徐文剛，唐永政，張建柏，征矢野清，李秉鈞*

(1. 煙臺大學 海洋學院，山東 煙臺 264005； 2. 煙臺市海洋經(jīng)濟研究院，山東 煙臺 264003；3. 長崎大學 環(huán)東シナ海環(huán)境資源研究センター，日本 長崎 851-2213)

石斑魚廣泛分布于中國、日本、韓國及其他亞洲國家，因其高品質的魚肉營養(yǎng)價值和較高的商業(yè)價值而被認為是最重要的海洋經(jīng)濟魚類之一[1]。作為一種廣受歡迎的海水魚類，其產(chǎn)量在中國逐年增加，2018年達13.15萬t[2]。石斑魚屬于雌雄同體、雌性先熟的海水魚類，目前，國內有關石斑魚類養(yǎng)殖的生物學研究報道主要集中在環(huán)境脅迫[3]、營養(yǎng)成分[4]、形態(tài)觀察[5]，以及雜交試驗及養(yǎng)殖研究[6-8]等方面。

黑邊石斑魚Epinephelusfasciatusu為石斑魚屬的一種，廣泛分布在中國南海[9]、日本本州以南[10]、印度洋，以及太平洋的熱帶和溫帶地區(qū)。由于其生長快速且對環(huán)境的適應能力較強，已成為東亞地區(qū)重要的水產(chǎn)資源之一。有研究表明，黑邊石斑魚的產(chǎn)卵峰值發(fā)生在滿月后[10]，但有關其性腺發(fā)育及產(chǎn)卵的詳細過程尚未見報道。此外，黑邊石斑魚雖在溫帶和熱帶區(qū)域均有分布，但有關其在所有海域中是否能發(fā)育成熟并產(chǎn)卵，尚未有明確的結論。

硬骨魚類的繁殖不僅受到內分泌系統(tǒng)如腦-垂體-性腺軸(BPG軸)的調控[11-12]，還綜合受到其他因素如水溫、光照和年齡等的影響[13]。研究表明，石斑魚性腺發(fā)育成熟與體長、體質量和年齡有關[14-16]。黑邊石斑魚的生長體長最大為50 cm左右，屬于中小型魚類，一般在2齡左右時性腺初步發(fā)育成熟。因此，與其他石斑魚相比，黑邊石斑魚具有作為周年取樣標本的優(yōu)勢。目前，國內外尚未見對其在相關海域進行周年采樣的調查報告。本研究中，對日本長崎市東中國海海域進行一周年的連續(xù)采樣，分析黑邊石斑魚卵巢周年發(fā)育的情況及血清中性激素含量變化，以期為石斑魚的成熟誘導和探尋最佳人工繁殖條件提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

自2016年8月—2017年9月，采用漁船捕撈作業(yè)和垂釣法相結合的方式，在日本長崎市東中國海海域每月隨機采樣，并分別記錄每月采樣的數(shù)量，共計獲得樣本數(shù)量140尾，其中，2016年10月由于采樣后其體弱死亡導致數(shù)量不足而無法進行樣本分析。將所捕獲的雌性黑邊石斑魚作為試驗魚。采樣期間同時記錄海水溫度的變化。

1.2 方法

1.2.1 血液和卵巢樣品的采集 所捕獲的成魚用2-苯氧乙醇麻醉后，測量其全長和體質量。從尾柄部采血，血液在4 ℃ 下以8000g離心20 min后取上層血清保存在超低溫冰箱(-80 ℃)中。取下卵巢，測定其質量，計算其性腺指數(shù)(GSI，%)，計算公式為

GSI=WG/WB×100%。

其中：WG為卵巢質量(g)；WB為體質量(g)。此后，將卵巢固定在波恩試劑中，24～48 h后轉移至70%的酒精中保存，用于組織學分析。

1.2.2 生殖腺的組織學觀察 將石斑魚性腺用常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟(熔點54 ℃)包埋，連續(xù)切片，厚度為5 μm。采用蘇木精-伊紅(H.E)染色，中性樹膠封片，在光學顯微鏡(Olympus FX380型)下觀察及顯微攝影，以各個體中卵母細胞最發(fā)達的階段作為生殖腺的發(fā)育階段，依據(jù)國內外學者[17-20]的標準對性腺發(fā)育進行分期，共分為6個時期。

