林善婷，胡曉，李來好*，楊賢慶，吳燕燕，陳勝軍，趙永強，李春生，潘創(chuàng)

(1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300； 2.南京農(nóng)業(yè)大學 無錫漁業(yè)學院，江蘇 無錫 214081)

中國水產(chǎn)資源豐富，水產(chǎn)品的生產(chǎn)量及消費量均位于世界前列，然而中國水產(chǎn)品精深加工水平較低，大量的水產(chǎn)加工副產(chǎn)物(如頭、骨、皮、鱗、內(nèi)臟、碎肉等),以及低值魚、蝦、貝、藻等水產(chǎn)資源常被廢棄，不僅浪費大量優(yōu)質(zhì)蛋白資源，而且污染環(huán)境。生物活性肽是指蛋白原料經(jīng)酶解、分離、純化后制備出的具有特定生理功能的肽類物質(zhì)[1]。目前，越來越多的水產(chǎn)蛋白源生物活性肽被分離鑒定，如從海鞘Halocynthiaroretzi[2]、草魚Ctenopharyngodonidella[3]、鳳尾魚Coiliamystus[4]、微藻Chlorellavulgaris[5]、黑鯊魚Carcharhinusfalciformis皮[6]、牡蠣Saccostreacucullata[7-8]等蛋白水解物中分離出抗氧化肽，從大西洋鯖Scomberscombrus[9]、鳀Engraulisjaponicus[10]、海藻Saccharinalongicruris[11]、雪蟹Chionoecetesopilio[12]等蛋白水解物中分離出抗菌肽，從大西洋鮭Salmosalar明膠[13]、大馬哈魚Oncorhynchusketa皮[14]、比目魚Paralichthysolivaceus肌肉[15]等蛋白水解物中分離出降血壓肽，從菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum[16]、牡蠣Saccostreacucullata[17]、螺旋藻Spirulinaplatensis[18]等蛋白水解物中分離出抗癌/抗腫瘤肽。此外，以阿拉斯加鱈Eleginusgracilis骨骼[19]、波紋巴非蛤Paphiaundulata[20]、貽貝Mytiluscoruscus[21]等蛋白水解物制備的免疫調(diào)節(jié)肽，以及以鱈魚皮[22]、南極磷蝦Euphausiasuperba[23]、牡蠣[24]、鳀Engraulisjaponicus[25]、羅非魚皮[26]等蛋白水解物制備礦物質(zhì)離子結(jié)合活性肽等。以水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物及低值的魚、蝦、貝、藻等為蛋白原料制備水產(chǎn)蛋白源生物活性肽，既可減少環(huán)境污染，提高水產(chǎn)品高值化利用率，還可提高水產(chǎn)加工企業(yè)利潤率和水產(chǎn)資源的綜合利用率，具有重大社會經(jīng)濟效益。本研究中，通過對水產(chǎn)蛋白源生物活性肽的酶解制備、純化鑒定、功能分類、結(jié)構(gòu)特征及作用機制等進行綜述，以期為水產(chǎn)蛋白源生物活性肽的理論研究和產(chǎn)業(yè)化高值利用提供科學參考。

1 水產(chǎn)蛋白源生物活性肽的制備、純化及鑒定

1.1 酶解法制備生物活性肽

目前，酶解法是較為常用且安全有效獲得生物活性肽的方法，酶解反應(yīng)過程易控，條件溫和，無有害物質(zhì)產(chǎn)生，能制備特定的易于分離的活性肽[27]。由于蛋白質(zhì)的水解程度會影響其所產(chǎn)生肽段的生物利用度和生物活性，因此，選擇最適的水解條件(如溫度、pH、酶制劑和酶與底物比例等)至關(guān)重要。目前，用于制備生物活性肽的蛋白酶主要有胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶(protamex)和風味蛋白酶等。根據(jù)已有的研究發(fā)現(xiàn)，制備抗氧化肽時，大多利用胃蛋白酶進行酶解；制備抗菌肽時，主要利用protamex酶；制備降血壓肽及抗腫瘤肽時，常用胃蛋白酶和胰蛋白酶；制備礦物質(zhì)結(jié)合肽時，常用胰蛋白酶(表1)。同一種原料，經(jīng)不同的蛋白酶酶解后，其酶解產(chǎn)物會表現(xiàn)出不同的活性，如Alemán等[28]分別利用7種蛋白酶水解魷魚明膠蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Alcalase酶(來源于地衣芽孢桿菌的堿性絲氨酸型內(nèi)切蛋白酶)水解產(chǎn)物是最有效的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑(IC50為0.34 mg/mL)；而Esperase酶(一種由芽孢桿菌Bacillussp.分泌的絲氨酸型堿性蛋白酶)水解產(chǎn)物對人乳腺癌(IC50為0.13 mg/mL)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤(IC50為0.10 mg/mL)的細胞毒性作用最強；胰蛋白酶、Savinase酶(賽威蛋白酶，一種由芽孢桿菌Bacillussp.分泌的絲氨酸型蛋白酶)、Esperase酶和Alcalase酶水解產(chǎn)物的自由基清除能力最高。此外，除了使用一種酶制備活性多肽外，兩個或多個酶組合也成為制備特定多肽的熱門方法。最常見的是模擬人體胃腸消化，先后利用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶促分解蛋白質(zhì)，從而獲得目的多肽。Wang等[18]先后利用3種胃腸道內(nèi)肽酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)對螺旋藻進行水解，其水解產(chǎn)物對3種癌細胞(人乳腺癌細胞MCF-7、人肝癌細胞HepG-2和人胃癌細胞SGC-7901)均表現(xiàn)出抗增殖活性。除此之外，Wang等[4]利用堿性蛋白酶(pH 8.0，55 ℃，2 h)與中性蛋白酶(pH 8.0，55 ℃，3 h)雙酶組合水解鳳尾魚魚粉，獲得抗氧化寡肽。

