏色略顯紅潤，彈性明顯恢復(fù)，內(nèi)膜細(xì)胞性狀較模型組明顯好轉(zhuǎn)，平滑肌細(xì)胞排列趨于規(guī)則，泡沫細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，管腔內(nèi)的薄層脂斑沉積明顯減少。

2.2 EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的增殖情況

EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)直接反映細(xì)胞內(nèi)DNA合成能力進(jìn)而代表細(xì)胞的增殖能力。本研究中EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示，與sham組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)DNA合成能力明顯下降；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)的DNA合成能力明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。模型組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

與sham組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.3 Transwell小室檢測各組細(xì)胞的遷移

Transwell小室檢測結(jié)果如圖3所示，與sham組相比，模型組細(xì)胞遷移數(shù)量明顯下降；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移數(shù)量明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。模型組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：sham組；B：模型組；C：對照組；D：實(shí)驗(yàn)組；與sham組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.4 小管形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的血管生成能力

血管生成主要是內(nèi)皮細(xì)胞的活化、發(fā)芽、增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成的復(fù)雜的細(xì)胞生理過程。本研究中小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，與sham組相比，模型組細(xì)胞小管形成數(shù)量明顯下降；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞小管形成數(shù)量明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。模型組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：sham組；B：模型組；C：對照組；D：實(shí)驗(yàn)組；與sham組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.5 TUNEL染色檢測各組細(xì)胞的凋亡

TUNEL染色結(jié)果如圖5所示，與sham組相比，模型組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯上升；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。模型組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 Western blot檢測各組標(biāo)本中JAK2、p-STAT1蛋白的表達(dá)

Western blot檢測各組標(biāo)本中JAK2和p-STAT1的蛋白表達(dá)水平如圖6所示，與sham組相比，模型組JAK2和p-STAT1的表達(dá)明顯升高(均為P<0.05)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組JAK2和p-STAT1表達(dá)明顯下降(均為P<0.05)。模型組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：sham組；B：模型組；C：對照組；D：實(shí)驗(yàn)組；與sham組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.7 qRT-PCR檢測各組標(biāo)本中miR-146a和STAT1蛋白的mRNA表達(dá)

qRT-PCR檢測各組標(biāo)本中miR-146a和STAT1的mRNA表達(dá)水平如圖7所示，與sham 組比較，模型組miR-146a的表達(dá)水平明顯降低，而STAT1的mRNA表達(dá)水平明顯升高(均為P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-146a-mimics后，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組miR-146a的表達(dá)水平明顯升高，而STAT1的mRNA表達(dá)水平明顯降低(均為P<0.05)；模型組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：sham組；B：模型組；C：對照組；D：實(shí)驗(yàn)組；與sham組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.8 熒光素酶報(bào)告基因分析

miR-146a與STAT1蛋白和mRNA的表達(dá)的變化趨勢存在一定的負(fù)向關(guān)系，在生物信息網(wǎng)站(www.microrna.org)上查詢miR-146a(3’ uuggguaccuu-AAGUCAAGAG-u 5’)和STAT1(5’ acaauuauuuu-UACAGUUCUC-c 3’)存在結(jié)合位點(diǎn)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因分析來觀察二者的關(guān)系結(jié)果如圖8所示，轉(zhuǎn)染miR-146a后，野生型STAT1的熒光素酶活性被抑制(P<0.05)，突變型STAT1的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，表明miR-146a與STAT1具有靶向調(diào)控關(guān)系。

圖8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果(n=10)

3 討論

CAS是一種頸動脈壁的具有潛在致死性的炎癥疾病，是機(jī)體全身動脈硬化的重要部分，血管內(nèi)皮損傷是其基礎(chǔ)病理改變。CAS的病因尚未完全闡明，年齡、肥胖、高血壓、高血脂、糖尿病、遺傳、生活方式等均可導(dǎo)致CAS的發(fā)生[11]。目前臨床上治療CAS主要通過外科手段如置入頸動脈血管成形支架手術(shù)、頸動脈粥樣斑塊切除手術(shù)及經(jīng)皮腔內(nèi)動脈成形術(shù)等來干預(yù)CAS的進(jìn)程[12]。但這些治療手段均對頸總動脈的血管內(nèi)皮細(xì)胞帶來二次損傷，使病灶位置出現(xiàn)動脈狹窄等嚴(yán)重病變[13]。因此，開展針對CAS的靶向治療的研究在臨床上具有重大研究意義。

