許藝蘭，鐘丹丹，杜雪松，謝炎東，劉晶潔，孫 悅，賓石玉*

(1.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室(廣西師范大學)，廣西 桂林 541006；2.廣西水產(chǎn)科學研究院，廣西 南寧 530021)

羅非魚是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要品種和出口優(yōu)勢品種[1]，其耐寒能力較差，低溫影響羅非魚消化酶活性、生理生化指標及肝、脾、鰓細胞形態(tài)[2-4]。在我國羅非魚的主要養(yǎng)殖區(qū)，每年冬春季節(jié)低溫造成羅非魚大量死亡，經(jīng)濟損失慘重[5]。低溫成為制約羅非魚產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要因素之一，因此，羅非魚耐寒品種選育至關重要。利用分子標記技術篩選羅非魚耐寒相關候選基因及其與耐寒性狀相關的分子標記,在輔助羅非魚耐寒品種的選育方面具有重要的意義[6-7]。

TCP-1-eta基因屬于熱激蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)家族成員，存在于細胞質和線粒體中，由60 ku單體組成的低聚物而形成，主要功能是參與機體熱應激反應，幫助多肽正確折疊和線粒體蛋白質的運輸，參與DNA的代謝等[8]。研究發(fā)現(xiàn)：TCP-1基因與生物體的耐寒能力有關，并證實可能對生物體的耐寒能力有一定影響[9-10]；南極抗凍魚的TCP-1基因在其低溫耐受性方面發(fā)揮作用[11]；低溫誘導下鯉魚TCP-1-eta基因的表達量增多[12]。因此，本文研究以羅非魚TCP-1基因作為耐寒性狀的候選基因，擬開展PCR-SSCP多態(tài)性分析及其與耐寒性能的相關性分析，為輔助羅非魚耐寒品種的選育提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

1.1.1 實驗材料

試驗魚為體質量5.5 g左右的吉富品系羅非魚，從國家級廣西南寧羅非魚良種場采購。

1.1.2 主要儀器

上海海圣制冷水循環(huán)系統(tǒng)(50 cm×50 cm ×50 cm)、廈門和譜儀器有限公司Centrifuge 5418離心機、格蘭仕WP800TL23-K3微波爐、北京六一儀器廠DYY-6C型電泳儀、24-17-PR凝膠成像系統(tǒng)、海爾BCD-250TF冰箱、三印(SANYWUN)探針筆式防水水溫電子溫度計等。

1.1.3 主要試劑

組織基因組DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、pBR322/Msp I Maker均由天根生化科技有限公司提供，瓊脂糖、丙烯酰胺、顯色劑、EDTA-Na2、Tris Base等購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗羅非魚的篩選

選取2 000尾體質量(5.5±0.5) g吉富羅非魚，分別隨機放入50 cm×50 cm ×50 cm編號為A、B、C、D的自動制冷水循環(huán)水族箱中，每箱500尾為1組，進行低溫脅迫實驗：從水溫25 ℃開始，4個水族箱以0.33 ℃/h分別降溫到8、10、12和14 ℃，停止降溫并維持該溫度，仔細觀察并記錄實驗魚的行為表現(xiàn)、昏迷和死亡情況。根據(jù)魚的死亡時間篩選實驗羅非魚：不耐低溫組為死亡最快的16尾；耐低溫組為死亡最慢的16尾。分別取每箱不耐低溫組和耐低溫組16尾實驗魚背鰭和尾鰭之間的肌肉，肌肉樣品用無水乙醇處理后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA的提取

采用組織基因組DNA提取試劑盒，按照使用說明書的方法和步驟，從羅非魚肌肉提取基因組DNA。

1.2.3 引物設計與合成

根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫(登錄號JQ797421)提供的TCP-1基因序列設計4對引物(表1)，交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 羅非魚TCP-1-eta基因PCR-SSCP分析所用引物Tab.1 Primers for PCR-SSCP analysis of TCP-1-eta gene of tilapia