表1 水產(chǎn)蛋白源生物活性肽Tab.1 Bioactive peptides derived from fishery proteins

綜上所述，不同的蛋白酶具有不同的酶切位點，其剪切蛋白后可產(chǎn)生不同氨基酸序列的肽段，從而具有不同的生物活性。因此，可根據(jù)不同的原料、不同的制備目的，選擇其最適合的酶或酶組合來制備具有特定活性的目標肽。

1.2 生物活性肽的純化及鑒定

蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解后獲得的酶解產(chǎn)物中包含許多不同分子量大小的肽段，經(jīng)過逐步的分離純化后可獲得生物活性較高的目標肽段。通常使用超濾(ultrafiltration，UF)對酶解產(chǎn)物中不同分子量大小的組分進行初步的分離，利用離子交換色譜(ion-exchange chromatography，IEC)或凝膠色譜(gel filtration chromatography，GFC)對超濾后顯示出最高活性的組分進行二次分離，最后使用反相高效液相色譜(reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)對活性最高的組分進行鑒定前的純化。此外，在制備礦物質(zhì)離子結(jié)合活性肽時還需經(jīng)過固定化金屬親和層析色譜(immobilized metal affinity chromatography，IMAC)，進而獲得具有特定離子結(jié)合活性的肽段。純化出目標肽段后需對其進行氨基酸序列的鑒定及肽鏈結(jié)構(gòu)的表征，以便于日后對其進行化學合成以實現(xiàn)目標肽產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化。研究時通常利用質(zhì)譜法(mass Spectrometry，MS)對未知肽鏈進行氨基酸序列的鑒定，利用核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)、紫外光譜(ultraviolet-visible spectroscopy，UV-vis)、傅立葉紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)等對肽鏈進行結(jié)構(gòu)分析。在分離目標活性多肽及鑒定肽鏈的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特征時，需將上述多個方法聯(lián)合使用。例如，有研究利用GFC、RP-HPLC和Q-TOF LC-MS/MS(液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)分別從海鞘[2]、牡蠣[7]、鰩Rajaporosa軟骨[29]和草魚皮[3]蛋白水解物中分離鑒定出抗氧化肽。利用UF、IEC、GFC、RP-HPLC和Milligen 6600蛋白質(zhì)測序儀分別從菲律賓蛤仔[16]和貽貝[21]蛋白水解物中分離鑒定出抗癌肽和免疫調(diào)節(jié)肽。利用羥基磷灰石色譜(hydroxyapatite chromatography，HAC)、IMAC、GFC、RP-HPLC及LC-ESI-MS/MS(liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry，液相色譜電離串聯(lián)質(zhì)譜)分別從南極磷蝦[23]、牡蠣[24]、阿拉斯加鱈魚皮[30]、鳀肌肉[25]等蛋白水解物中分離鑒定出鈣、鋅、鐵結(jié)合活性肽。

