曾 燦,王可兵,曹石金

(深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院泌尿外科,廣東 深圳 518067)

前列腺癌發(fā)病隱匿,早期診斷困難,我國前列腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升態(tài)勢[1-4]。 雷公藤甲素(triptolide, TPL)是傳統(tǒng)中藥雷公藤的主要藥物成分,具有抗炎、抗腫瘤的功效, 但毒副作用限制其在臨床上使用,需要對其進(jìn)行減毒增效[5-10]。 外泌體(exosome)是具有納米大小的脂小囊,生物依從性好,是未來納米載藥系統(tǒng)中最具前景的載體[11-16]。本研究釆用體外培養(yǎng)的NK 細(xì)胞分泌的外泌體作為雷公藤甲素的載體,制備負(fù)載TPL 的納米粒exo-TPL,對exo-TPL 進(jìn)行表征分析,并研究其對p53、NF-κB 信號途徑的影響,以及對前列腺癌移植的小鼠模型的療效。 通過研究比較exo-TPL 納米粒對TPL 是否具有減毒增效的作用,是否對前列腺癌組織移植的小鼠模型的臨床療效優(yōu)于TPL。 本研究為TPL 的臨床應(yīng)用拓展新領(lǐng)域,也為前列腺癌等腫瘤的治療提供新的候選藥物。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

每組各10 只2 ～4 周齡,體重15 ～20 g 的SPF雌性SCID 裸鼠,實驗鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供并飼養(yǎng)[SCXK(粵)2016-0041] [SYXK(粵)2017-0119],動物實驗研究的倫理經(jīng)由深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院審批(20190801 - 02),做到了3R原則。

1.2 主要試劑

雷公藤甲素購自sigma 公司。 RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3 實驗方法

1.3.1 Nk-exo 的制備和標(biāo)志物鑒定

用小鼠骨細(xì)胞作為NK 的種子細(xì)胞,采用培養(yǎng)NK 細(xì)胞的方法大量培養(yǎng)NK 細(xì)胞,NK 經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定符合其典型特征,如高表達(dá)CD16,不表達(dá)CD3。 分離純化外泌體的方法采用超速離心的方法。 用BCA 方法檢測外泌體的總蛋白量,用DLS 檢測外泌體的粒徑大小、zeta 電位,用透射電鏡觀察純化的外泌體大小,用RT-PCR 分析NK 來源的外泌體中特異的MIRNAS,證明外泌體來自NK 細(xì)胞。

1.3.2 exo-TPL 納米粒的制備

利用純化和鑒定后的exosome,用PBS 重懸后,加入等量的TPL,采用電轉(zhuǎn)法制備exo-TPL 復(fù)合納米粒,電極條件為電壓400 V,電容125 μF,4 mm 電轉(zhuǎn)杯進(jìn)行電轉(zhuǎn)。 用倒置離心超濾膜過濾去除游離的和非特異性結(jié)合的雷公藤甲素。 應(yīng)用反相高效液相色譜法,集合超速冷凍離心法測定exo-TPL 納米粒的載藥量和包封率。 HPLC 法測定exo-TPL 納米粒的體外釋藥性能。

1.3.3 MTT 法

將細(xì)胞接種于96 孔板,每孔100 μL,細(xì)胞數(shù)約1×104,常規(guī)培養(yǎng)24 h。 除對照組加入生理鹽水外,其他3 組分別給予exo-TPL 納米粒、TPL 和空白納米粒繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h。 棄上清,PBS 清洗細(xì)胞后加入MTT 20 μL 和無血清培養(yǎng)基80 μL,37℃孵育4 h。 離心棄上清,每孔加入DMSO 150 μL,放在搖床上低速振蕩10 min,用酶標(biāo)儀檢測570 nm 處的吸光度值。 根據(jù)公式統(tǒng)計細(xì)胞存活率。 公式如下:活細(xì)胞率(%)= (實驗組吸光度值/ 對照組吸光度值)×100%。

1.3.4 qPCR

按照RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞的RNA,用紫外/ 可見分光光度計測定細(xì)胞的RNA 的濃度。 按照TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScripttm RT reagent Kit with gDNA Eraser 說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板按照TaKaRa SYBR Premix Ex Taq Ⅱ說明書進(jìn)行PCR。 瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。 數(shù)據(jù)分析所用方法為2-ΔΔCt法,其中Ct 值為基因進(jìn)入指數(shù)增長期的循環(huán)數(shù),而ΔCt 為處理組目的基因的Ct 值與對照組目的基因的Ct 值之差。 引物序列為:GAPDH(上游引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’; 下 游 引 物 5 ’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’); p53 ( 上 游 引 物5’-CAGCCAAGTCTGTGCTTGCAC-3’;下游引物5’-CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC-3 ’); NF-kB(上游引物5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’;下游引物5’-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3’)。

