鄭曉楠，王紅宇，李雪菡，呂湘琳，齊紅莉、2*

(1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384； 2.中國(guó)海洋大學(xué) 原生動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

近年來(lái)，海水養(yǎng)殖業(yè)面臨著養(yǎng)殖水體水質(zhì)惡化、各類病害肆虐發(fā)生等嚴(yán)重問(wèn)題[1]。其中，在各類海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物養(yǎng)殖中，由纖毛蟲原生動(dòng)物所導(dǎo)致的病害尤為嚴(yán)重[2-3]。然而，國(guó)內(nèi)目前防治危害性纖毛蟲的有效方法較少，在養(yǎng)殖過(guò)程中通常使用高錳酸鉀、魯哥氏液、福爾馬林、抗生素、含銅離子類制劑等化學(xué)藥物對(duì)病害性纖毛蟲進(jìn)行殺滅[4-8]，這些藥物如果長(zhǎng)期使用不僅會(huì)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境造成污染，而且對(duì)食品安全也存在一定隱患[9-11]。研究表明，中草藥在控制纖毛蟲病害方面具有高效、環(huán)保、價(jià)廉、低殘留、低成本、易制備、功能多樣等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。因此，使用中草藥殺滅病害性纖毛蟲符合水產(chǎn)養(yǎng)殖健康、無(wú)公害的要求[14]。

本試驗(yàn)中所用懸游雙眉蟲Diophrysappendiculata[15]是養(yǎng)殖中常見的病害種，可在魚蝦貝育苗中暴發(fā)疫情，使代謝廢物大量增加、水質(zhì)惡化，并給養(yǎng)殖動(dòng)物帶來(lái)嚴(yán)重危害。目前，尚未見用中草藥對(duì)其進(jìn)行防治的報(bào)道。本試驗(yàn)中，以懸游雙眉蟲為試驗(yàn)動(dòng)物，在光照(14L∶10D)、全黑暗兩種條件下，研究了13種中草藥對(duì)懸游雙眉蟲的急性毒性效應(yīng)，旨在防治病害性纖毛蟲的最適光照條件下，篩選出高效、低毒的中草藥，為防治養(yǎng)殖水體中的懸游雙眉蟲提供相應(yīng)的方法，同時(shí)也為懸游雙眉蟲的毒理學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用懸游雙眉蟲Diophrysappendiculata由中國(guó)海洋大學(xué)原生動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)室種庫(kù)惠贈(zèng)。

試驗(yàn)所用中草藥購(gòu)自天津市南開區(qū)華瑞大藥房，分別為白蘚皮Cortexdictamni、苦參sophoraeflavescentis、穿心蓮Herbaandrographis、川楝子Fructustoosendan、使君子Fructusquisqualis、土槿皮Pseudolarixamabilis、仙鶴草Agrimoniapilosa、鶴虱Carpesiumabrotanoides、檳榔Arecacatechu、皂角Gleditsiasinensis、百部Radixstemonae、蛇床子Fructuscnidii和天南星Rhizomaarisaematis。

1.2 方法

1.2.1 種群培養(yǎng)活化 試驗(yàn)前將懸游雙眉蟲置于滅菌的人工海水(鹽度30)中，以商業(yè)干酵母為食進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，至其種群密度為7×105ind./L，懸游雙眉蟲在恒溫28 ℃、光照強(qiáng)度2000 lx、光照(14L∶10D)和全黑暗條件下培養(yǎng)。

1.2.2 藥物制備 將13種中草藥粉碎后，用電子分析天平各取1 g，用蒸餾水為提取溶劑，料液比為1∶10(g∶mL)，使其終濃度相當(dāng)于原藥液(1×105mg/L)。使用超聲波清洗器超聲波提取15 min，4 ℃下靜置24 h，用濾紙過(guò)濾后，以4000 r/min離心10 min，于4 ℃下保存?zhèn)溆肹16]。