(1) 第Ⅰ時相：核仁外周期(Peri-nucleolus stage, Pn)，細胞體積??；細胞質少，顯強嗜堿性；核仁1～2個，分布在核的中央或邊緣。細胞質被蘇木精染色深，核呈現(xiàn)巨大化，核中出現(xiàn)很多小的核仁。

(2) 第Ⅱ時相：卵黃囊泡期(Yolk vesicle stage,Yv)，小生長期。卵徑大小懸殊；核仁數(shù)個，分布在核的邊緣；單層濾泡膜。卵母細胞生長，細胞質中出現(xiàn)卵黃胞和油球。

(3) 第Ⅲ時相：次級卵黃球期(Secondary yolk stage, Sy)，大生長期。核周細胞質出現(xiàn)油滴，環(huán)形帶狀分布，并向胞質邊緣擴散；雙層濾泡膜。卵母細胞快速生長，卵黃球迅速累積，占細胞質的大半。

(4) 第Ⅳ時相：三級卵黃球期(Tertiary yolk stage, Ty)，大生長晚期。卵黃顆粒形成，油滴增多，后來充滿細胞質。細胞質中已經(jīng)積累了大量卵黃，但是核移動還未開始。

(5) 第Ⅴ時相：成熟期(Ripe, Ri)，細胞核移至動物極，核膜溶解，核仁消失；卵黃顆粒逐漸融合；油滴融合形成油球。核移動到動物極一側。

(6) 第Ⅵ時相：退化期(Degeneration, De)，卵膜模糊而斷裂；卵黃被吞噬，細胞質和卵黃膠液化并形成許多空泡。細胞核破裂，通過吸水達到透明化的狀態(tài)。

1.2.3 血清中雌二醇濃度檢測 雌二醇(Estradiol, E2)濃度檢測參照左永松等[21]的方法。詳細步驟為：將-80 ℃冷凍的血清樣品經(jīng)過4 ℃解凍后再次離心取得上層血清，然后將血清經(jīng)甲醇-乙醚低溫冷凍蒸發(fā)系統(tǒng)進行類固醇的提純，經(jīng)過3次冷凍蒸發(fā)后的血清樣品可用于檢測。采用EIA(Enzyme immunoassy)酶聯(lián)免疫試劑盒(Cayman Chemical公司)測定E2濃度。

1.2.4 血清中性成熟激素DHP和20β-S濃度檢測 按照“1.2.3”節(jié)中的提純步驟，獲得黑邊石斑魚提純的血清樣本。采用酶聯(lián)免疫吸附法ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)測定血清中17α、20β雙羥孕酮(20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one, DHP)和17α、20β、21-三羥孕酮(21-trihydroxy-4-pregnen-3-one,20β-S)的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 18.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行比較分析，采用Kolmogorov-Smirnov 法或 Shapiro-Wilk 法進行正態(tài)分布檢測，利用ANOVA檢驗及 Tukey’s HSD 法進行差異性比較分析，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 采樣海域水溫的變化

從圖1可見，水溫于2016年8月達到最高(29 ℃)，2017年2月逐漸下降至13 ℃，之后再次上升，2017年8月為27 ℃，9月達到28 ℃。

2.2 黑邊石斑魚體長、體質量、性腺質量和性腺指數(shù)的變化

從表1可見：2016年8月采集的樣本體長為(288.88±6.10)mm，體質量為(348.35±22.02)g，經(jīng)過1年生長，至2017年9月，采集的樣本體長為(235.00±7.83)mm, 體質量為(179.00±19.12)g；2016年8月—2017年6月，采集的樣本個體的平均GSI變化范圍為0.18%～0.55%，但從2017年7月開始，GSI上升至2.12%，8月時GSI達到最大，為4.04%，2017年9月GSI開始減少，僅為0.20%，且2017年7—8月黑邊石斑魚的性腺質量和性腺指數(shù)均顯著高于其他時間段(P<0.05)。

