劉林婭,楊 那,代 玥,羅 彩,陳 婷,黃亞成

(六盤水師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,貴州 六盤水 553000)

獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)隸屬獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl.),目前全世界共有54個(gè)種、21個(gè)變種[1]。從20世紀(jì)初被人工馴化栽培至今,獼猴桃的商業(yè)化種植栽培已在全世界展開,其中我國目前已成為栽培面積最大的國家[2]。獼猴桃果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特,富含豐富的維生素C、氨基酸、膳食纖維和多種礦物質(zhì),是近幾年世界上發(fā)展迅速的高檔水果之一[3]。此外,獼猴桃除了具有較高的營養(yǎng)價(jià)值外,還具有重要的保健功能[4],如:能通便和清理腸胃；降血脂；防治心血管??；預(yù)防癌癥等。因此,近些年獼猴桃越來越受到人們的廣泛關(guān)注。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)手段的發(fā)展,高通量測序[5]、mRNA純化[6]、cDNA文庫構(gòu)建[6]和Northern blot[7]等技術(shù)已被應(yīng)用到獼猴桃的研究中,而這些技術(shù)能夠開展的前提就是能夠得到純度高、質(zhì)量好且量多的總RNA。目前,植物中各組織總RNA的提取方法主要有以下幾種:(1)試劑盒提取方法。該方法在提取RNA時(shí)一般用時(shí)較短,且能得到較高質(zhì)量的RNA[8]。但是此方法一次提取的費(fèi)用較高,且提取量較少,不能滿足某些需要大量RNA的實(shí)驗(yàn)。(2)CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法。該法對(duì)于大多數(shù)的植物能夠得到較高質(zhì)量的RNA[9],但對(duì)于多糖多酚的植物組織,如果不加以改進(jìn),則很難適用。(3)熱硼酸法。硼酸鈉能夠很好地結(jié)合酚類物質(zhì)和沉淀糖類,獲得較高質(zhì)量的RNA[10],但不適用于蛋白含量多、成分復(fù)雜的植物組織。(4)SDS(十二烷基磺酸鈉)法。此方法對(duì)于橡膠樹膠乳中總RNA的提取效果好[11],但是其細(xì)胞裂解能力一般,對(duì)于多糖多酚的植物或者細(xì)胞壁較厚的組織細(xì)胞就很難獲得較高質(zhì)量的RNA。(5)Trizol法。該方法適于提取擬南芥[12]等植物幼嫩組織的總RNA,但對(duì)樹皮、根等組織的提取效果較差,且得到的RNA質(zhì)量一般也較差。此外,提取RNA的方法還有異硫氰酸胍法[13]、高鹽高pH法[14]、熱酚法[15]等等。不過,很難有一種方法適合所有植物組織的總RNA提取。因此根據(jù)不同植物組織的特點(diǎn)在現(xiàn)有的提取方法上改良出更優(yōu)的方法,從而獲得大量、高質(zhì)量的總RNA滿足實(shí)驗(yàn)需要很有必要。

獼猴桃屬于富含多糖、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素C、色素和多酚類物質(zhì)的植物材料,這對(duì)于總RNA的提取無疑帶來了大量的困難。為了能夠快速獲得大量、高質(zhì)量的獼猴桃RNA,本研究對(duì)CTAB法進(jìn)行了改良、優(yōu)化,利用改良的CTAB法對(duì)獼猴桃的7種組織(果實(shí)、雄花、雌花、葉片、種子、皮、根)進(jìn)行了總RNA的提取,并與試劑盒提取法進(jìn)行了比較,結(jié)果證實(shí)此方法適用于獼猴桃不同組織總RNA的提取,能夠得到大量、高質(zhì)量的總RNA,可以滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的獼猴桃品種為中華獼猴桃“紅陽”,種植在貴州省六盤水市米籮鄉(xiāng)獼猴桃基地。分別采集獼猴桃的果實(shí)、雄花、雌花、葉片、種子、皮和根,用錫箔紙包裹存入液氮中,運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃冰箱內(nèi)，備用。

1.2 試劑

CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、PVPP(交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、DTT(二硫蘇糖醇)、硼酸鈉、EDTA(乙二胺四乙酸)、β-巰基乙醇、LiCl(氯化鋰)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、NaAc(醋酸鈉)購于北京索萊寶科技有限公司;無氯仿多糖多酚植物RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司(RP3501)；Recombinant DNase I(RNase-free)(2270A)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(RR047A)購自大連寶生物工程有限公司; TransTaq?DNA Polymerase High Fidelity(HiFi)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司(AP131-11)；其他所用生化試劑均為國產(chǎn)分析純。引物在上海捷瑞生物工程有限公司合成；測序在上海生物工程技術(shù)有限公司完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 用改良的CTAB法提取獼猴桃各組織的總RNA 提取液配方:2%(w/v)CTAB, 100 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0), 20 mmol/L EDTA(pH 8.0),100 mmol/L硼酸鈉,2.8 mol/L NaCl, 1%(w/v)PVP, 1%(v/v)β-巰基乙醇(現(xiàn)用現(xiàn)加)。

