周 玲,范潤(rùn)哥,李東明,劉 恒,舒 偉,3?

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,南寧 530021; 2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科,南寧 530021;3.桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院,廣西 桂林 541100)

核纖層( nuclear lamina ) 是由核纖層蛋白(lamins)組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),位于細(xì)胞核膜內(nèi)側(cè),核纖層蛋白是進(jìn)化上高度保守的Ⅴ型中間纖維蛋白(intermediate filament protein, IF protein),在維持細(xì)胞核的正常結(jié)構(gòu)與功能、染色質(zhì)定位和基因轉(zhuǎn)錄、以及細(xì)胞衰老與分化等細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[1]。 在哺乳動(dòng)物中,lamins 分為A 型和B 型,A型lamins 包括lamin A、lamin C 以及含量較低的亞型A△10、lamin C2,由LMNA基因選擇性剪切產(chǎn)生。B 型lamins 包 括lamin B1、 lamin B2, 由LMNB1、LMNB2 基因編碼產(chǎn)生。 A 型lamins 一般只在原胚胎形成后分化的細(xì)胞中表達(dá),而B(niǎo) 型lamins 表達(dá)貫穿整個(gè)發(fā)育過(guò)程[2-3]。

由于細(xì)胞內(nèi)許多不同蛋白質(zhì)直接或間接與lamins 相互作用,LMNA、LMNB1 和LMNB2 基因發(fā)生突變常常造成多種效應(yīng)。LMNA基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)963 個(gè)(www.ncbi.nlm.nih.gov / clinvar/)突變,這些突變與至少15 種被稱(chēng)為 “ 核纖層蛋白病” 的疾病相關(guān),包括常染色體遺傳病埃- 德型肌營(yíng)養(yǎng)不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy, EDMD)、 擴(kuò)張型心肌病( Dilated cardiomyopathy, DCM)、 早老癥(Hutchinson-Gilford progeria syndrome, HGPS)、肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥( Limb-girdle muscular dystrophy,LGMD)等。 以HGPS 為例,由于LMNA基因發(fā)生點(diǎn)突變引起外顯子11 隱蔽剪切位點(diǎn)(G608G:GGC→GGT)激活,導(dǎo)致核纖層蛋白A 前體(prelamin A)肽鏈羧基末端50 個(gè)氨基酸殘基被切除,這個(gè)被截短的prelamin A 被稱(chēng)為早老蛋白(progerin)。 progerin 保留了CXXA 結(jié)構(gòu)域,而缺失ZMPSTE 24 酶切位點(diǎn),導(dǎo)致羧基末端不能被剪切,暴露在外的法尼基半胱氨酸甲酯一直存在。 隨著時(shí)間的推移,progerin 蓄積會(huì)導(dǎo)致一系列細(xì)胞缺陷和功能障礙,最終造成細(xì)胞和組織器官的衰老[4]。 為了研究由于LMNA基因突變?cè)斐傻募膊〔⑻綄て渲械木唧w機(jī)制,人們構(gòu)建了多種核纖層蛋白病小鼠模型,本文將對(duì)核纖層蛋白病小鼠模型進(jìn)行綜述。

1 LMNA 基因缺失突變小鼠模型

1.1 Lmna-/ -和LmnaGT-/ -小鼠模型

第一個(gè)LMNA基因突變小鼠模型是lamin A/ C缺失(Lmna-/-小鼠模型)。Lmna-/-小鼠白色脂肪儲(chǔ)存減少、生長(zhǎng)遲緩、心律失常和核膜蛋白emerin 分布異常,出生后6 ～8 周齡死亡,Lmna+/-小鼠在4 ～6周齡時(shí)顯示出中度嚴(yán)重性的心臟功能障礙和心肌細(xì)胞損傷。 有趣的是,研究表明Lmna+/-小鼠在12個(gè)月齡時(shí)表現(xiàn)出嚴(yán)重的心臟異常,與LMNA基因突變引起的DCM 表型相似[5-6]。 Kubben 等[7]通過(guò)基因捕獲技術(shù)構(gòu)建了一種新的lamin A/ C 缺失小鼠模型(LmnaGT-/-小鼠模型)。LmnaGT-/-小鼠在出生后2～3 周齡死亡。 在Lmna-/-小鼠等模型以及EDMD患者肌肉活檢中發(fā)現(xiàn),核膜和DNA 損傷是由骨骼肌成熟過(guò)程中的核遷移引起的,并與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。 這些發(fā)現(xiàn)暗示機(jī)械誘導(dǎo)的DNA 損傷是LMNA基因突變引起骨骼肌疾病的致病因素之一[8]。 研 究 發(fā) 現(xiàn) mTORC1 ( mammalian target of rapamycin complex 1, mTORC1)在Lmna-/-小鼠的心肌和骨骼肌組織中上調(diào),用mTOR 抑制劑治療突變小鼠,能夠逆轉(zhuǎn)mTORC1 信號(hào)升高,從而引起自噬激活促進(jìn)progerin 溶解和清除,減輕細(xì)胞衰老,挽救心臟和骨骼肌功能,并延長(zhǎng)壽命[9]。

