賈雅婷，許舒婭，李利紅，吳召運(yùn)

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州450046；2. 南陽(yáng)市本草艾開發(fā)有限公司，河南 方城 473200)

艾灸療法歷史悠久。艾絨為灸用制品的原材料， 系菊科植物艾(ArtemisiaargyiLévl.etVent.)的干燥葉按一定的工藝經(jīng)粉碎過篩后所得的細(xì)軟絨狀物[1]。艾葉去除艾絨后剩余的大量艾粉渣，大多被當(dāng)做廢棄物扔掉或者低價(jià)處理。河南不僅是艾葉資源大省，也是國(guó)內(nèi)近90%艾條、艾柱等艾灸用品的主產(chǎn)區(qū)，每年產(chǎn)生上萬噸的艾粉被作為垃圾處理。艾絨在艾葉中的含量不足10%，艾粉中還有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有效成分，有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。本研究在對(duì)艾粉提取物進(jìn)行體外抑菌活性比較的基礎(chǔ)上，以黃酮為指標(biāo)進(jìn)行提取純化工藝探討，以期為艾粉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

立式高壓滅菌鍋(LDZM-60K，上海審安醫(yī)療器械廠)；超凈工作臺(tái)(JH-SCB，上海鴻都電子科技有限公司)；生化培養(yǎng)箱(SPX-300BSH，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器(THZ-Q，太倉(cāng)市華美生化儀器廠)；電熱鼓風(fēng)干燥器(DHG-9423A)；電子天平(BSA224S-CW，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(HH-S雙列四孔，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000B，上海亞榮生化儀器廠)；真空泵(SHZ-95B，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；Varioskan多功能酶標(biāo)儀(Thermo)；超聲波清洗器(KQ3200E，昆山市超聲儀器有限公司)；移液槍(Eppendorf)。

1.2 藥材、試劑與培養(yǎng)基

藥材：艾粉(河南南陽(yáng)本草艾有限公司提供)。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海士峰生物科技有限公司，批號(hào)10471，純度98%)；乙醇(20190308，衛(wèi)輝市眾誠(chéng)消毒制劑有限公司)、甲醇(20190412，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、氯仿(20181025，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、乙酸乙酯(20181022，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)、正丁醇(20180901，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)、濃鹽酸(20181022，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)、鎂粉(20180906，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司)、2，3，5-三苯基氯化四氮唑溶液(北京索萊寶科技有限公司);無菌水等。

培養(yǎng)基：NB營(yíng)養(yǎng)肉湯(北京市奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；NB營(yíng)養(yǎng)瓊脂(北京市奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；Agar(Solarbio公司)。

1.3 試驗(yàn)用菌

金黃色葡萄球菌(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供)。

2 方法

2.1 艾粉不同提取物的體外抑菌

2.1.1 艾粉提取物的制備

艾粉有機(jī)溶劑提取液的制備：精密稱取5.0 g艾粉若干份，分別加入乙酸乙酯、甲醇、70%乙醇溶液50 mL，室溫靜置24 h，超聲處理1 h，濾過，濾液濃縮并定容至5 mL，得濃度為1.0 g/mL的有機(jī)溶劑提取液。

艾粉水提液的制備：精密稱取艾粉5.0 g，加入蒸餾水50 mL，煎煮30 min，冷卻后濾過，濾液濃縮并定容至5 mL，得濃度為1.0 g/mL的水提液。

2.1.2 培養(yǎng)基的制備

NB肉湯的配制：按照說明書上的方法，稱取NB營(yíng)養(yǎng)肉湯粉4.50 g于三角瓶中，加入250 mL蒸餾水使溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

NB瓊脂的配制：稱取9.0 gNB瓊脂粉和10 g Agar于三角瓶中，加入500 mL蒸餾水溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

2.1.3 試驗(yàn)菌的制備

將金黃色葡萄球菌接種于新鮮NB肉湯培養(yǎng)基中，振蕩后置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，用無菌培養(yǎng)基稀釋1 000倍，置4 ℃冰箱中備用。