2 水產(chǎn)蛋白源生物活性肽的功能分類

2.1 抗氧化肽

生物分子的氧化是一種自由基介導(dǎo)的氧化反應(yīng)，在需氧生物的氧代謝過程中不可避免地形成有害自由基，如超氧陰離子和羥基與身體中的其他基團或物質(zhì)迅速反應(yīng)，導(dǎo)致細胞或組織損傷，進而造成疾病發(fā)生[2]。目前，有許多研究表明，蛋白多肽是潛在且優(yōu)良的食品抗氧化添加劑。從海鞘(Leu-Glu-Trp，相對分子質(zhì)量為446.23；Met-Thr-Thr-Leu，相對分子質(zhì)量為464.18；Tyr-Tyr-Pro-Tyr-Gln-Leu，相對分子質(zhì)量為845.41)[2]、牡蠣(Pro-Val-Met-Gly-Asp，相對分子質(zhì)量為518；Gln-His-Gly-Val，相對分子質(zhì)量為440)[7]、鳳尾魚(Thr-Pro-Ser-Ala-Gly-Lys，相對分子質(zhì)量為559)[4]、草魚皮(Pro-Tyr-Ser-Phe-Lys，相對分子質(zhì)量為640.74；Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Leu，相對分子質(zhì)量為618.89；Val-Gly-Gly-Arg-Pro，相對分子質(zhì)量為484.56)[3]、微藻(Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe，相對分子質(zhì)量為1309)[5]、黑鯊魚皮(Pro-Gly-Gly-Thr-Met，相對分子質(zhì)量為461)[6]、中華圓田螺肉Cipangopaludinacahayensis(相對分子質(zhì)量<1000)[31]等蛋白水解物中鑒定出的抗氧化肽，其相對分子質(zhì)量主要在400～1500。從已鑒定出的抗氧化肽氨基酸序列中總結(jié)發(fā)現(xiàn)，肽鏈富含一個或多個Leu、Pro、Val、Gly等疏水性氨基酸及Met、Trp、Phe等芳香族氨基酸。其DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)清除IC50值為1.29～10.00 mmol/L，羥自由基清除IC50值為2.606～6.063 mmol/L，Trolox當量等效IC50值為0.0077～0.9600 mmol/L，并具有Fe2+結(jié)合能力及亞油酸乳液體系模擬的脂質(zhì)過氧化抑制能力。此外，用于測定抗氧化的指標較多，來源不同的抗氧化肽對同一指標的抗氧化能力不同，如Kim等[2]從海鞘蛋白水解物中鑒定出Leu-Glu-Trp、Met-Thr-Thr-Leu和Tyr-Tyr-Pro-Tyr-Gln-Leu 3種抗氧化肽，其中Leu-Glu-Trp對DPPH自由基的清除活性最高，Leu-Glu-Trp和Tyr-Tyr-Pro-Tyr-Gln-Leu對氧自由基清除能力高于谷胱甘肽。

因此，為了比較不同原料中抗氧化肽的總抗氧化能力，應(yīng)制定統(tǒng)一的標準，以衡量不同原料抗氧化肽的抗氧化能力，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)抗氧化肽制劑提供依據(jù)。天然水產(chǎn)蛋白源抗氧化肽因其具有安全性和有效性，逐漸被視為人工合成抗氧化劑的替代品，可用于食品、制藥和化妝品等行業(yè)。

2.2 抗菌肽

抗菌肽是許多生物先天免疫系統(tǒng)的主要成分，在保護宿主物種免受微生物入侵方面起重要作用。目前，由于細菌對抗菌藥物的耐藥性越來越高，尋求新型廣譜性的抗菌物質(zhì)已成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，鳀(Gly-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Thr-Ala-Leu-Lys， 相對分子質(zhì)量為1104.66)[10]、大西洋鯖(Ser-Ile-Phe-Ile-Gln-Arg-Phe-Thr-Thr，相對分子質(zhì)量為1094.7；Arg-Lys-Ser-Gly-Asp-Pro-Leu-Gly-Arg，相對分子質(zhì)量為1042.5)；Ala-lys-Pro-Gly-Asp-Gly-Ala-Gly-Ser-Gly-Pro-Arg，相對分子質(zhì)量為1111.6；Gly-Leu-Pro-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys，相對分子質(zhì)量為1102.5)[9]、雪蟹酶解物[12]、海藻酶解物[11]、草魚魚鱗酶解物[32]等水產(chǎn)蛋白抗菌肽對金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、枯草桿菌Bacillussubtilis、肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae、大腸桿菌Escherichiacoli、李斯特菌Listeriainnocua、副溶血性弧菌Vibrioparahemolyticus表現(xiàn)出抑制生長的作用。鳀抗菌肽對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抗菌能力最強，其最小抑菌濃度為16 μg/mL，對大腸桿菌和肺炎鏈球菌的最小抑菌濃度分別為32、64 μg/mL[10]。當肽濃度為2×105μg/mL時，大西洋鯖抗菌肽對李斯特菌和大腸桿菌表現(xiàn)出完全抑制[9]。草魚魚鱗酶解物對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、黑曲霉、毛霉、根霉菌、酵母菌的最小抑菌濃度范圍為16～64 μg/mL，表現(xiàn)出了廣譜的抑菌活性[32]。

綜上所述，通過分析抗菌肽氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，肽鏈中主要由Gly、Pro、Ala、Ile等疏水性氨基酸及Thr、Lys等氨基酸組成，其相對分子質(zhì)量一般大于1000。由于水產(chǎn)蛋白源抗菌肽具有廣譜且有效的抗菌活性，有望成為治療耐藥性傳染病的優(yōu)良替代品。