將液氮中保存的植物樣品置于研缽,加入一定量的石英砂、DTT、PVPP,用液氮研磨成粉末,備用。稱取2 g研磨好的樣品,加入5 mL預(yù)熱過的提取液和50 μL β-巰基乙醇,在65 ℃下水浴15 min左右(期間振蕩混勻4～5次)。然后加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1),顛倒混勻,在4 ℃下以12000 r/min離心20 min。取上清,加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1),顛倒混勻,在4 ℃下以12000 r/min離心20 min。取上清,加入1/3體積的8 mol/L LiCl,在-20 ℃下放置6 h以上。在4 ℃下以12000 r/min離心20 min,然后倒掉上清,加入200 μL RNase-free的ddH2O溶解沉淀,轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管,加入1/10體積 3 mol/L NaAc(pH 5.2)和2.5倍體積的無水乙醇,充分混勻,在-20 ℃下放置2～4 h。在4 ℃下以12000 r/min離心 20 min,倒掉上清,沉淀用750 μL的75%乙醇漂洗2次,放于超凈工作臺(tái)上晾干,然后溶于60 μL RNase-free ddH2O中。

1.3.2 用試劑盒法提取獼猴桃各組織的總RNA 參照北京百泰克生物技術(shù)有限公司無氯仿多糖多酚植物RNA試劑盒說明書進(jìn)行獼猴桃各組織總RNA的提取。

1.3.3 總RNA中DNA的去除 使用大連寶生物工程有限公司的Recombinant DNase I(RNase-free)進(jìn)行總RNA中DNA的去除,具體操作參照該公司的操作說明書。

1.4 RNA的完整性、純度和濃度檢測

采用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性,在160 V電壓下電泳20 min后進(jìn)行凝膠成像。RNA的純度和濃度用NanoDrop 2000超微量核酸蛋白測定儀進(jìn)行測定,直接讀取總RNA濃度、OD260/OD280值和OD260/OD230值。

1.5 RT-PCR驗(yàn)證

使用大連寶生物工程有限公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成,按照該公司的說明書進(jìn)行操作。搜索本實(shí)驗(yàn)室的獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,獲得獼猴桃18S rRNA基因序列,設(shè)計(jì)引物(正向引物:5’-TGTGAAACTGCGAATGGCTC-3’;反向引物:5’-ATTTGAATGATGCGTCGCC-3’),以用兩種方法提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為擴(kuò)增模板進(jìn)行基因的擴(kuò)增。反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、cDNA模板1.5 μL、10 μmol/L的正向引物和反向引物各1 μL、Taq DNA Polymerase 0.2 μL(5 U/μL)、ddH2O 16.8 μL,共25 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA完整性的檢測結(jié)果

采用本實(shí)驗(yàn)室改良的CTAB法和無氯仿多糖多酚植物RNA提取試劑盒兩種方法分別提取了獼猴桃果實(shí)、雄花、雌花、葉片、種子、皮和根共7個(gè)組織的總RNA。如圖1和圖2所示,采用改良的CTAB法和試劑盒法都能在獼猴桃的7個(gè)組織中提取到總RNA,能看到有18S和28S兩條清晰條帶,其中28S條帶的亮度是18S條帶亮度的2倍左右,且兩條帶之間沒有明顯的拖尾現(xiàn)象。這表明這兩種方法都適用于獼猴桃不同組織中總RNA的提取,都能獲得完整性較高的總RNA。

1:果實(shí);2:雄花;3:雌花;4:葉片;5:種子;6:皮;7:根。下同。

圖2 用試劑盒法提取的總RNA電泳圖

2.2 RNA的純度和濃度檢測結(jié)果

利用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)對(duì)提取好的獼猴桃各組織的總RNA進(jìn)行檢測。由表1可知,所有RNA的OD260/OD280值在1.8～2.0之間,OD260/OD230值均大于2.0。這表明,不管是本實(shí)驗(yàn)室改良的CTAB法還是試劑盒法,提取得到的獼猴桃不同組織中的總RNA含有的雜質(zhì)較少,純度較高。比較用改良CTAB法和試劑盒法提取的總RNA的濃度,改良CTAB法的得率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于試劑盒法,說明該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)獼猴桃不同組織總RNA的大量提取。結(jié)合上述的電泳結(jié)果,說明采用本實(shí)驗(yàn)室的提取方法可以獲得大量、高質(zhì)量的獼猴桃各組織的總RNA。