2.1.4 抑菌活性測(cè)定

采用打孔法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定[2]，以金黃色葡萄球菌為指示菌，評(píng)價(jià)艾粉不同提取物的抑菌效果。用移液槍吸取50 μL菌液加入NB瓊脂板上，均勻涂布，用打孔器在平板上按照四分法打孔，酒精燈火焰封底。用移液槍吸取50 μL艾粉不同提取液加入到對(duì)應(yīng)瓊脂板的孔內(nèi)，每個(gè)提取液做三個(gè)孔作為平行試驗(yàn)，另外一個(gè)孔加入對(duì)應(yīng)溶劑作為空白對(duì)照，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。

2.1.5 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

MIC的測(cè)定[3]：根據(jù)CLSI2017 版指南(CLSI：M07-A10，2017)，采用微量倍比稀釋法進(jìn)行測(cè)定。取無菌96孔微量培養(yǎng)板，加入培養(yǎng)液100 μL，第一行每孔依次加入艾粉不同提取液100 μL，混勻后取出100 μL移至第2行中，以此類推，依次倍比稀釋到第8行混勻后棄掉100 μL，使各孔中提取物濃度倍比降低。最后加入100 μL菌液，混勻。以無提取液的培養(yǎng)液100 μL加菌液100 μL作為陽(yáng)性對(duì)照，以不加提取液和菌液的培養(yǎng)液200 μL作為陰性對(duì)照。將培養(yǎng)板放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察并記錄菌種生長(zhǎng)情況，測(cè)定其MIC值。

2.2 艾粉提取液黃酮的富集及含量測(cè)定

2.2.1 艾粉提取工藝

根據(jù)2.1中艾粉不同溶劑提取物的抑菌效果，選取抑菌效果好的溶劑進(jìn)行提取。稱取艾粉粉末100 g，加入溶劑1 000 mL，回流提取三次，每次1 h，濾過，合并濾液，減壓回收，得到艾粉粗提物浸膏。

2.2.2 艾粉黃酮富集工藝

采用濕法裝柱，將處理好的硅藻土40.0 g均勻裝入層析柱中。稱取艾粉粗提物浸膏1.0 g，乙醚拌樣上柱。分別用水飽和過的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，按柱體積收集洗脫液，鹽酸鎂粉反應(yīng)進(jìn)行鑒別跟蹤，合并含黃酮部位，回收溶劑。

2.2.3 艾粉黃酮含量測(cè)定方法

2.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[4]精密稱取蘆丁對(duì)照品10.30 mg置于50 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解并定容至刻度，得濃度為0.206 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL，置于25 mL容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液和10%Al(NO3)3溶液各1.00 mL，搖勻，放置6 min；再加入4%NaOH溶液10 mL，用70%乙醇定容至25 mL，搖勻，放置15 min。在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=4.5882X-0.0049(R2=0.9981)，表明蘆丁在0.00824～0.04944 mg/mL范圍內(nèi)吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3.2 原料及提取、分離物的待測(cè)液制備 精密稱取艾粉1.0g置于圓底燒瓶中，加入70%乙醇溶液20 mL，于水浴鍋中回流30 min，冷卻后取下，過濾，得濾液。精密量取濾液0.1 mL于10 mL容量瓶中，用70%乙醇補(bǔ)充至3 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加入4%NaOH溶液4 mL，混勻，用70%乙醇定容，搖勻，放置15 min。

分別稱取艾粉乙醇提取物及洗脫物適量，加入70%乙醇適量溶解，過濾，精密量取濾液，按上述操作方法進(jìn)行顯色。

2.2.3.3 各樣品黃酮含量測(cè)定 分別量取上述各待測(cè)液200 μL于96孔板中，于500 nm波長(zhǎng)下，用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，計(jì)算其平均值，代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。黃酮含量計(jì)算公式為:CV/103m×100%。其中：C為樣品溶液由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來的濃度，單位：mg/mL；V為樣品溶液的稀釋體積，單位：mL；m為樣品取樣量，單位：mg。