1.2 LAO、PLAO 和LCO 小鼠模型

為了證明prelamin A 加工過(guò)程的重要性,Coffiner 等[10]構(gòu)建僅合成lamin A 的轉(zhuǎn)基因小鼠模型(LAO 小鼠模型) 和僅合成prelamin A 的轉(zhuǎn)基因小鼠模型(PLAO 小鼠模型)。 在LmnaLAO/LAO小鼠中l(wèi)amin A 是直接合成的,而在LmnaPLAO/PLAO小鼠中l(wèi)amin A 是 通 過(guò) prelamin A 加 工 合 成。 盡 管LmnaLAO/LAO小鼠沒(méi)有了prelamin A 的加工步驟,但兩個(gè)突變小鼠模型中成熟lamin A 的水平是相當(dāng)?shù)?。LmnaLAO/LAO小鼠正常、健康,沒(méi)有任何明顯的病理表型,存活時(shí)間(>24 個(gè)月)與野生型(Wild Type,WT)小鼠相當(dāng),然而LmnaLAO/LAO和LmnaPLAO/PLAO小鼠成纖維細(xì)胞比Lmna+/+小鼠成纖維細(xì)胞有更高的核畸形率,這表明細(xì)胞異常與組織病理的嚴(yán)重程度并不一致。 有趣的是,只合成lamin C(LCO 小鼠模型)不合成lamin A 的小鼠也表現(xiàn)為完全健康[11]。這些研究結(jié)果表明小鼠中prelamin A 加工是可有可無(wú)的,lamin A 和lamin C 功能存在互補(bǔ),缺乏其中之一并不會(huì)引起病理表型,但是同時(shí)缺乏lamin A 和lamin C 卻是致命的。

2 LMNA 基因錯(cuò)義突變小鼠模型

2.1 Lmna N195 K 和Lmna H222P 小鼠模型

兩個(gè)攜帶LMNA基因錯(cuò)義突變的小鼠模型再現(xiàn)了人類(lèi)疾病的表型:一個(gè)是LMNA基因第195 位的天冬酰胺突變?yōu)橘?lài)氨酸(N195 K 小鼠模型),導(dǎo)致家族性擴(kuò)張型心肌病伴傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病( familial dilated cardiomyopathy with conduction systems disease, DCM-CD1)[12]。 另一個(gè)是LMNA基因第222 位的組氨酸突變?yōu)楦彼?H222P 小鼠模型),導(dǎo)致常染色體顯性遺傳EDMD (autosomal dominant inheritance, AD-EDMD)[13]。 有趣的是,雖然雜合子小鼠沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異常,但LmnaN195K/N195K小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重心律失常而過(guò)早死亡[12]。 與WT 小鼠相比,LmnaN195K/N195K小鼠的心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間 更 長(zhǎng), 晚 期 鈉 電 流( Na+) 增 加[14]。 同 樣LmnaH222P/H222P小鼠表現(xiàn)出骨骼肌和心肌的營(yíng)養(yǎng)不良,純合子小鼠在13 月齡全部死亡[13]。 研究發(fā)現(xiàn)LmnaH222P/H222P小鼠心肌中MAPK、JNK、p38α、ERK1 /2、AKT/ mTORC1、TGF-β 信號(hào)上調(diào),WNT/ β-catenin信號(hào)下調(diào),連接蛋白43(connexin 43, CX43)低表達(dá)并且分布改變,微管細(xì)胞骨架不穩(wěn)定導(dǎo)致CX43 重塑, 其 中ERK1 / 2、 AKT/ mTORC1、 TGF-β、 WNT/ βcatenin 信號(hào)已經(jīng)證實(shí)與DCM 的發(fā)病機(jī)制有關(guān),藥物阻斷這些信號(hào)通路以及改變CX43 定位可以改善LmnaH222P/H222P小鼠的左心室功能[15-16]。 研究者正在進(jìn)一步探索通過(guò)聯(lián)合用藥阻斷以上信號(hào)通路對(duì)LMNA基因突變引起的DCM 的治療效果。