1.2.3 藥物對(duì)懸游雙眉蟲殺滅效果的測(cè)定 試驗(yàn)分別在光照(14L∶10D)、全黑暗兩種條件下進(jìn)行，使用六孔培養(yǎng)板，蟲體密度為1×104ind./L，各中草藥原藥液經(jīng)稀釋后，得到中草藥溶液中藥物質(zhì)量濃度為900 mg/L，用于檢測(cè)對(duì)懸游雙眉蟲的殺滅效果[17]，另設(shè)不含中草藥的對(duì)照組，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)持續(xù)48 h，每隔12 h測(cè)定一次懸游雙眉蟲種群密度，用終濃度為2%的戊二醛固定[18]，用1 mL浮游動(dòng)物計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)，每孔重復(fù)計(jì)數(shù)兩次，兩次計(jì)數(shù)誤差不超過(guò)15%[2]。

1.2.4 急性毒性試驗(yàn) 通過(guò)藥物篩選試驗(yàn)，將篩選出對(duì)懸游雙眉蟲具有明顯殺滅效果的檳榔、土槿皮和仙鶴草進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，按等間距法[19]設(shè)置正式試驗(yàn)的藥物質(zhì)量濃度，各中草藥原藥液經(jīng)稀釋后得到的具體藥物質(zhì)量濃度分別為：檳榔對(duì)懸游雙眉蟲的藥物質(zhì)量濃度為0(對(duì)照)、30、40、50、60、70、80 mg/L；土槿皮為0(對(duì)照)、190、210、230、250、270、290 mg/L；仙鶴草為0(對(duì)照)、310、340、370、400、430、460 mg/L。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)開始后連續(xù)觀察6 h，隨后每隔12 h觀察并計(jì)算一次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平設(shè)為0.05。通過(guò)Sigmaplot 12.5軟件獲得急性毒性試驗(yàn)對(duì)懸游雙眉蟲種群生長(zhǎng)的影響圖，采用概率單位法測(cè)定半致死質(zhì)量濃度(LC50)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺滅懸游雙眉蟲的中草藥篩選

從圖1可見：在14L∶10D光照條件下，中草藥藥液中藥物濃度為900 mg/L時(shí)，13種中草藥組懸游雙眉蟲種群密度與對(duì)照組間均存在顯著性差異(P<0.05)；皂角、川楝子、百部、穿心蓮、白蘚皮、苦參、蛇床子、使君子、鶴虱、天南星對(duì)懸游雙眉蟲的種群生長(zhǎng)均起到了明顯的促進(jìn)作用(P<0.05)，僅仙鶴草、檳榔和土槿皮對(duì)蟲體有殺滅作用，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，殺滅效果越來(lái)越強(qiáng)，仙鶴草在48 h時(shí)對(duì)蟲體幾乎完全殺滅，檳榔和土槿皮在12 h內(nèi)對(duì)懸游雙眉蟲的殺滅作用達(dá)到了100%。

從圖2可見：在全黑暗條件下，13種中草藥組懸游雙眉蟲種群密度與對(duì)照組間均存在顯著性差異(P<0.05)；除檳榔、土槿皮和仙鶴草外，其余中草藥在48 h內(nèi)對(duì)懸游雙眉蟲生長(zhǎng)均起到了促進(jìn)作用(P<0.05)；與光照組(14L∶10D)相比，全黑暗組對(duì)照在24 h后的種群密度要高于光照組，全黑暗組的仙鶴草隨時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)蟲體的殺滅效果逐漸增強(qiáng)，但懸游雙眉蟲的種群密度要高于光照組；全黑暗組和光照組檳榔均可在12 h內(nèi)將懸游雙眉蟲全部殺滅。這進(jìn)一步證明，無(wú)論是光照還是全黑暗條件下，檳榔、土槿皮、仙鶴草3種中草藥對(duì)懸游雙眉蟲均有明顯的殺滅效果。

2.2 急性毒性試驗(yàn)

2.2.1 3種中草藥對(duì)懸游雙眉蟲的急性毒性 從圖3可見：對(duì)照組中懸游雙眉蟲的種群生長(zhǎng)符合邏輯斯蒂生長(zhǎng)曲線，無(wú)明顯停滯期，指數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)到48 h時(shí)達(dá)到種群最大密度；全黑暗組的種群最大密度高于光照組(14L∶10D)；兩組處于穩(wěn)定期的時(shí)間均較短，進(jìn)入衰退期的時(shí)間也大致相同。