1.3.5 前列腺癌移植小鼠模型的構(gòu)建

收集培養(yǎng)的RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù)后配成濃度為1×107/ mL 的細(xì)胞懸液,接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下。 每只小鼠200 μL,對照組小鼠接種等體積生理鹽水。 模型小鼠尾靜脈注射TPL 或exo-TPL 納米粒,空白納米粒為對照組,觀察腫瘤體積大小和小鼠存活時間。

1.3.6 一般情況

觀察各組小鼠在服藥過程中的毛發(fā)色澤、飲食、飲水和活動狀態(tài)等。

1.3.7 藥動學(xué)、生物分布和藥效學(xué)研究

在小鼠體內(nèi)注射exo-TPL 納米粒、TPL,在不同時間點取血樣,用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析血液中藥物的含量,評價載藥納米粒的抗降解能力。 取小鼠各器官液氮凍存,在冷凍條件下碾磨組織,用LC-MS檢測各器官組織的藥物含量,來研究載藥納米粒在體內(nèi)的組織分布。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 exo-TPL 納米粒的制備

用小鼠骨細(xì)胞作為NK 的種子細(xì)胞,采用培養(yǎng)NK 細(xì)胞的方法大量培養(yǎng)NK 細(xì)胞,NK 經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定符合其典型特征。 電鏡結(jié)果表明外泌體呈圓形,大小較為均一,粒徑大小約100 nm。 qPCR 實驗發(fā)現(xiàn)NK 來源的外泌體中特異的MIRNAS 高表達(dá),證明外泌體來自NK 細(xì)胞。 利用純化和鑒定后的exosome,用PBS 重懸后,加入等量的TPL,采用電轉(zhuǎn)法制備得到exo-TPL 復(fù)合納米粒。 應(yīng)用反相高效液相色譜法,集合超速冷凍離心法測定exo-TPL納米粒的載藥量和包封率。 其載藥量可達(dá)2.01%,包封率為60.42%。 exo-TPL 納米粒的釋放率在4 h之后達(dá)到平衡,最大釋藥率約為65.00%。

2.2 細(xì)胞增殖抑制率的比較

用10 ng / mL、40 ng / mL 和80 ng / mL 的雷公藤甲素分別孵育RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞24 h 和48 h,MTT 結(jié)果表明,TPL 組能明顯抑制RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞的增殖,且抑制作用隨著藥物濃度和作用時間的增加呈劑量和時間依賴性的增加。 exo-TPL 納米粒組對RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞的增殖抑制率明顯高于TPL 組。 見表1。

2.3 NF-κB 和p53 表達(dá)水平比較

qPCR 結(jié)果顯示,80 ng / mL 雷公藤甲素孵育RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞48 h,與對照組相比,TPL組和exo-TPL 納米粒組,RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞的NF-κB mRNA 表達(dá)水平均顯著降低。 與TPL 組相比,exo-TPL 納米粒組NF-κB mRNA 表達(dá)水平顯著降低。 與對照組相比,TPL 組和exo-TPL 納米粒組,RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞的p53 mRNA 表達(dá)水平均顯著升高。 與TPL 組相比, exo-TPL 納米粒組p53 mRNA 表達(dá)水平顯著升高。 見表2。

免疫印記結(jié)果顯示,80 ng / mL 雷公藤甲素孵育RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞48 h,與對照組相比,TPL組和exo-TPL 納米粒組,RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞的NF-κB mRNA 表達(dá)水平均顯著降低。 與TPL 組相比,exo-TPL 納米粒組NF-κB mRNA 表達(dá)水平顯著降低。 與對照組相比,TPL 組和exo-TPL 納米粒組,RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞的p53 mRNA 表達(dá)水平均顯著升高。 與TPL 組相比,exo-TPL 納米粒組p53 mRNA 表達(dá)水平顯著升高。 見圖1。

2.4 荷瘤小鼠一般形態(tài)學(xué)改變

將1×107/ mL 濃度的RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞200 μL 接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下,制備前列腺癌小鼠模型。 從接種第8 天開始,分別尾靜脈注射TPL或exo-TPL 納米粒,給藥劑量為0.7 mg / kg, 對照組尾靜脈注射等量空白納米粒,每周第1 ～2 天給藥,共給藥2 周。 對照組小鼠精神不佳、活動減少。 與對照組相比,TPL 組和exo-TPL 納米粒組小鼠精神食欲佳。

2.5 不同組荷瘤小鼠腫瘤大小對比

給藥2 周后,剝離腫瘤后測量其體積和質(zhì)量。與對照組相比,TPL 組和exo-TPL 納米粒組腫瘤體積和質(zhì)量均明顯減小。 exo-TPL 納米粒組腫瘤體積和質(zhì)量明顯小于TPL 組。 見表3。

2.6 不同組荷瘤小鼠生存時間對比

對照組小鼠的平均荷瘤生存期為(16.6±2.1)d,與對照組相比,TPL 組和exo-TPL 納米粒組小鼠的平均荷瘤生存期延長,分別為(23.8±2.3) d 和(27.4±2.2) d。 exo-TPL 納米粒組平均荷瘤生存期長于TPL 組。 見表4。