2.3 降血壓肽

高血壓是世界范圍內(nèi)的流行病，影響著全球15%～20%的成年人。目前，治療高血壓相關(guān)疾病(如心力衰竭、中風、心肌梗死、糖尿病、腎病等)最有效的治療方法是抑制腎素或血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)的活性。然而，目前治療高血壓的藥物(卡托普利、賴諾普利等)雖然在控制高血壓方面有效，但也會產(chǎn)生副作用[14]。天然來源的水產(chǎn)蛋白降血壓肽由于其安全有效的優(yōu)點，已逐漸成為治療高血壓研究中的熱點。近年的研究發(fā)現(xiàn)，從大馬哈魚皮(Gly-Leu-Pro-Leu-Asn-Leu-Pro，相對分子質(zhì)量為770)[14]、大西洋鮭明膠(Gly-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Val；Gly-Pro-Val-Ala；Gly-Phe)[13]、比目魚肌肉(Met-Glu-Val-Phe-Val-Pro，相對分子質(zhì)量為721.2；Val-Ser-Gln-Leu-Thr-Arg，相對分子質(zhì)量為703.4)[15]、扇貝(Val-Trp，相對分子質(zhì)量為304.17)[33]、牡蠣酶解物(相對分子質(zhì)量<3000)[34]等蛋白水解產(chǎn)物中可分離出降血壓肽，其中源自大馬哈魚皮的降血壓肽對ACE的抑制活性最高，其IC50為18.7 μmol/L，顯著低于比目魚肌肉降血壓肽(IC50分別為79、105 μmol/L)、扇貝降血壓肽(IC50為86.9 μmol/L)及大西洋鮭明膠降血壓肽(IC50分別為673.16、445.61、178.14 μmol/L)。此外，Lineweaver-Burk圖表明，水產(chǎn)蛋白源降血壓肽可分別作為ACE的競爭性和非競爭性抑制劑，對自發(fā)性高血壓大鼠使用這些肽后，其心率、收縮壓、舒張壓和平均動脈血壓均顯著降低[13-15]。目前已商業(yè)化生產(chǎn)的狐鰹Sardaorientalis降血壓肽制劑(Leu-Lys-Pro-Asn-Met)，自發(fā)性高血壓大鼠口服5周后，血壓降低了(11.7±1.3)mmHg，且在臨床研究中似乎無任何副作用[35]。

根據(jù)上述降血壓肽的氨基酸序列總結(jié)得出，降血壓肽中富含Gly、Pro、Ala、Val等氨基酸，肽鏈相對分子質(zhì)量小于1000。許多研究證明，水產(chǎn)蛋白源降血壓肽具有顯著的腎素或ACE抑制活性，可單獨使用或作為藥物的輔助劑用于降低血壓和改善與藥物相關(guān)的副作用。

2.4 抗癌肽及免疫調(diào)節(jié)肽

細胞凋亡作為程序性細胞死亡的一種形式是響應(yīng)癌癥療法的主要機制之一，由于調(diào)節(jié)凋亡途徑和選擇性誘導(dǎo)細胞凋亡通常不會引起炎癥或免疫反應(yīng)，細胞凋亡成為癌癥治療的優(yōu)選方式[36]。研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)蛋白肽，如菲律賓蛤仔(Ala-Val-Leu-Val-Asp-Lys-Gln-Cys-Pro-Asp，相對分子質(zhì)量為1950)[16]、牡蠣(Leu-Ala-Asn-Ala-Lys，相對分子質(zhì)量為515.29)[17]、螺旋藻(His-Val-Leu-Ser-Arg-Ala-Pro-Arg，相對分子質(zhì)量為935.1)[18]、魷魚明膠Esperase酶解物(相對分子質(zhì)量為500～1400)[28]、金錢龜Cuoratrifasciata(Ser-Ser-Pro-Gly-Pro-Pro-Val-His，相對分子質(zhì)量為777.39)[37]等抗癌肽，對HepG-2(人肝癌細胞)、 MCF-7/MDA-MB-231(人乳腺癌細胞)、SGC-7901(人胃腺癌細胞)、A549(人肺癌細胞)、HT-29(人結(jié)腸癌細胞)、U87(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞)、PC-3(前列腺癌細胞)等癌細胞表現(xiàn)出有效的抗增殖效果，其IC50值為0.10～1.58 mg/mL。