從圖3-A、B可見：經(jīng)檳榔處理后，30 mg/L試驗(yàn)組的懸游雙眉蟲種群生長(zhǎng)符合邏輯斯蒂生長(zhǎng)曲線，36 h時(shí)達(dá)到種群最大密度，全黑暗組的種群最大密度高于光照組(14L∶10D)，與對(duì)照相比，光照和全黑暗組蟲體狀態(tài)無(wú)明顯變化，但運(yùn)動(dòng)速度會(huì)受到一定影響，96 h時(shí)，光照組的死亡率達(dá)42.2%，全黑暗組死亡率達(dá)39.4%；40 mg/L以上的試驗(yàn)組，蟲體數(shù)量呈明顯呈下降趨勢(shì)，蟲體的游動(dòng)速度也受到明顯的影響，其中，80 mg/L試驗(yàn)組受到影響最為明顯，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，此組蟲體狀態(tài)由運(yùn)動(dòng)遲緩到多數(shù)個(gè)體附底，棘毛迅速擺動(dòng)，蟲體不爬行，數(shù)量明顯下降，光照組在12 h時(shí)的死亡率為58.9%，48 h時(shí)全部死亡，而全黑暗組在96 h時(shí)的死亡率達(dá)到97.8%。

從圖3-C、D可見：經(jīng)仙鶴草處理后，12 h時(shí)，濃度為310 mg/L試驗(yàn)組蟲體較活潑，棘毛擺動(dòng)迅速，種群數(shù)量上升，未引起死亡，340 mg/L及以上試驗(yàn)組蟲體會(huì)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；24 h時(shí)，濃度為310 mg/L試驗(yàn)組蟲體運(yùn)動(dòng)遲緩，少數(shù)個(gè)體變形，種群數(shù)量下降不明顯，310、340、370、400、430、460 mg/L光照組(14L∶10D)死亡率分別為7.8%、18.9%、31.7%、43.3%、54.4%、63.3%，全黑暗組死亡率分別為5.6%、11.1%、20.6%、30.0%、45.6%、51.1%；36 h時(shí)，各試驗(yàn)組種群數(shù)量均明顯下降，多數(shù)蟲體運(yùn)動(dòng)緩慢，部分附底旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，蟲體收縮明顯；48 h時(shí)，光照組濃度為460 mg/L試驗(yàn)組多數(shù)蟲體附底運(yùn)動(dòng)，棘毛擺動(dòng)緩慢，蟲體呈透明狀，光照組死亡率為91.1%；72 h時(shí)，光照組死亡率為100%，全黑暗組死亡率為54.4%；96 h時(shí)全黑暗組死亡率為77.8%。

從圖3-E、F可見：土槿皮作用于懸游雙眉蟲后，12 h時(shí)，190 mg/L試驗(yàn)組蟲體受影響較小，未引起死亡；24 h時(shí)，210 mg/L試驗(yàn)組只有少數(shù)蟲體運(yùn)動(dòng)緩慢，其余個(gè)體正常游泳，230 mg/L及以上試驗(yàn)組蟲體體積變小，游動(dòng)能力下降；48 h時(shí)，各處理組多數(shù)蟲體貼于六孔板底部，游泳速度明顯減慢，290 mg/L試驗(yàn)組受影響程度最為明顯，棘毛擺動(dòng)遲緩，190、210、230、250、270、290 mg/L光照組(14L∶10D)死亡率分別為32.2%、43.3%、52.2%、60%、67.8%、74.4%，各濃度對(duì)應(yīng)全黑暗組死亡率分別為10.5%、20.5%、31.7%、42.2%、54.4%、66.7%；96 h時(shí)，290 mg/L試驗(yàn)組蟲體變小變圓且在原地顫動(dòng)，光照組蟲體死亡率為90.0%，全黑暗組死亡率為84.4%。