表1 采用兩種方法提取獼猴桃7種組織的總RNA的純度和濃度

2.3 改良CTAB法和試劑盒法的RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

利用購自大連寶生物工程有限公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)兩種方法提取得到的獼猴桃各組織的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,獲得了cDNA的第一條鏈。進(jìn)一步選取內(nèi)參基因18S rRNA設(shè)計(jì)特異性引物,以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行RT-PCR,檢測提取得到的總RNA的質(zhì)量。圖3的電泳圖顯示,采用兩種方法分別提取的獼猴桃7個(gè)組織的總RNA都能擴(kuò)增得到與目的條帶大小相符的單一條帶。對(duì)所有擴(kuò)增條帶進(jìn)行測序,測序結(jié)果與18s rRNA的序列均一致。這表明,采用兩種方法提取得到的總RNA的質(zhì)量較高,這兩種方法適于獼猴桃不同組織總RNA的提取。

8:DL1000;7、9:果實(shí);6、10:雄花;5、11:雌花;4、12:葉片;3、13:種子;2、14:皮;1、15:根。

3 討論

眾所周知,提取富含多糖多酚的植物組織材料中的RNA難度一般較大。這主要是由于多糖類物質(zhì)會(huì)形成膠狀物質(zhì),很難通過離心得到上清溶液,且其理化性質(zhì)與RNA極其相似,常常會(huì)與RNA共沉淀導(dǎo)致很難去除[16]。而細(xì)胞中的多酚類物質(zhì)在細(xì)胞破碎后會(huì)迅速被氧化生成醌類物質(zhì),與RNA不可逆地結(jié)合,導(dǎo)致RNA褐化而難以溶解[17]。獼猴桃的果實(shí)富含多糖、多酚類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素C、色素和其他次生代謝物,屬于較難提取到大量、高質(zhì)量RNA的植物組織材料。據(jù)已有的研究報(bào)道,獼猴桃果實(shí)中總RNA的提取方法主要有改良的CTAB法[9]、總核酸提取法[18]、異硫氰酸胍提取法[13]、改良的SDS法[19]和試劑盒法[8]。但是相對(duì)而言,除了采用試劑盒法能夠得到質(zhì)量較高的總RNA外,其他已有方法的提取效果都不夠好。而且,之前這些方法主要用于獼猴桃果實(shí)RNA的提取,并沒有一種方法適用于獼猴桃所有組織材料RNA的提取。因此本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合了現(xiàn)有的RNA提取方法,以CTAB法為基礎(chǔ)進(jìn)行改良,獲得了一種能夠大量提取獼猴桃不同組織總RNA的方法。

本方法采用液氮加石英砂的方法研磨植物組織材料,能大大提高細(xì)胞的破碎效率。同時(shí),在研磨的時(shí)候加入DTT和PVPP, DTT作為強(qiáng)還原劑能夠保證多酚類物質(zhì)在研磨和貯存的過程中不被氧化；不可溶的吸附劑PVPP能在一定程度上吸附花色苷、黃酮和多酚類物質(zhì)。因此加入這兩種物質(zhì)能在一定程度上降低多酚類、花色苷等物質(zhì)對(duì)RNA提取的影響。CTAB作為一種陽離子表面活性劑,可以在高鹽的環(huán)境下結(jié)合多糖、多酚和蛋白質(zhì),常被用于各種多糖多酚植物RNA的提取。結(jié)合獼猴桃組織材料的特點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)室以CTAB法為基礎(chǔ),在以下方面進(jìn)行了改良:(1)在提取液中,提高了氯化鈉的濃度,以促進(jìn)CTAB對(duì)多糖、多酚類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的結(jié)合能力;(2)在提取液中加入了較高濃度的PVP和β-巰基乙醇。β-巰基乙醇作為抗氧化劑可以抑制多酚類物質(zhì)的氧化,從而提高RNA的產(chǎn)率和純度。此外,PVP還能有效地去除色素、脂類等物質(zhì);(3)在提取液中加入了硼酸鈉。硼酸一方面可以與酚類物質(zhì)結(jié)合從而抑制其氧化,另一方面還可以沉淀多糖類物質(zhì),從而提高RNA產(chǎn)率和純度[10]；(4)在RNA的沉淀過程中,采用了兩步沉淀法。首先用8 mol/L LiCl沉淀6 h以上,高濃度的LiCl可以選擇性沉淀RNA,從而可以在一定程度上減少DNA、糖類和其他雜質(zhì)的污染。其次,用2.5倍體積的無水乙醇加3 mol/L NaAc(pH 5.2)進(jìn)行第二次沉淀。低pH的NaAc可以使沉淀的效果更好,從而提高RNA的得率。利用該方法提取得到的RNA只要再用DNase I進(jìn)行DNA的去除便可以滿足絕大多數(shù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。通過與市場上專門用來提取多糖多酚類植物組織RNA的試劑盒法比較,該方法確實(shí)能在獼猴桃各種組織中提取到大量、高質(zhì)量的總RNA。相對(duì)于試劑盒法,雖然本方法耗時(shí)較長,但是獲得的RNA量更多,而且成本也更低。

4 結(jié)論

改良的CTAB法和試劑盒法均能用于獼猴桃各組織中總RNA的提取,在具體的實(shí)驗(yàn)中可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。改良的CTAB法對(duì)其他富含多糖多酚類植物組織中總RNA的提取具有較好的參考價(jià)值。