1.2.4 PCR-SSCP擴增的反應體系及反應程序

PCR反應總體積50 μL，其中上下游引物(10 μmoL/L)各0.9 μL，樣品DNA 3.0 μL，2×Taq MasterMix(含染料) 30.0 μL，dH2O 13.5 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。反應后保存于4 ℃無菌水中。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的SSCP分析

PCR擴增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，具體檢測步驟參照文獻[3]的方法：首先量取3～4 μL PCR產(chǎn)物進行點樣，接著300 V高壓電泳10 min，然后170 V恒定電壓電泳16 h檢測，最后染膠并拍照保存。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

TCP-1-eta基因的等位基因數(shù)、等位基因頻率、基因型頻率及Hardy-Weinberg平衡檢驗計算均使用Popgene 1.32軟件。基因型與耐寒性狀的關聯(lián)性分析使用SPSS 15.0軟件，P>0.05表示差異性不顯著，P<0.05表示顯著性差異，P<0.01表示極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增與SSCP分析

用所設計的4對引物TCP1-1、TCP1-2、TCP1-3、TCP1-4,以羅非魚基因組DNA為模板進行 PCR擴增，產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，進行SSCP分析。結果分析表明：引物TCP1-1、TCP1-2、TCP1-3均無帶型多態(tài)性，引物TCP1-4在10 ℃樣本無帶型多態(tài)性。只有引物TCP1-4在8、12、14 ℃樣本電泳結果呈現(xiàn)帶型多態(tài)性，詳見圖1。

2.1.1 引物TCP1-4在不同低溫脅迫樣本擴增的電泳結果

引物TCP1-4在8、12和14 ℃樣本的電泳結果中均有2種不同帶型(圖1)，根據(jù)每個條帶呈現(xiàn)數(shù)目的不同分別命名為基因型 AA和基因型AB，統(tǒng)計樣本的基因型頻率及等位基因頻率結果見表2。

根據(jù)每個條帶呈現(xiàn)數(shù)目的不同分別命名為基因型 AA、AB圖1 引物TCP1-4在8、12和14 ℃樣品擴增的電泳結果Fig.1 Amplified electrophoresis diagram of TCP1-4 primer in 8 ℃,12 ℃ and 14 ℃ sample

從表2可知，在8 ℃不耐低溫組樣本中基因型AA、AB的基因型頻率分別為81.25%和18.75%，AA的基因型頻率顯著高于AB基因型頻率,在不耐低溫組中占優(yōu)勢地位。耐低溫組中基因型AA、AB的基因型頻率均為50.00%。2組對比發(fā)現(xiàn)，不耐低溫組的AA基因型頻率和等位基因A的頻率均高于耐低溫組。

表2 不同低溫樣品引物TCP1-4的基因型頻率及等位基因頻率Tab.2 Genotypic frequency and allele frequency of TCP1-4 primer on low temperature sample

在12 ℃和14 ℃樣本中：不耐低溫組基因型AA、AB的基因型頻率均為81.25%和18.75%；等位基因A的頻率為90.62%，顯著高于等位基因B的頻率9.38%，占優(yōu)勢地位。耐低溫組樣品中AB的基因型頻率分別為56.25%和62.50%，等位基因A的頻率分別為75.00%和68.75%；2組中基因型AB的頻率均高于基因型AA的頻率，等位基因A的頻率均處于優(yōu)勢地位。