2.2.2 3種中草藥對(duì)懸游雙眉蟲的LC50采用概率單位分析法，得出3種中草藥對(duì)懸游雙眉蟲的死亡率概率單位與所加藥物質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)的線性回歸方程為(表1)：光照組(14L∶10D)，檳榔、土槿皮和仙鶴草對(duì)懸游雙眉蟲的死亡率概率單位與所加藥物質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)24 h的線性回歸方程分別為y=8.1764x-9.8754(R2=0.9968)、y=9.9323x-19.006(R2=0.9843)、y=10.148x-21.612(R2=0.99)，24 h LC50分別為65.964、261.194、419.169 mg/L；全黑暗組，檳榔、土槿皮和仙鶴草對(duì)懸游雙眉蟲的死亡率概率單位與所加藥物質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)24 h的線性回歸方程分別為y=5.7242x-5.7597(R2=0.9705)、y=9.5614x-18.339(R2=0.9998)、y=9.8004x-21.007(R2=0.9936)，24 h LC50分別為75.803、276.033、450.471 mg/L；檳榔、土槿皮和仙鶴草均在光照(14L∶10D)條件下對(duì)懸游雙眉蟲的殺滅效果較好，懸游雙眉蟲對(duì)3種藥物的敏感性依次為檳榔>土槿皮>仙鶴草。

表1 3種中草藥對(duì)懸游雙眉蟲的半致死濃度(LC50)Tab.1 LC50 of three types of Chinese herbal medicines to ciliate Diophrys appendiculata

3 討論

3.1 光照對(duì)懸游雙眉蟲種群生長(zhǎng)的影響

光照是生態(tài)系統(tǒng)中重要的非生物因子，對(duì)水生生物的生長(zhǎng)和發(fā)育有著重要的影響，既能促進(jìn)又能抑制水生生物的生長(zhǎng)[20]。研究表明，光照對(duì)褶皺臂尾輪蟲Brachionusplicatilis種群的增長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，光照周期越長(zhǎng)，種群密度增長(zhǎng)越快[21]；角毛藻Chaetocerossp.在光照強(qiáng)度為5000 lx 時(shí)生長(zhǎng)最快，當(dāng)光照強(qiáng)度低于1000 lx時(shí)，其生長(zhǎng)會(huì)受到明顯抑制[22]。本研究中發(fā)現(xiàn)，光照(14L∶10D)條件會(huì)抑制懸游雙眉蟲的種群增長(zhǎng)，全黑暗條件下其種群密度要大于光照(14L∶10D)條件下的種群密度，這與王海博[23]得出的光照會(huì)抑制扇形游仆蟲Euplotesoctocarinatus種群增長(zhǎng)的結(jié)果基本一致，推測(cè)光照對(duì)纖毛蟲種群生長(zhǎng)的影響與其體內(nèi)的感光物質(zhì)或感光基因有關(guān)。

3.2 中草藥對(duì)懸游雙眉蟲的殺滅效果

近年來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中化學(xué)藥物應(yīng)用較廣，對(duì)人類副作用較大，高藥殘、高耐藥性藥物在水產(chǎn)領(lǐng)域正逐漸被禁用[24]。因此，謹(jǐn)慎用藥在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治及水生生物優(yōu)勢(shì)種群控制中尤為重要[25]。中草藥具有天然、無(wú)毒、制備方便、價(jià)格低廉[12-13]等優(yōu)點(diǎn)，因此，使用中草藥防治病害性纖毛蟲及控制養(yǎng)殖水體中纖毛蟲的優(yōu)勢(shì)種群效果較好。長(zhǎng)期以來(lái)，中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被用作引誘劑、生長(zhǎng)促進(jìn)劑和抗菌劑[26-27]，可以作為抗生素、化學(xué)藥物和其他合成化合物的有效替代品[28]。

檳榔堿是檳榔的有效驅(qū)蟲成分，可對(duì)寄生蟲的神經(jīng)系統(tǒng)有極強(qiáng)的麻痹作用，從而使蟲體失活[29]。本試驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)，13種中草藥水提物中僅有檳榔、土槿皮和仙鶴草對(duì)懸游雙眉蟲具有明顯殺滅作用。鉏超等[30]研究發(fā)現(xiàn)，100 mg/L的檳榔水提液能在1 h內(nèi)有效殺滅多子小瓜蟲Ichthyophthiriusmultifiliis。馬澤寧[31]研究發(fā)現(xiàn)，檳榔和貫眾濃度為30 mg/L時(shí)，作用1 h可使多子小瓜蟲的死亡率達(dá)到100%。本研究中發(fā)現(xiàn)，檳榔的藥物濃度高于40 mg/L時(shí)，對(duì)懸游雙眉蟲作用效果明顯，藥物濃度為80 mg/L時(shí)效果最強(qiáng)，48 h可使懸游雙眉蟲的死亡率達(dá)到100%。王高學(xué)等[32]將檳榔作用于中型指環(huán)蟲Dactylogyrusintermedius及感染中型指環(huán)蟲的金魚Carassiusauratus時(shí)發(fā)現(xiàn)，藥物濃度為100 mg/L的檳榔在48 h 時(shí)對(duì)蟲體的殺滅作用達(dá)到100%，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致，且藥物濃度為600 mg/L的檳榔才會(huì)使魚體中毒，由此可見，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中檳榔對(duì)于纖毛蟲引起的疾病是一種理想的殺蟲藥物。