3 結(jié)果與分析

3.1 艾粉不同提取物體外抑菌效果

3.1.1 藥物敏感性測(cè)定結(jié)果

通過瓊脂打孔法測(cè)定艾粉不同提取物的抑菌圈，結(jié)果見表1。由結(jié)果可知，艾粉水提物對(duì)金黃色葡萄球菌無抑菌作用，而其他3種有機(jī)溶劑提取物均表現(xiàn)出明顯的抑菌性，抑菌圈直徑均大于16 mm，其中70%乙醇提取物的抑菌圈最大，達(dá)18.6 mm。

表1 艾粉4種提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈

3.1.2 MIC的測(cè)定結(jié)果

采用微量倍比稀釋法測(cè)定艾粉不同提取物的抑菌活性。陰性空白對(duì)照無細(xì)菌生長(zhǎng)，說明實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，無污染；陽(yáng)性空白對(duì)照細(xì)菌長(zhǎng)勢(shì)良好，表明實(shí)驗(yàn)菌種與培養(yǎng)基可靠。艾粉4種不同溶劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的體外MIC結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，4種不同溶劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果隨著濃度的變化有所不同。其中，甲醇提取液和70%乙醇提取液抑菌效果較好，其MIC值為31.25 mg/mL；乙酸乙酯提取液抑菌效果次之，其MIC值為125 mg/mL，而艾粉水提液抑菌效果最差，MIC值為250 mg/mL。

結(jié)合藥敏實(shí)驗(yàn)和最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)可以看出，艾粉70%乙醇提取液的抑菌圈最大，最小抑菌濃度最低，說明其抑菌效果最好。艾粉甲醇提取液的抑菌活性與70%乙醇提取液的效果相當(dāng)，考慮到溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的安全性，優(yōu)選70%乙醇作為提取溶劑。

表2 艾粉4種提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

3.2 硅藻土柱層析純化及黃酮含量測(cè)定結(jié)果

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)艾粉原料、艾粉乙醇提取物及硅藻土柱層析洗脫部位的黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。由表可知，艾粉原料的黃酮含量為9.82%，70%乙醇浸膏的黃酮含量為19.92%；硅藻土柱層析純化后，黃酮含量達(dá)到27.86%。硅藻土純化后黃酮含量比70%乙醇提取物提高了近10%，說明可以用硅藻土對(duì)艾粉黃酮進(jìn)行初步的純化。

表3 艾粉乙醇提取物及洗脫物的黃酮含量

4 討論與結(jié)論

艾葉含有多種化學(xué)成分，如揮發(fā)油、黃酮類、炔類、三萜類、有機(jī)酸及生物堿類等[5,6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，艾草的提取物可有效抑制細(xì)菌和真菌類物質(zhì)[7]，其抑菌成分主要包括揮發(fā)油、黃酮類和三萜類[8,9]。艾粉作為艾葉的主要組成部分，迄今缺乏對(duì)其活性的研究。本實(shí)驗(yàn)考察了艾粉不同溶劑提取物的抑菌效果，結(jié)果表明，艾粉70%乙醇提取物具有明顯的抑菌效果，MIC為31.25 mg/mL，有很好的應(yīng)用前景。

與公認(rèn)的黃酮含量比較高的中藥材槐米相比(總黃酮以蘆丁計(jì)，《中國(guó)藥典》規(guī)定槐花中不得少于8.0%，槐米中不得少于20%[10])，本試驗(yàn)中艾粉的黃酮含量接近10%，達(dá)到了槐花的標(biāo)準(zhǔn)，說明制備艾絨后的副產(chǎn)品艾粉具有巨大的開發(fā)利用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用硅藻土柱層析法對(duì)艾粉70%乙醇提取物中的黃酮進(jìn)行了富集，結(jié)果表明，經(jīng)過硅藻土分離純化后，其黃酮類成分含量達(dá)27.86%。該方法成本低，操作簡(jiǎn)單，為艾粉資源的擴(kuò)大利用和工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)參考。

作為艾絨制備剩余物的艾粉，其來源和組成復(fù)雜。受到艾葉產(chǎn)地、艾葉采收期、制絨工藝等因素的影響，質(zhì)量控制等還有待開展多批次的深入研究，以為其精加工及利用提供參考。