2.2 LmnaM371 K 小鼠模型

人類(lèi)患EDMD 主要表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳病,為了確定LMNA基因突變是否能以顯性方式引起小鼠EDMD 樣表型。 Wang 等[17]構(gòu)建了M371 K轉(zhuǎn)基因小鼠模型( 第371 位甲硫氨酸突變?yōu)橘?lài)氨酸,導(dǎo)致AD-EDMD)。 雜合子小鼠的出生率明顯低于預(yù)期,可能是由于突變蛋白影響小鼠早期胚胎發(fā)育。 小鼠出生后存活2 ～7 周,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞胞質(zhì)嗜酸性粒細(xì)胞增多、肌原纖維碎裂、核破裂、核固縮和細(xì)胞水腫,病灶多發(fā),無(wú)纖維化或明顯炎癥,提示急性或亞急性心臟損傷。 然而,人類(lèi)患EDMD 更具有漸進(jìn)性和擴(kuò)張性,心臟受累是最嚴(yán)重的并發(fā)癥,表現(xiàn)為房室傳導(dǎo)異常,左心室擴(kuò)張和室性心律失常,左室為主的心肌細(xì)胞破壞隨著疾病的進(jìn)展而加重。 因此,該小鼠模型并沒(méi)有完全模擬人類(lèi)患EDMD 的表型,這種差異產(chǎn)生的原因可能是由于M371 K 突變蛋白在該小鼠模型高表達(dá)。

2.3 LmnaL530P 小鼠模型

研究者在一例常染色體顯性EDMD 患者中發(fā)現(xiàn)一個(gè)LMNA基因L530P 變異(第530 位亮氨酸突變?yōu)楦彼?,Monkes 等[18]構(gòu)建了L530P 小鼠模型。 6 個(gè)月齡的雜合子小鼠與WT 小鼠表型相似。純合子小鼠在4-6 日齡時(shí)開(kāi)始呈現(xiàn)早老表型,并在4～5 周內(nèi)死亡,純合子小鼠步態(tài)蹣跚、皮下脂肪層缺乏、毛囊密度降低、心肌和骨骼肌輕度至中度變性、發(fā)育不良和萎縮。 此外,研究者還發(fā)現(xiàn)小鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)異常,lamin A 表達(dá)減少,lamin C 細(xì)胞核內(nèi)定位錯(cuò)誤。

2.4 LmnaE82 K 小鼠模型

在一個(gè)擁有50 個(gè)家族成員的中國(guó)人DCM 家系中發(fā)現(xiàn)LMNA基因的一個(gè)新突變E82 K,正是這種突變導(dǎo)致了DCM 的發(fā)生。 呂丹等[19]構(gòu)建了E82 K轉(zhuǎn)基因小鼠模型。 該轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為心腔擴(kuò)張、心臟重量增加、心肌纖維化增加,B 型鈉尿肽、血清Ⅲ型前膠原和骨骼肌肌動(dòng)蛋白α1 水平升高、核膜斷裂和傳導(dǎo)受損,這與攜帶E82 K 突變患者的表型相似。 有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)E82 K 轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞凋亡水平是WT 小鼠的8.5 倍,Fas 和線粒體凋亡通路均被激活,這可能與左心室功能下降和最終心力衰竭有關(guān)。LMNA基因的E82 K 突變或Lamin A/C 桿狀區(qū)突變都可能是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和心室功能障礙的重要原因。 這可能是抑制LMNA突變患者心肌細(xì)胞死亡的一種潛在的治療靶點(diǎn)。

3 LMNA 基因早老突變小鼠模型

3.1 LmnaHG小鼠模型

HGPS 是最嚴(yán)重的核纖層蛋白病之一。 為了研究該病的致病機(jī)制,Yang 等[20]構(gòu)建了LmnaHG小鼠模型,該小鼠只產(chǎn)生progerin。 純合子和雜合子小鼠都表現(xiàn)出與HGPS 患者相似的表現(xiàn),包括皮下脂肪減少、脫發(fā)、骨質(zhì)疏松癥和過(guò)早死亡。 然而,該小鼠模型沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類(lèi)似人類(lèi)患者的心血管問(wèn)題[20-22]。