土槿皮中含有黃烷醇類化合物表兒茶素，通過(guò)與細(xì)胞膜組成成分相互作用，改變細(xì)胞膜的物理特性，造成細(xì)胞內(nèi)容物滲漏；調(diào)控相關(guān)基因，控制蛋白質(zhì)表達(dá)，影響細(xì)胞正常代謝；產(chǎn)生活性氧并造成胞內(nèi)外氧化應(yīng)激，導(dǎo)致生物大分子受到氧化損傷，從而起到抑菌殺蟲的功效[33]。暨杰[34]用土槿皮殺滅魚類指環(huán)蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)，土槿皮對(duì)蟲體的殺滅作用達(dá)到100%。本研究中發(fā)現(xiàn)，土槿皮藥物濃度為290 mg/L的試驗(yàn)組受影響程度最為明顯，此濃度值明顯高于暨杰[34]所研究的指環(huán)蟲殺滅濃度，其96 h時(shí)使懸游雙眉蟲的死亡率達(dá)到了90%。胡梁及等[17]研究發(fā)現(xiàn)，土槿皮作用于金鼓魚Scatophagusargus的中毒劑量為300 mg/L，因此，當(dāng)使用土槿皮控制水生生物優(yōu)勢(shì)種群時(shí)要充分控制用藥量。

仙鶴草含有黃酮類化合物，其可破壞細(xì)胞膜的完整性，使膜電子傳遞、核苷酸合成及ATP活性等功能受損，從而起到抑菌殺蟲的作用[35]。喻運(yùn)珍等[36]研究發(fā)現(xiàn)，1000 mg/L的仙鶴草對(duì)棘頭蟲有明顯的殺滅作用，其可在4 h內(nèi)使蟲體全部死亡。本研究中，仙鶴草藥物濃度為460 mg/L試驗(yàn)組在72 h時(shí)使懸游雙眉蟲的死亡率達(dá)到100%，這與王彬等[37]得出的仙鶴草對(duì)多子小瓜蟲Ichthyophthiriusmultifiliis生長(zhǎng)影響結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)表明，仙鶴草更有利于控制懸游雙眉蟲的生長(zhǎng)。

本試驗(yàn)中通過(guò)比較檳榔、土槿皮和仙鶴草在12、24、48、96 h的半致死質(zhì)量濃度表明，懸游雙眉蟲對(duì)3種藥物的敏感性大小依次為檳榔>土槿皮>仙鶴草，這表明檳榔對(duì)懸游雙眉蟲具有較強(qiáng)的急性致死毒性，本研究結(jié)果可為養(yǎng)殖水體中懸游雙眉蟲的防治提供相應(yīng)方法，同時(shí)也為懸游雙眉蟲的毒理學(xué)研究提供生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。中草藥成分復(fù)雜，今后可對(duì)多種溶劑提取其不同有效成分或復(fù)方制劑有效成分的治療機(jī)制進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步了解其藥理作用。

4 結(jié)論

(1)13種中草藥中僅檳榔、土槿皮和仙鶴草在光照(14L∶10D)條件下對(duì)懸游雙眉蟲有明顯殺滅效果，三者對(duì)懸游雙眉纖毛蟲的24 h LC50分別為65.964、261.194、419.169 mg/L。

(2)檳榔的殺滅作用最強(qiáng)，其藥物濃度為80 mg/L時(shí)在48 h時(shí)可使懸游雙眉蟲全部致死。因此，檳榔可作為首選藥物對(duì)養(yǎng)殖水體中優(yōu)勢(shì)種群的病害性纖毛蟲進(jìn)行治理。