免疫系統(tǒng)在預(yù)防和控制疾病方面至關(guān)重要，許多合成型藥物已被證明可用于調(diào)節(jié)人體免疫功能，然而，大多數(shù)通過微生物或化學方法合成的免疫調(diào)節(jié)藥物具有毒性或副作用，這限制了其在預(yù)防和治療慢性疾病中的用途[38]。源于波紋巴非蛤(Pro-His-Thr-Cys，相對分子質(zhì)量為457；Val-Gly-Try-Thr，相對分子質(zhì)量為439；Glu-Phe，相對分子質(zhì)量為295；Leu-Phe，相對分子質(zhì)量為279；Glu-Gly-Ala-Lys，相對分子質(zhì)量為404；Trp-Leu，相對分子質(zhì)量為318)[20]、阿拉斯加鱈(Asn-Gly-Met-Thr-Tyr，相對分子質(zhì)量為584；Asn-Gly-Leu-Ala-Pro，相對分子質(zhì)量為470；Trp-Thr，相對分子質(zhì)量為305；Pro-Thr-Gly-Ala-Asp-Tyr，相對分子質(zhì)量為622)[19, 39]、貽貝(Gly-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Gln-Phe-Phe-Leu)[21]、青蛤(Arg-Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Val-Glu-Gly-Arg-Tyr-Leu-Val，相對分子質(zhì)量為1750.81)[38]、鮭(Pro-Ala-Tyr，相對分子質(zhì)量為349.15)[40]的水產(chǎn)蛋白免疫調(diào)節(jié)肽，具有多個免疫調(diào)節(jié)靶點，通過刺激脾淋巴細胞、巨噬細胞等免疫細胞的增殖，促進細胞因子(白細胞介素IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、環(huán)氧化酶COX-2、腫瘤壞死因子TNF-α)的表達，激活NF-κB(核因子κB)和MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)信號通路來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。

綜上可知，抗癌肽主要由4～15個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為500～2000，且肽鏈中富含Leu、Pro、Ala、Lys、Arg等氨基酸。免疫調(diào)節(jié)肽中富含一個或多個Pro、Leu、Phe、Met等疏水性氨基酸，且大多數(shù)免疫調(diào)節(jié)肽的相對分子質(zhì)量小于1000。

2.5 礦物質(zhì)結(jié)合活性肽

礦物質(zhì)是構(gòu)成人體組織和維持正常生理功能所必需的7大營養(yǎng)素之一，膳食礦物質(zhì)的缺乏會導(dǎo)致許多疾病。礦物質(zhì)結(jié)合活性肽是指具有結(jié)合礦物質(zhì)離子活性的肽類物質(zhì)，其與礦物質(zhì)離子結(jié)合后，可促進或增強礦物質(zhì)離子在腸道中的生物利用度。從南極磷蝦[23]、太平洋鱈魚骨[41]的酶解產(chǎn)物中可分別純化鑒定出鈣離子結(jié)合活性肽Val-Leu-Gly-Tyr-Ile-Gln-Ile-Arg(相對分子質(zhì)量為960.58)、Lys-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-Lys(相對分子質(zhì)量為954.5)。從牡蠣[24]、阿拉斯加鱈魚皮[22]蛋白水解物中可分別純化鑒定出鋅離子結(jié)合活性肽His-Leu-Arg-Gln-Glu-Glu-Lys-Glu-Glu-Val-Thr-Val-Gly- Ser-Leu-Lys(相對分子質(zhì)量為1882.0)、Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly(相對分子質(zhì)量為842)。從阿拉斯加鱈魚皮[30]、鳀魚肌肉[25]蛋白水解物中可分別純化鑒定出鐵離子結(jié)合活性肽Ser-Cys-His(相對分子質(zhì)量為305)、Glu-Leu-Glu-Gly-Glu-Val-Asp-Ala-Glu-Gln-Lys(相對分子質(zhì)量為7593.90)、Glu-Gln-Asp-Thr-Ser-Ala- His-Leu-Glu-Arg-Met-Lys(相對分子質(zhì)量為8105.95)。

Caco-2細胞試驗表明，從阿拉斯加鱈魚皮[42]、鳀[43]、海參Stichopusjaponicus卵子[44]等水產(chǎn)蛋白中制備分離的礦物質(zhì)結(jié)合活性肽在Caco-2細胞模型中均顯示出可增加鈣、鋅、鐵等礦物離子的攝取，促進礦物質(zhì)離子的轉(zhuǎn)運，進而提高礦物質(zhì)離子的吸收率。此外，動物試驗表明，從羅非魚鱗片蛋白[45]中制備的鈣離子結(jié)合活性肽可顯著增加大鼠幼崽股骨中骨礦物質(zhì)的密度、股骨鈣含量及血清鈣值，增強小腸對鈣的吸收。鴨蛋蛋白肽-Fe2+結(jié)合物(DPs-Fe2+)[46]及三肽鐵(Arg-Glu-Glu-Fe2+)[47]均可使缺鐵性貧血大鼠的體質(zhì)量、器官系數(shù)和血液學參數(shù)恢復(fù)到正常水平(P<0.05)，并調(diào)節(jié)細胞頂膜的Fe2+轉(zhuǎn)運蛋白(divalent metal transporter 1，DMT1)、細胞基底膜的鐵蛋白轉(zhuǎn)運蛋白(ferroportin 1，F(xiàn)PN1)及鐵離子調(diào)節(jié)蛋白(Hepcidin)表達，這表明DPs-Fe2+和Arg-Glu-Glu-Fe2+均可作為潛在的Fe2+補充劑。鱈骨骼蛋白肽-Fe2+結(jié)合物[48]可使缺鐵性貧血大鼠的體質(zhì)量、身高和血液參數(shù)恢復(fù)到正常水平，與FeSO4相比，鱈骨骼蛋白肽-Fe2+結(jié)合物顯著增加了缺鐵性貧血大鼠體質(zhì)量，并有效改善血紅蛋白、血清鐵離子和轉(zhuǎn)鐵蛋白水平，還可恢復(fù)鐵離子與轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)合能力。