3.2 攜帶LMNAG608G-BAC 致病基因的小鼠模型

第二個(gè)關(guān)于HGPS 的小鼠模型是通過(guò)產(chǎn)生帶有細(xì)菌人工染色體(BAC) 的轉(zhuǎn)基因來(lái)構(gòu)建早老小鼠模型,BAC 攜帶LMNAG608G 突變( G608G BAC 小鼠模型)。 與LmnaHG小鼠模型不同,該轉(zhuǎn)基因小鼠沒(méi)有HGPS 外部表型,但血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs) 漸進(jìn)性丟失,在一些HGPS 患者的尸檢中也觀察到這一特征。 目前還不清楚為什么這個(gè)模型的表型局限于VSMCs[22]。

3.3 金屬蛋白酶ZMPSTE24 缺失型小鼠模型

ZMPSTE24 是一種在小鼠和人體內(nèi)處理法尼基化prelamin A 的金屬蛋白酶。 人體缺乏ZMPSTE24會(huì)導(dǎo)致限制性皮膚病(Restrictive dermopathy, RD)的發(fā)生,從而造成圍產(chǎn)期死亡[23]。 Bergo 和Pendas等[24-25] 建立了2 種ZMPSTE24 缺失小鼠模型(Zmpste24-/-小鼠模型),這2 種小鼠模型都沒(méi)有產(chǎn)生成熟的lamin A,反而因?yàn)槿笔mpste24 而導(dǎo)致法尼基化prelamin A 蓄積。 在Bergo 等[24]構(gòu)建的小鼠模型中,純合子小鼠出生時(shí)表現(xiàn)是正常的,后來(lái)出現(xiàn)異常,包括生長(zhǎng)遲緩、脫發(fā)、肌無(wú)力、最顯著的是多發(fā)性骨折。 在Pendás 等[25]構(gòu)建的小鼠模型中,純合子小鼠表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩、DCM、肌營(yíng)養(yǎng)不良、脂肪營(yíng)養(yǎng)不良和過(guò)早死亡。 這2 個(gè)小鼠模型的表型都與HGPS 患者的表型相似,提示prelamin A法尼基化至少部分的影響了HGPS 的表型。 研究表明,法尼基化抑制劑( farnesyltransferase ( FTase)inhibitors, FTIs) 可以抑制progerin 蓄積或prelamin A 法尼基化,聯(lián)合他汀類(lèi)藥物使用可以增加HGPS患者骨密度從而改善早老表型[26-27]。

3.4 LmnaG609G小鼠模型

早老小鼠模型中較為受到關(guān)注的是Osorio 等[28]構(gòu)建的LmnaG609G小鼠模型,LmnaG609G/G609G小鼠在出生至出生后3 周生長(zhǎng)速度減慢,體重進(jìn)行性下降,不孕,姿勢(shì)異常,脊柱后凸,平均100 日齡時(shí)過(guò)早死亡。 雜合子小鼠雖也出現(xiàn)過(guò)早死亡,但死亡率較低,大多數(shù)在出生后8 個(gè)月前都是正常表型,平均生存時(shí)間為242 d。 雜合子小鼠出現(xiàn)血管硬化,與載脂蛋白E 敲除(Apoe-/-)小鼠雜交出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化,主動(dòng)脈鈣化嚴(yán)重以及抑制血管鈣化的能力受損[29]。 由于LmnaG609G小鼠模型出現(xiàn)了HGPS 患者中觀察到的大多數(shù)變化,該小鼠模型已經(jīng)成為尋找HGPS 患者治療措施的首選模型。 研究者利用了反義寡核苷酸、藥物、飲食以及激活體內(nèi)的重新編程等來(lái)治療LmnaG609G小鼠[30-31],最近,研究者利用CRISPR-Cas9 技術(shù)靶向干擾lamin A/ Progerin 來(lái)治療HGPS, 治療后的LmnaG609G小鼠抑制了表皮變薄和真皮脂肪丟失、改善了姿勢(shì)、體重以及主動(dòng)脈弓VSMCs 的退化。 小鼠看起來(lái)更活躍、健康、以及生存期延長(zhǎng)[32]。