表1 2016年8月—2017年9月黑邊石斑魚采樣時間、數(shù)量及其生長指數(shù)的變化(n=140)Tab.1 Sampling time, number, and changes in growth index of blacktip grouper from August 2016 to September 2017(n=140)

2.3 卵巢中卵母細胞的發(fā)育階段

黑邊石斑魚卵巢中卵母細胞的發(fā)育階段及其頻率變化如圖2和圖3所示。從圖3可見：在2016年8—9月，卵巢中卵母細胞大部分為核仁外周期的卵母細胞，為發(fā)育的Pn階段(圖2-Pn)，少部分為三級卵黃球期，為發(fā)育的Ty階段(圖2-Ty)；2016年11月—2017年3月也均為Pn階段；從2017年4月開始，卵巢中出現(xiàn)了卵黃囊泡期的卵母細胞，為發(fā)育的Yv階段(圖2-Yv)。從2017年6月開始，次級卵黃球期的卵母細胞也被檢測到，為發(fā)育的Sy階段(圖2-Sy)；在2017年7—8月，三級卵黃球期(圖2-Ty)、成熟期(圖2-Ri)和退化期(圖2-De)的卵母細胞占了大半甚至全部，此階段為石斑魚繁殖產(chǎn)卵期；到2017年9月，卵母細胞再次發(fā)育為Pn階段(圖2-Pn)。

2.4 血清中性激素濃度的變化

從表2可見：2017年8月其血清中E2的濃度顯著高于2016年8月和11月，以及2017年1、4、5月(P<0.05)，E2濃度在2017年6—7月有增加的趨勢，但較2017年8月無顯著性變化(P>0.05)；黑邊石斑魚血清中DHP濃度雖然在試驗期間無顯著性差異(P>0.05)，但在2017年8月有明顯增加的趨勢；黑邊石斑魚血清中20β-S濃度在2017年1月顯著高于2016年9月和11月及2017年5—9月(P<0.05)。

表2 2016年8月—2017年9月黑邊石斑魚血清中性激素濃度的變化Tab.2 Changes in the concentration of serum sex hormones in the blacktip grouper from August 2016 to September 2017 ng/mL

3 討論

3.1 水溫對黑邊石斑魚卵巢發(fā)育和產(chǎn)卵的影響

本研究中，黑邊石斑魚卵母細胞發(fā)育成熟過程中卵黃囊泡出現(xiàn)在4月，卵黃形成期出現(xiàn)在6月，產(chǎn)卵期為7—8月，部分個體推測至9月產(chǎn)卵。有研究顯示，七帶石斑魚E.septemfasciatus卵黃囊泡及卵黃球形成期在3月開始出現(xiàn)，5月迎來產(chǎn)卵期[22]。此外，在之前作者對褐石斑魚E.bruneus的研究中表明，卵母細胞的卵黃球期出現(xiàn)在2月，卵黃球形成期出現(xiàn)在4月，在5—6月確認產(chǎn)卵[23]。而蜂巢石斑魚E.merra的產(chǎn)卵期為5—7月[21,24]。這些研究結果表明，在不同種類的石斑魚中，導致其性腺發(fā)育成熟的開始時期和產(chǎn)卵期的差異主要與其生活海域的水溫相關。以卵黃開始形成期的水溫為例，七帶石斑魚、褐石斑魚、黑邊石斑魚、蜂巢石斑魚溫度分別為15、16、20、22 ℃。此外，各石斑魚在產(chǎn)卵時期的水溫也有所不同：七帶石斑魚為20～23 ℃，褐石斑魚為19～22 ℃，黑邊石斑魚為25～27 ℃，蜂巢石斑魚為25～28 ℃。這些數(shù)據(jù)表明，黑邊石斑魚和蜂巢石斑魚成熟和產(chǎn)卵所需要的水溫比其他石斑魚高。