2.7 血液中藥物濃度

在小鼠體內(nèi)注射exo-TPL 納米粒、TPL,給藥后第7 天、14 天取血樣,用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS) 分析血液中雷公藤甲素的含量,評價載藥納米粒的抗降解能力。 見表5。

表1 細(xì)胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of cell proliferation inhibition rate

2.8 雷公藤甲素組織分布情況

給藥2 周后,取小鼠各器官液氮凍存,在冷凍條件下碾磨組織,用LC-MS 檢測各器官組織的雷公藤甲素含量,來研究載藥納米粒在體內(nèi)的組織分布。小鼠各組織雷公藤甲素含量測定結(jié)果見表6。

3 討論

前列腺癌發(fā)病隱匿,早期診斷困難,約有75%的患者確診時已是進(jìn)展期或晚期,并且最終都將喪失對雄激素的依賴性,轉(zhuǎn)變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔?我國前列腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升態(tài)勢。世界各國每年投入巨額經(jīng)費進(jìn)行前列腺癌基礎(chǔ)研究和臨床治療,但至今尚未獲突破性進(jìn)展[1-2]。 近年來前列腺癌的免疫治療取得較大進(jìn)展,如前列腺癌的樹突狀細(xì)胞疫苗已上市、PROSTVAC 進(jìn)入臨床III 期試驗[17]。 前期研究中,我們構(gòu)建表達(dá)前列腺特異性膜抗原的腺病毒感染體外培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞疫苗和靶向體內(nèi)樹突狀細(xì)胞亞群的負(fù)載前列腺特異性膜抗原的納米疫苗進(jìn)行體內(nèi)外實驗,結(jié)果均表明這些疫苗對前列腺癌細(xì)胞有一定的特異殺傷作用[18],但現(xiàn)有免疫治療的效果仍不理想,因此探索新的藥物和治療方法非常迫切。

表2 NF-κB 和p53 表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of NF-κB and p53 expression levels

圖1 NF-κB 和p53 蛋白表達(dá)水平比較Figure 1 Comparison of NF-κB and p53 protein expression levels

表3 小鼠腫瘤體積和質(zhì)量Table 3 Mouse tumor volume and mass

表4 小鼠生存時間Table 4 Survival time of mice

表5 血液中藥物濃度Table 5 drug concentration in blood

表6 雷公藤甲素組織分布情況Table 6 Tissue distribution of triptolide

雷公藤甲素(triptolide, TPL) 是傳統(tǒng)中藥雷公藤的主要藥物成分,具有抗炎、抗腫瘤的功效,但毒副作用限制其在臨床上使用,需要對其進(jìn)行減毒增效[5-10]。 外泌體(exosome) 是具有納米大小的脂小囊,生物依從性好,是未來納米載藥系統(tǒng)中最具前景的載體[11-16]。 本研究采用體外培養(yǎng)的自然殺傷細(xì)胞(NK)分泌的外泌體作為TPL 的載體,制備新型TPL 納米粒(命名為exo-TPL),對exo-TPL 進(jìn)行表征,并研究其對p53、NF-κB 信號途徑的影響,以及對前列腺癌組織異物移植的小鼠模型的療效。本研究為TPL 的臨床應(yīng)用拓展新領(lǐng)域,也為前列腺癌等腫瘤的治療提供新的候選藥物。

本研究結(jié)果顯示,exo-TPL 納米粒組對RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用隨濃度的增加和作用時間的延長而增強(qiáng)。 exo-TPL 納米粒組的TPL可持續(xù)釋放,持續(xù)作用于RM-1 小鼠前列腺癌細(xì)胞,與TPL 組相比,可以產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。 NF-κB 具有轉(zhuǎn)錄激活功能,廣泛參與機(jī)體的應(yīng)激和炎癥反應(yīng)并參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[19]。實驗發(fā)現(xiàn),與TPL 組相比,exo-TPL 納米粒組NF-κB mRNA 表達(dá)水平顯著降低。 p53 作為一種重要的抑癌基因,與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20]。 與TPL 組相比,exo-TPL 納米粒組p53 mRNA 表達(dá)水平顯著升高。 給藥2 周后,剝離腫瘤后測量其體積和質(zhì)量,exo-TPL 納米粒組腫瘤體積和質(zhì)量明顯小于TPL組,提示與TPL 組比較,exo-TPL 納米粒組可以更好的抑制前列腺癌皮下瘤的增長,并且可以明顯延長荷瘤小鼠的生存時間。 組織分布結(jié)果表明,TPL 在肝、肺、脾、腎、心、腦主要組織器官中均有分布,并呈現(xiàn)不同程度的差異分布。 與TPL 組相比,exo-TPL 納米粒組可在血液和組織中保持更高的濃度,可以更好的發(fā)揮藥效。

綜上所述,本研究在前列腺癌小鼠皮下瘤模型中證明,與TPL 組相比,exo-TPL 納米粒組可以產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制腫瘤的作用。 本研究為TPL 的臨床應(yīng)用拓展新領(lǐng)域,也為前列腺癌等腫瘤的治療提供新的候選藥物。