續(xù)表1 水產(chǎn)蛋白源生物活性肽Cont.Tab.1 Bioactive peptides derived from fishery proteins

分析鈣、鋅、鐵離子結(jié)合活性肽氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，其肽鏈中基本含有Gly、Pro、His等氨基酸，且低分子量(相對分子質(zhì)量<1000)和高分子量(相對分子質(zhì)量>1000)肽均可結(jié)合礦物質(zhì)離子。

3 生物活性肽的結(jié)構(gòu)特征

3.1 分子量

不同的原料根據(jù)不同的制備目的，會利用不同的酶進行水解，由于水解度不同，會產(chǎn)生不同分子量大小的肽段。研究表明，大多數(shù)抗氧化肽含有2～20個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為400～1500。源自草魚皮蛋白水解物的3種抗氧化肽，其相對分子質(zhì)量分別為640.74、618.89和484.56[3]。從鰩軟骨蛋白水解物中分離鑒定的3種抗氧化肽，其相對分子質(zhì)量分別為726.90、578.58和583.69[29]。對海鞘[2]、牡蠣[7]、鳳尾魚魚粉[4]、草魚皮[3]、鰹Katsuwonuspelamis肌肉[51]、鰩軟骨[29]等蛋白水解物的抗氧化活性研究均表明，小分子量組分的抗氧化活性高于大分子量的組分，其原因可能是較小分子量的肽與自由基的反應(yīng)更充分更完全。與此相似，在抗癌活性中，小分子量的肽顯示出更高的抗癌活性，這是因為小分子量的肽比大分子量的肽具有更高的分子遷移率和擴散性，可改善與癌細胞的相互作用，增強抗癌能力[52]。而大多數(shù)鑒定出的抗菌肽，其相對分子質(zhì)量基本在1000以上。Beaulieu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大分子量的海藻水解產(chǎn)物(相對分子質(zhì)量>10 000)對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌活性。此外，在鰱蛋白水解物中，由其最大分子量的組分而制備的肽-鋅結(jié)合物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有最高的抗菌活性[53]。在帶魚蛋白水解物中，由其分子量最大的多肽制備的肽-Fe2+復(fù)合物顯示出最高的抗菌活性[54]。在礦物質(zhì)結(jié)合活性肽中，小分子量(<1000)和大分子量(>1000)的肽均可結(jié)合礦物質(zhì)離子。從阿拉斯加鱈魚皮水解物中分離鑒定出的鐵離子結(jié)合活性肽，其相對分子質(zhì)量為345[30]，而從鳀魚肌肉蛋白水解物中分離鑒定出的鐵離子結(jié)合活性肽的相對分子質(zhì)量分別為7594、8106[25]。

綜上所述，不同原料、不同制備條件獲得的同一活性肽具有相似的分子量，且抗氧化肽、降血壓肽、抗癌肽和免疫調(diào)節(jié)肽的分子量一般較小，而抗菌肽主要是大分子量肽，在礦物質(zhì)結(jié)合活性肽中既有小分子量(<1000)肽，也有大分子量(>1000)肽。