絕大多數(shù)針對CAS的靶向治療的研究處于實(shí)驗(yàn)室階段。研究證實(shí)，miRNA不僅在CAS的細(xì)胞增殖與凋亡、自噬與分化中扮演重要角色，還可作為調(diào)控因子影響CAS的各個(gè)階段，如內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換等[14]。Magenta等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c在CAS的診斷中具有特異性。黃楦檳等[16]研究表明，過表達(dá)的miR-21直接推動CAS的發(fā)生、發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化。miR-146a是定位在5號染色體上的具有免疫調(diào)控功能的小分子RNA[17]。研究表明，在如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒癥等疾病中miR-146a能直接作用于炎癥因子受體負(fù)調(diào)控炎癥和免疫反應(yīng)，抑制免疫過度，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[18]。近來研究表明，miR-146a與血管的生物性能關(guān)系密切。Li等[19]研究表明，在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中增強(qiáng)miR-146a的表達(dá)，能明顯增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的抗炎癥反應(yīng)。Wu等[20]研究證實(shí)，miR-146a通過調(diào)控核因子κB的表達(dá)來參與冠心病大鼠血管平滑肌的凋亡。Fang等[21]則證實(shí)，miR-146a聯(lián)合內(nèi)皮干細(xì)胞作用減少急性冠心病動物模型的細(xì)胞凋亡。Shen等[22]報(bào)道，在頸動脈球囊損傷的動物模型中miR-146a的表達(dá)異常。本研究構(gòu)建CAS動物模型后，提取組織標(biāo)本頸內(nèi)動脈內(nèi)皮細(xì)胞，研究結(jié)果表明過表達(dá)miR-146a能明顯提高內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移能力以及血管生成能力，明顯降低了內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率。這與之前的研究結(jié)果一致。

JAK/STAT信號通路能將細(xì)胞膜感受到的信號直接傳導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)，瞬間激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，直接參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等生理活動[23]。STATs是JAKs激酶的底物，在細(xì)胞受到刺激(如損傷、高氧、高糖等因素)磷酸化后能直接與DNA結(jié)合，瞬時(shí)將酪氨酸信號耦聯(lián)放大，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。研究表明，p-STAT1在白細(xì)胞相關(guān)抗原、協(xié)同刺激因子、趨化因子等炎癥基因的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[24]。葛會生等[25]研究證實(shí)，激活JAK2/STAT1通路嚴(yán)重?fù)p傷內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能。本研究中qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明，在CAS模型組中STAT1的mRNA和p-STAT1表達(dá)升高，STAT1信號被激活，內(nèi)皮損傷明顯。通過生物信息網(wǎng)站預(yù)測miR-146a與STAT1存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告基因分析證實(shí)miR-146a靶向調(diào)控STAT1的表達(dá)，Western blot結(jié)果表明過表達(dá)miR-146a后，p-STAT1的表達(dá)明顯下降。表明miR-146a通過靶向調(diào)控STAT1的表達(dá)，來保護(hù)CAS中內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-146a和STAT1在頸動脈粥樣硬化中存在表達(dá)異常的現(xiàn)象，過表達(dá)miR-146a，能夠抑制STAT1的表達(dá)，發(fā)揮其保護(hù)頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能。但miR-146a是否還通過其他信號通路影響頸動脈粥樣硬化還需進(jìn)一步的研究。本研究中對從頸動脈粥樣硬化大白兔模型的頸內(nèi)動脈分離出的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了一系列的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，獲得了較為明顯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中miR-146a的靶向作用能否緩解動物的動脈粥樣硬化癥狀仍需深入考量。

利益沖突：無