3.5 其他早老突變小鼠模型

Yang 等[33]考慮到非法尼基化progerin 有誘發(fā)疾病的可能性,因此構(gòu)建了表達(dá)非法尼基化progerin小鼠模型(LmnanHG小鼠模型)。LmnanHG小鼠與LmnaHG小鼠表型相似但癥狀輕一些。LmnanHG小鼠胚胎成纖維細(xì)胞( mouse embryonic fibroblasts,MEFs)畸形細(xì)胞核百分率比LmnaHG小鼠低。 FTIs對(duì)LmnanHG小鼠MEFs 沒(méi)有療效。 這些結(jié)果表明,非法尼基化progerin 仍然是有毒性的,用FTIs 阻斷法尼基化并不能完全逆轉(zhuǎn)HGPS 患者的progerin 誘導(dǎo)的表型。 為了避免progerin 在早期發(fā)育過(guò)程中潛在毒性,以及progerin 對(duì)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的影響,Mckenna 等[34]構(gòu)建了一個(gè)在Tet 操縱子控制下表達(dá)lamin A 和progerin 的誘導(dǎo)系統(tǒng)。 分別表達(dá)野生型lamin A(tetop-LAwt 小鼠模型)和HGPS G608G 突變體(tetop-LAG608G小鼠模型)。 通過(guò)將tetop-LAwt 和tetop-LAG608G轉(zhuǎn)基因小鼠與表達(dá)K5tTA 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,突變基因的表達(dá)定向到毛囊間表皮和毛囊的基底細(xì)胞。 這些表達(dá)progerin 的雙轉(zhuǎn)基因小鼠中,最終表現(xiàn)出皮下脂肪丟失、纖維化和皮脂腺發(fā)育不完全。 其他值得注意的異常包括牙齒問(wèn)題、脫發(fā)、生長(zhǎng)遲緩和過(guò)早死亡。 由于HGPS 患者的皮膚受到嚴(yán)重影響,Wang 等[35]構(gòu)建了利用角蛋白14 啟動(dòng)子(Keratin 14 promoter,K14 promoter)在表皮組織中表達(dá)progerin 的轉(zhuǎn)基因小鼠模型(K14-progerin 小鼠模型),K14-progerin 小鼠分離的原代角質(zhì)形成細(xì)胞雖然具有異常的核形態(tài),但仍有正常的毛發(fā)和傷口愈合能力。 這些觀察結(jié)果表明細(xì)胞異常與組織病理的嚴(yán)重程度并不一致。 正如Varga 等[22]提出的一樣,某些組織如橫紋肌,細(xì)胞不斷受到機(jī)械壓力,可能對(duì)核結(jié)構(gòu)異常更敏感,而其他組織如表皮,盡管核形狀發(fā)生了改變,也能夠繼續(xù)發(fā)揮生理功能。 最近研究發(fā)現(xiàn),LMNA基因R527C 純合突變會(huì)導(dǎo)致兒童早老癥,但LMNAR527C 基因突變導(dǎo)致的早老癥患者細(xì)胞內(nèi)并沒(méi)有 prelamin A 和 progerin 蓄 積[36]。 目 前,LMNAR527C 基因突變導(dǎo)致的早老癥致病機(jī)制尚不清楚。 李東明等[37]構(gòu)建了一個(gè)R527C 小鼠模型,觀察LmnaR527C/R527C小鼠的表型,發(fā)現(xiàn)LmnaR527C/R527C小鼠未出現(xiàn)相關(guān)臨床疾病的表型,但是小鼠皮膚組織γH2Ax蛋白水平升高,成纖維細(xì)胞衰老數(shù)量百分比增加,DNA 損傷增加,基因組不穩(wěn)定,衰老加速。 這些結(jié)果表明細(xì)胞異常與組織病理的嚴(yán)重程度并不一致。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

核纖層蛋白病類(lèi)型復(fù)雜多樣,引起人們的廣泛關(guān)注,為了深入研究其分子機(jī)制,開(kāi)發(fā)針對(duì)相應(yīng)疾病的孤兒藥,人們構(gòu)建了多種種屬的動(dòng)物模型,比如斑馬魚(yú)[38]、尤加坦小型豬[39]、兔[40]等,而小鼠模型的構(gòu)建尤為眾多,本文概述了文獻(xiàn)報(bào)道的主要核纖層蛋白病小鼠模型(見(jiàn)表1、表2、表3)。 考慮到物種間高度保守的基因組維持機(jī)制,核纖層蛋白病小鼠模型可以作為一個(gè)有價(jià)值的模型來(lái)研究個(gè)體和細(xì)胞衰老過(guò)程中代謝途徑的改變和可能的治療策略,以進(jìn)一步提升我們對(duì)正常生理性衰老過(guò)程的認(rèn)識(shí),也有助于了解與衰老相關(guān)的慢性和退行性疾病(阿爾茨海默病、帕金森病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和癌癥等)的病理特征。

表1 LMNA 基因/ 片段缺失突變小鼠模型Table 1 Mouse models with LMNA gene or fragment deletion mutation

表2 LMNA 基因錯(cuò)義突變小鼠模型Table 2 Mouse models with LMNA gene missense mutation

表3 LMNA 基因早老突變小鼠模型Table 3 Mouse models with LMNA gene progeroid mutation