2.2 TCP-1-eta基因多態(tài)性與羅非魚耐寒性狀的相關性分析

羅非魚TCP1-4引物PCR擴增片段SSCP分析的多態(tài)性與耐寒性狀的相關性結果表明：不耐低溫組和耐低溫組均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，引物TCP1-4在8 ℃(不耐低溫組和耐低溫組)樣品的位點，AA、AB基因型的分布與羅非魚耐寒性狀的相關性不顯著(χ2=3.463，P=0.063)。同時，不耐低溫組中AA基因型頻率81.25% 比AB基因型頻率18.75%高62.50%，處于優(yōu)勢地位；耐低溫組中AA、AB基因型頻率相同，均為50.00%。引物TCP1-4在12 ℃(不耐低溫組和耐低溫組)樣品的位點，AA、AB基因型的分布與耐寒性狀有顯著的相關性(χ2=4.800，P=0.028)。此時，在不耐低溫組中AA基因型頻率為81.25%，等位基因A的頻率90.62%高于等位基因B的頻率9.38%，AA基因型處于優(yōu)勢地位；在耐低溫組中 AB基因型頻率為56.25%，占優(yōu)勢地位。引物TCP1-4 在14 ℃(不耐低溫組和耐低溫組)的位點，基因型AA、AB的分布與耐寒性狀有顯著的相關性(χ2= 6.348，P=0.012)，等位基因A和基因型AB的頻率在耐低溫組中占優(yōu)勢地位。

3 討論

3.1 吉富羅非魚TCP-1-eta基因的PCR-SSCP多態(tài)性分析

近年來，有關魚類耐寒能力的研究已經(jīng)廣泛展開，主要集中在2大方面：一方面是探究魚類的低溫耐受分子機制；另一方面是魚類低溫耐受的相關功能基因研究[13]。目前，針對羅非魚耐寒性狀的基因與機制的報道也有不少，文獻[14]通過鑒定與羅非魚耐寒性狀相關的數(shù)量性狀位點和相關基因，發(fā)現(xiàn)基因 PAKLIP、LOC100697261、LOC100696456 的表達對其溫度有影響。Zerai等[15]研究發(fā)現(xiàn)Delta-9-Desaturase基因對尼羅羅非魚急慢性寒冷應激相關。但至今，關于羅非魚TCP-1-eta基因與其耐寒能力之間相關性的研究報道較少。本文對羅非魚TCP-1-eta基因的多態(tài)性與耐寒性狀之間的相關性研究發(fā)現(xiàn)：引物TCP1-1、TCP1-2、TCP1-3、TCP1-4(10 ℃)的結果均顯示無帶型多態(tài)性。引物TCP1-4在8、12、14 ℃時均呈現(xiàn)帶型多態(tài)性，而且2組(耐低溫組和不耐低溫組)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明種群處于遺傳平衡狀態(tài)。

3.2 TCP-1-eta基因多態(tài)性與耐寒性狀的相關性分析

對不耐低溫組與耐低溫組TCP-1-eta基因PCR-SSCP分析的基因型、基因型頻率、等位基因頻率進行統(tǒng)計，結果發(fā)現(xiàn)：TCP-1-eta基因中引物TCP1-4最終恒定溫度降為12、14 ℃的位點，其基因型AA、AB的分布與耐寒性狀之間的相關性顯著(P<0.05)，而在溫度降為8 ℃的位點，2種基因型的分布與耐寒性狀之間的相關性不顯著(P>0.05)。AA基因型頻率在不耐低溫組中處于優(yōu)勢地位，AB基因型頻率在耐低溫組中處于優(yōu)勢地位，由此可推測，AB基因型在處于低溫環(huán)境時有優(yōu)勢地位，與羅非魚的耐寒能力有關，TCP-1-eta基因可推斷為羅非魚潛在的耐寒基因。謝建麗等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在低溫誘導情況下，隨著低溫脅迫程度加強,尼羅羅非魚TCP-1-eta基因表達上調幅度增大，說明TCP-1-eta是低溫誘導下上調表達的基因，并推測出TCP-1-eta基因是尼羅羅非魚潛在的耐寒相關基因，與本文的推測一致，說明TCP-1-eta 基因與羅非魚低溫耐受能力相關。

4 結論

羅非魚TCP-1-eta基因序列設計的特異性引物TCP1-4在8、12、14 ℃時樣本電泳結果呈現(xiàn)多態(tài)性，而且12、14 ℃樣本的AA、AB基因型分布與耐寒性狀有顯著的相關性(P<0.05)。據(jù)此推測，TCP-1-eta基因是潛在的羅非魚耐寒相關基因。研究結果為分子標記耐寒性狀和輔助羅非魚耐寒品種選育提供了理論依據(jù)。