3.2 氨基酸組成

多肽鏈由兩個及兩個以上的氨基酸組成，其生物活性與其氨基酸的組成及含量密切相關(guān)。氨基酸的組成是抗氧化活性的關(guān)鍵因子，研究表明，大多數(shù)抗氧化肽、降血壓肽、抗癌/抗腫瘤肽和免疫調(diào)節(jié)肽富含Pro、Trp、Phe、Leu、Gly、Val等疏水性氨基酸及Tyr、Phe、Trp等芳香族氨基酸；抗菌肽中富含疏水性氨基酸Gly、Ala、Pro及酸性氨基酸Glu；礦物質(zhì)結(jié)合肽中富含Gly、His、Glu、Ala、Pro等氨基酸。如從草魚皮蛋白酶解物中純化的抗氧化肽，Trp、Tyr和Phe對自由基清除有較大貢獻[3]，源自鳳尾魚魚粉[4]的抗氧化肽，其肽序列中的疏水性氨基酸殘基(如Pro、Leu、Ala、Gly)通過提供電子或供體電子來穩(wěn)定活性自由基。芳香族氨基酸殘基可作為氫供體，并抑制自由基介導(dǎo)的過氧化鏈反應(yīng)，含有更多苯丙氨酸的肽鏈顯示出較強的抗氧化活性[51]。肽的支鏈氨基酸(Val、Leu和Ile)和非極性脂肪族氨基酸(Leu和Ala)對肽的抗氧化活性也有較大貢獻[55]。酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基的電子致密芳環(huán)有助于與促氧化金屬離子的結(jié)合，增強抗氧化活性[56]。富含甘氨酸殘基的高疏水性肽可結(jié)合富含脂多糖的疏水性細菌膜，進而具有更高的抗菌活性[57]。通過分析源自鰱抗菌肽的氨基酸組分后發(fā)現(xiàn)，含有更多酸性氨基酸(如Glu和Asp)的肽在其復(fù)合物中顯示出更多的鋅結(jié)合含量，且羧基(包括羰基)是肽鏈中鋅離子的主要結(jié)合位點[53]。此外，純化的具有最高抗菌活性的帶魚蛋白肽-Fe2+復(fù)合物富含Glu、Asp和Ala[54]。有研究報道，許多ACE抑制肽含有色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，這些氨基酸羧基末端含有芳香族或疏水性氨基酸，在ACE抑制活性中起重要作用[14]。與此相似，免疫調(diào)節(jié)肽中最常見殘基也是疏水性氨基酸(如Val、Leu、Pro、Phe等)，已有研究證明，疏水性氨基酸、谷氨酰胺、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的一個或多個殘基促進肽的免疫調(diào)節(jié)活性[20]。Jacquot等[58]報道，帶有2～3個正電荷的較長疏水性肽具有更強的刺激小鼠脾細胞增殖的潛力。免疫調(diào)節(jié)肽通過與靶細胞表面上的特異性受體結(jié)合調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[59]。此外，肽鏈中的幾種氨基酸殘基和基團(如羧基，磺基-氫基，負電荷和離子鍵)在多肽鏈發(fā)揮其生物活性中起著重要作用。在礦物質(zhì)結(jié)合活性肽中，其結(jié)合能力與肽鏈中Asp和Glu的羧基及His咪唑的富氮基團有關(guān)[60]。羅非魚蛋白的鈣結(jié)合活性肽Trp-Glu-Trp-Leu-His-Tyr-Trp中Glu的羧基和His的咪唑基團決定鈣離子的結(jié)合[61]。研究發(fā)現(xiàn)：Leu-Ala-Asn中的Asn、肽亞氨基和羰基的羧酸酯基團可以參與鋅的配位[62]；親水性肽的鋅螯合物似乎比疏水性質(zhì)的螯合物具有更高的抗細菌活性，且羧基(包括羰基)是合成肽中鋅離子的主要結(jié)合位點[53]；鐵離子結(jié)合的主要位點對應(yīng)于羧酸鹽基團，且在較小程度上對應(yīng)于肽鍵[63]；磺基-氫基參與肌肉蛋白肽結(jié)合鐵，肽中Cys殘基與鐵的結(jié)合也受到鄰近或相鄰殘基的影響，而組氨酰殘基有助于鐵結(jié)合，促進肌肉組織的鐵吸收[64]。

4 生物活性肽的作用機制

不同的生物活性肽具有不同的分子量、氨基酸組成和空間結(jié)構(gòu)，并通過不同的分子作用機制發(fā)揮其生物活性。

抗氧化肽Phe-Pro-Leu-Pro-Ser-Phe中Leu殘基在自由基清除過程起著至關(guān)重要的作用，當用Ala取代Leu時，該肽的自由基清除能力和細胞保護作用幾乎喪失，且該肽可以增加PI3K(胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶)、Akt(蛋白激酶B)、磷酸化Akt、mTOR(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)、磷酸化mTOR等蛋白表達水平，表明肽Phe-Pro-Leu-Pro-Ser-Phe通過PI3K/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)途徑建立了保護氧化損傷和促進細胞存活的潛在機制[65]。

從鲃蛋白水解物中分離出的抗菌肽在與細菌細胞膜作用過程中，通過增加膜的通透性，釋放細胞內(nèi)的K+，誘導(dǎo)膜損傷機制，進而對李斯特菌顯示出顯著的抗菌活性[66]。章魚小肽(OSP)與Zn2+結(jié)合后形成的OSP-Zn結(jié)合物對大腸桿菌表現(xiàn)出顯著的抗菌能力，OSP-Zn通過破壞細胞膜結(jié)構(gòu)和氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡途徑發(fā)揮抗菌作用[67]。