較高水溫雖然能促進卵巢發(fā)育成熟，但過高水溫則可能對某些石斑魚的產(chǎn)卵產(chǎn)生抑制作用。在對赤點石斑魚E.akaara[25]和豹紋鰓棘鱸Plectropomusleopardus[26]的研究表明，若產(chǎn)卵時水溫為28 ℃左右會抑制成熟。本研究中，在2017年7—8月水溫為25～27 ℃，所捕獲的黑邊石斑魚卵巢處于成熟狀態(tài)；而在2016年8—9月和2017年9月所捕獲的黑邊石斑魚卵巢處于未成熟或產(chǎn)卵后的狀態(tài)，此時的水溫為28～29 ℃，該結果證實28 ℃以上的水溫可能會抑制其卵巢發(fā)育成熟。

3.2 月周期變化對卵巢發(fā)育和產(chǎn)卵的影響

在對多數(shù)石斑魚如蜂巢石斑魚[27]、褐點石斑魚E.fuscoguttatus[28]和霜點石斑魚E.rivulatus[29]的研究顯示，月周期變化對其發(fā)育成熟和產(chǎn)卵均有重要影響，主要表現(xiàn)為潮汐滿月時大部分石斑魚會產(chǎn)生洄游產(chǎn)卵現(xiàn)象。Kawabe等[30]研究表明，黑邊石斑魚潮汐滿月后其產(chǎn)卵達到峰值。但本研究中黑邊石斑魚1個月中卻能連續(xù)多次產(chǎn)卵，表明其具有不固定的月周期產(chǎn)卵模式。此外，在日本高知縣水產(chǎn)試驗場對黑邊石斑魚的調查表明，其產(chǎn)卵時期在新月前后[31]。這些不同的研究結果表明，黑邊石斑魚的產(chǎn)卵周期并不具有統(tǒng)一性，可能會根據(jù)棲息地選擇不同的產(chǎn)卵模式。

3.3 黑邊石斑魚血清中性激素含量的周年變化

黑邊石斑魚血清中E2濃度從2017年6月開始呈現(xiàn)增加的趨勢，7月進一步增加，8月達到峰值；其E2濃度的周年變化與性腺指數(shù)GSI的周年變化趨勢一致，這表明E2能夠誘導合成卵黃蛋白的前驅物質——卵黃磷蛋白(VTG)，并被卵母細胞所吸收，從而促進卵巢發(fā)育成熟。此外，其結果也與組織學的頻率變化一致，表明黑邊石斑魚的產(chǎn)卵期為2017年7—8月。在對斜帶石斑魚E.coioides的研究表明，E2和睪酮(Testosterone, T)濃度在繁殖季節(jié)6月顯著增加，且GSI迅速提高，表明E2能夠誘導肝細胞中卵黃磷蛋白的合成，促進卵巢發(fā)育成熟[32]，此結論與本試驗中對黑邊石斑魚的研究結果一致。

本研究中，黑邊石斑魚血清中DHP濃度在2016年8—9月及2017年1、4、7、8月雖然有增加的趨勢，但無顯著性差異。而血清中20β-S濃度在2016年1月呈現(xiàn)峰值，之后逐漸降低。DHP和20β-S是促進魚類卵母細胞發(fā)育成熟的誘導激素(MIH)。在大馬哈魚Oncorhynchusrhodurus中，DHP作為成熟誘導激素而存在[33]。本研究中，DHP濃度在黑邊石斑魚產(chǎn)卵期間有增加的趨勢，而20β-S濃度從非產(chǎn)卵期到產(chǎn)卵期卻呈現(xiàn)減少的趨勢，這表明在黑邊石斑魚性腺發(fā)育成熟的過程中，DHP較20β-S更具有誘導成熟的功能。此外，DHP濃度在2017年1月和4月的非產(chǎn)卵期也呈現(xiàn)高值。在遠東哲羅魚Huchoperryi中，DHP對卵原細胞的初期增殖有重要影響[34]。本研究結果也表明，在非產(chǎn)卵期間，DHP的高濃度可能對黑邊石斑魚初期卵母細胞的增殖有重要作用。