利用分子對接技術(shù)研究降血壓肽Leu-Pro-Glu-Ser- Val-His-Leu-Asp-Lys(LL-9)、Val-Leu-Ser-Thr-Ser-Phe-Pro-Pro-Lys(VL-9)對AEC抑制作用的分子機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肽氨基酸殘基通過與ACE氨基酸殘基間的氫鍵、疏水力、范德華力及靜電作用與ACE結(jié)合，VL-9通過結(jié)合ACE的S2(His513、His353、Glu281)和S′1(Glu162)活性位點，而LL-9通過結(jié)合AEC的S1(Thr345)和S2(Tyr520)、Lys511、Gln281活性位點，肽VL-9、LL-9通過與ACE活性位點的有效相互作用抑制其活性，進而起到降血壓的作用[68]。

抗癌肽對癌細胞具有高選擇性而優(yōu)先結(jié)合到含有負電荷和高流動性的細胞外膜，改變癌細胞的細胞膜通透性，此外，還可通過線粒體途徑和死亡受體途徑誘導(dǎo)癌細胞的程序性細胞死亡，從而起到抗癌的作用[69]。

免疫調(diào)節(jié)肽中，富含酸性氨基酸且分子量較大的肽鏈可增加細胞免疫因子IFN-γ(γ-干擾素)的分泌，而小分子量肽通過刺激單核細胞分泌TNF-α進而起到免疫調(diào)節(jié)的作用[59]。

礦物質(zhì)結(jié)合活性肽中，鐵離子結(jié)合活性肽結(jié)合鐵離子后可提高鐵離子在腸道中的溶解度，肽-鐵結(jié)合物通過肽轉(zhuǎn)運途徑將鐵離子轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，或肽-鐵結(jié)合物中的鐵離子經(jīng)胞膜上的鐵離子通道進入細胞內(nèi)，進而提高腸道鐵離子的吸收[43]。此外，乳清蛋白濃縮物-鐵(WPC-Fe)結(jié)合物可增加雄性貧血斷奶大鼠血清中的血紅蛋白、鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的水平，促進鐵離子的轉(zhuǎn)運[70]。

綜上所述，不同功能活性的水產(chǎn)蛋白肽通過不同的作用機制發(fā)揮其獨特的生理活性。

5 存在問題及展望

水產(chǎn)蛋白源生物活性肽在腸道消化期間保持可溶且呈電中性，轉(zhuǎn)運入胞內(nèi)消耗能量少，轉(zhuǎn)運速度快，載體不易飽和，生理功效明顯，安全性高，來源豐富(如可利用低值魚、蝦、貝、藻及其加工副產(chǎn)物等為原料)，且其在細胞模型或動物模型中的各類生物活性已得到試驗性證實，因此，具有作為人體膳食補充劑的強大潛力，在功能性食品成分和配料領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。如抗氧化肽可用于化妝品中，降血壓肽可用于替代具有副作用的降血壓藥物，抗癌/抗腫瘤肽可用于癌癥的預(yù)防與治療，促礦物質(zhì)吸收肽可作為礦物質(zhì)缺乏人群的膳食礦物質(zhì)補充劑等。目前，國外已經(jīng)有工業(yè)化生產(chǎn)并銷售的水產(chǎn)活性肽，如利用日本沙丁魚制備的降血壓活性肽飲料等。隨著研究的深入，以水產(chǎn)蛋白為原料制備生物活性肽將具有廣闊的應(yīng)用前景。

盡管以水產(chǎn)蛋白為原料制備功能性食品已有不少研究，但絕大多數(shù)研究僅限于試驗基礎(chǔ)上的成果，在這些功能性產(chǎn)品商品化生產(chǎn)前，還需對其生物利用度、與不同食品基質(zhì)的相容性、長期穩(wěn)定性和體內(nèi)效率等進行更多研究，主要包括以下幾個方面。

(1) 對于抗氧化肽，目前大多只研究其對體外自由基的清除能力，以及亞油酸乳液體系模擬的脂質(zhì)過氧化的抑制能力，而關(guān)于體內(nèi)抗氧化效果的研究報道相對較少，且抗氧化肽在人體內(nèi)的安全性評價亟須進一步研究。

(2) 降血壓肽、抗腫瘤肽、免疫調(diào)節(jié)肽及礦物質(zhì)離子結(jié)合肽應(yīng)重點探究其在胃腸道消化過程中的耐消化性能力及相關(guān)的穩(wěn)態(tài)化保護技術(shù)，同時對肽進入靶細胞的細胞通路/途徑，以及肽在細胞中發(fā)揮生理作用的機制等方面開展研究。

(3) 探明目標肽劑量與生理效應(yīng)間的關(guān)系，需開展更多相關(guān)的營養(yǎng)和代謝組學研究。

(4) 活性肽產(chǎn)品在商業(yè)化之前需評估肽產(chǎn)品的臨床安全性，研究不同加工條件及食品輔料對目標肽結(jié)構(gòu)和功能的影響，從而保障其生物活性。